第四章 反相微膠團(tuán)萃取技術(shù)

第四章反相微膠團(tuán)萃取技術(shù)第1頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三反膠束的優(yōu)點(diǎn)極性“水核”具有較強(qiáng)的溶解能力。生物大分子由于具有較強(qiáng)的極性，可溶解于極性水核中，防止與外界有機(jī)溶劑接觸，減少變性作用。由于“水核”的尺度效應(yīng)，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，增加其結(jié)構(gòu)的剛性，提高其反應(yīng)性能。第2頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

反膠束萃取優(yōu)點(diǎn)：具有成本低、溶劑可反復(fù)使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的優(yōu)點(diǎn)。此外，反膠束萃取還有可能解決外源蛋白的降解，即蛋白質(zhì)(胞內(nèi)酶)在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問(wèn)題，而且由于構(gòu)成反膠束的表面活性劑往往具有溶解細(xì)胞的能力，因此可用于直接從整細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)和酶。第3頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、反膠束萃取原理和制備1基本原理表面活性劑溶于水中，當(dāng)其濃度超過(guò)臨界膠束濃度(CMC)時(shí)，便形成聚集體,稱(chēng)為正常膠束；表面活性劑溶于有機(jī)溶劑，當(dāng)濃度大于臨界膠團(tuán)濃度時(shí)，會(huì)在有機(jī)相中形成聚集體,稱(chēng)為反膠束。反膠束中極性頭朝內(nèi)，非極性尾朝外排列形成親水內(nèi)核，稱(chēng)為“水池”。萃取時(shí)，待萃取的原料液以水相形式與反膠束體系接觸，調(diào)節(jié)各種參數(shù)，使其中要提取的物質(zhì)以最大限度轉(zhuǎn)入反膠束體系(前萃取)，后將含該物質(zhì)的前萃液與另外一個(gè)水相接觸。再次調(diào)節(jié)pH、離子強(qiáng)度等參數(shù)分出要提取物質(zhì)。第4頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2體系性質(zhì)反膠束體系的性質(zhì)常用參數(shù)W0(或R)，θ，與N來(lái)表示，其中W0為水與表面活性劑的摩爾比，θ是增溶水相對(duì)總體積的濃度，N是組成每個(gè)反膠束微粒的表面活性劑分子個(gè)數(shù)(聚焦數(shù))。當(dāng)W0一定時(shí)，θ與N決定了膠束微粒的相對(duì)濃度，其中最重要的參數(shù)為W0

。第5頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三W0

反映的是反相微膠團(tuán)中的水分含量，是非極性溶劑中的水濃度和表面活性劑濃度之比。即：W0=[H2O]/[表面活性劑]。W0

越大反相微膠團(tuán)內(nèi)水分越多，形成的反相微膠團(tuán)半徑越大，能溶解的水溶性成分就越多。因此，W0

大小可以反映出反相微膠團(tuán)的大小和溶解能力。第6頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3增溶動(dòng)力學(xué)蛋白質(zhì)在反膠束中增溶，普遍認(rèn)為動(dòng)力是蛋白質(zhì)表面的電荷與形成反膠束內(nèi)表面的表面活性劑極性頭之間的靜電引力，如AOT(丁二酸-2-乙基已基酯磺酸鈉)/異辛烷形成的反膠束中，AOT是陰離子表面活性劑。當(dāng)原料樣pH<pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電，則增溶大，pH>pI則增溶小。離子強(qiáng)度也有類(lèi)似現(xiàn)象，很多研究表明蛋白質(zhì)與表面活性劑間的疏水作用也有很大作用。反膠束中，酶的動(dòng)力學(xué)與水中相似，只是由于酶與表面活性劑作用，底物分配和交換，因而Km(米氏常數(shù))Kcat(轉(zhuǎn)換數(shù))是復(fù)雜的多變量函數(shù)。第7頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4制備方法目前常用轉(zhuǎn)移法、注入法、溶解法制備反膠束體系。相轉(zhuǎn)移法：將含有生物大分子的水相與溶解有表面活性劑的有機(jī)相接觸，緩慢攪拌，在形成反相微膠團(tuán)的同時(shí)，其中的生物大分子就轉(zhuǎn)入到反相微膠團(tuán)中，直到萃取處于平衡狀態(tài)。見(jiàn)書(shū)P37圖4-4a。第8頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三注入法：將含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性劑的有機(jī)相中，從而實(shí)現(xiàn)萃取過(guò)程。見(jiàn)書(shū)P37圖4-4b。溶解法：常用于固體粉末中的生物大分子或不溶于水的生物大分子的分離。操作過(guò)程是先制備好含水（w0=3~30左右）的反相微膠團(tuán)的有機(jī)溶液，然后把含有生物大分子的固體粉末加入并攪拌，生物大分子慢慢的就可進(jìn)入到反相微膠團(tuán)內(nèi)的水中心而達(dá)到分離萃取效果。見(jiàn)書(shū)P37圖4-4c。第9頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、反膠束溶液形成的條件和特性反膠束溶液的關(guān)鍵因素：反膠束溶液是透明的、熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。反膠束(reversedmicelle)是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中一種自發(fā)形成的納米尺度的聚集體，所以表面活性劑是反膠束溶液形成的關(guān)鍵。第10頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三表面活性劑表面活性劑是由親水憎油的極性基團(tuán)和親油憎水的非極性基團(tuán)兩部分組成的兩性分子，可分為陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑和非離子型表面活性劑，它們都可用于形成反膠束。常用的表面活性劑及相應(yīng)的有機(jī)溶劑見(jiàn)下表第11頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三在反膠束萃取蛋白質(zhì)的研究中，用得最多的是陰離子表面活性劑AOT(AerosolOT，丁二酸-2-乙基己基磺酸鈉)。這種表面活性劑容易獲得，其特點(diǎn)是具有雙鏈，極性基團(tuán)較小、形成反膠束時(shí)不需加助表面活性劑，并且所形成的反膠束較大，半徑為170nm，有利于大分子蛋白質(zhì)進(jìn)入。第12頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴(2)DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲銨常使用的陽(yáng)離子表面活性劑第13頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲銨將陽(yáng)離子表面活性劑如CTAB溶于有機(jī)溶劑形成反膠束時(shí)，與AOT不同，還需加入一定量的助溶劑(助表面活性劑)。第14頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三臨界膠束濃度(CriticalMicelleConcentrationCMC)臨界膠束濃度,是膠束形成時(shí)所需表面活性劑的最低濃度，用CMC來(lái)表示，這是體系特性，與表面活性劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶劑、溫度和壓力等因素有關(guān)。CMC的數(shù)值可通過(guò)測(cè)定各種物理性質(zhì)的突變(如表面張力、滲透壓等)來(lái)確定。第15頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三bac膠束與反膠束的形成第16頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三微團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”水非極性的“核”極性“頭”非極性“尾”第17頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三反微團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”有機(jī)溶劑極性“頭”極性的“核”非極性“尾”第18頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第19頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三反相微膠團(tuán)的形成、大小、形狀，與表面活性劑的種類(lèi)、濃度以及操作時(shí)的溫度、壓力等因素都有關(guān)系。第20頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三由于反膠團(tuán)內(nèi)存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子，為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境。因此，反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類(lèi)生物大分子。關(guān)于反膠團(tuán)溶解蛋白質(zhì)的形式，有人提出了四種模型，如圖所示。其中(a)為水殼模型，蛋白質(zhì)位于水池的中心，周?chē)嬖诘乃畬訉⑵渑c反膠團(tuán)壁(表面活性劑)隔開(kāi)；(b)蛋白質(zhì)分子表面存在強(qiáng)烈疏水區(qū)域，該疏水區(qū)域直接與有機(jī)相接觸；(c)蛋白質(zhì)吸附于反膠團(tuán)內(nèi)壁；(d)蛋白質(zhì)的疏水區(qū)與幾個(gè)反膠團(tuán)的表面活性劑疏水尾發(fā)生相互作用，被幾個(gè)小反膠團(tuán)所“溶解”。表面性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)可能以不同的形式溶解于反膠團(tuán)相，但對(duì)于親水性蛋白質(zhì)，目前普遍接受的是水殼模型。二、反膠束萃取蛋白質(zhì)的基本原理第21頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三bcda反膠團(tuán)的溶解作用第22頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、影響反膠束萃取蛋白質(zhì)的主要因素蛋白質(zhì)的萃取，與蛋白質(zhì)的表面電荷和反膠束內(nèi)表面電荷間的靜電作用，以及反膠束的大小有關(guān)，所以，任何可以增強(qiáng)這種靜電作用或?qū)е滦纬奢^大的反膠束的因素，都有助于蛋白質(zhì)的萃取。影響反膠束萃取蛋白質(zhì)的主要因素，見(jiàn)下表，只要通過(guò)對(duì)這些因素進(jìn)行系統(tǒng)的研究，確定最佳操作條件，就可得到合適的目標(biāo)蛋白質(zhì)萃取率，從而達(dá)到分離純化的目的。第23頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第24頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1.水相pH值對(duì)萃取的影響水相的pH值決定了蛋白質(zhì)表面電荷的狀態(tài)、從而對(duì)萃取過(guò)程造成影響。只有當(dāng)反膠束內(nèi)表面電荷，也就是表面活性劑極性基團(tuán)所帶的電荷與蛋白質(zhì)表面電荷相反時(shí)，兩者產(chǎn)生靜電引力，蛋白質(zhì)才有可能進(jìn)入反膠束。故對(duì)于陽(yáng)離子表面活性劑、溶液的pH值需高于蛋白質(zhì)的pI值，反膠束萃取才能進(jìn)行；對(duì)于陰離子表面活性劑，當(dāng)pH＞pI時(shí)，萃取率幾乎為零，當(dāng)pH＜pI時(shí)，萃取率急劇提高.對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，pH值對(duì)萃取率的影響有差異性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量增加時(shí)，只有增大(pH-PI)值的絕對(duì)值，相轉(zhuǎn)移才能順利完成，如α-糜蛋白酶(相對(duì)分子質(zhì)量為25000)的萃取率在pH值低于pI值2-4時(shí)達(dá)到最高，而牛血清蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量為68000)在相同的系統(tǒng)中根本不發(fā)生相轉(zhuǎn)移。第25頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三這種差異性可解釋為：對(duì)于包含大蛋白分子的反膠束，其尺寸遠(yuǎn)大于“空核”的反膠束，萃取時(shí)勢(shì)必要消耗較多的能量，這些能量只能通過(guò)較強(qiáng)的靜電相互作用得到補(bǔ)償。用調(diào)節(jié)pH的作用來(lái)增加蛋白質(zhì)分子表面電荷的方法，正是達(dá)到增強(qiáng)靜電作用的一條途徑。對(duì)那些尺寸小于“空核”的反膠束中水體積的蛋白質(zhì)，只要其所攜帶的凈電荷與表面活性劑電性相反，萃取就能發(fā)生。蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量Mr與(pH-pI)絕對(duì)值呈線性關(guān)系這種關(guān)系，對(duì)陰離子及陽(yáng)離子表面活性劑所形成的反膠束體系同樣適用。第26頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第27頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.離子強(qiáng)度對(duì)萃取率的影響離子強(qiáng)度對(duì)萃取率的影響主要是由離子對(duì)表面電荷的屏蔽作用所決定的：a.離子強(qiáng)度增大后，反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠束內(nèi)表面之間的靜電吸引，從而減少蛋白質(zhì)的溶解度；b.反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了表面活性劑極性基團(tuán)之間的斥力，使反膠束變小，從而使蛋白質(zhì)不能進(jìn)入其中；c.離子強(qiáng)度增加時(shí)，增大了離子向反膠束內(nèi)“水池”的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的傾向，使蛋白質(zhì)從反膠束內(nèi)被鹽析出來(lái)；d.鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用，可以改變?nèi)芙庑阅?，鹽的濃度越高，其影響就越大。第28頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第29頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.表面活性劑類(lèi)型的影響表面活性劑選用原則：1）有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面電荷與反膠束內(nèi)表面電荷間的靜電作用和增加反膠束大小的表面活性劑。2）還應(yīng)考慮形成反膠束及使反膠束變大(由于蛋白質(zhì)的進(jìn)入)所需的能量的大小、反膠束內(nèi)表面的電荷密度等因素，這些都會(huì)對(duì)萃取產(chǎn)生影響。目前研究中常用的AOT反膠束體系和其他體系有許多不足，如不能用于分子量較大的蛋白質(zhì)的萃取和往往在兩相界面上形成不溶性的膜狀物等等，為克服這些不足,可通過(guò)在單一表面活性劑中加入具有親和作用的生物表面活性劑或另一種非離子型表面活性劑的方法來(lái)改善萃取性能。第30頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.表面活性劑濃度的影響增大表面活性劑的濃度可增加反膠束的數(shù)量，從而增大對(duì)蛋白質(zhì)的溶解能力。但表面活性劑濃度過(guò)高時(shí)，有可能在溶液中形成比較復(fù)雜的聚集體，同時(shí)會(huì)增加反萃取過(guò)程的難度。因此，應(yīng)選擇蛋白質(zhì)萃取率最大時(shí)的表面活性劑濃度為最佳濃度?？偨Y(jié)反膠束體系對(duì)核糖核酸酶a與伴刀豆球蛋白進(jìn)行萃取的結(jié)果，得到了分配系數(shù)K同表面活性劑濃度[S]以及pH值的關(guān)系式：

1nK＝A十B*pH十(C十D*pH)ln[S]

式中系數(shù)A、B、C、D取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。第31頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.離子種類(lèi)對(duì)萃取的影響陽(yáng)離子的種類(lèi)對(duì)萃取率的影響主要體現(xiàn)在改變反膠束內(nèi)表面的電荷密度上。通常反膠束中表面活性劑的極性基團(tuán)不是完全電離的，有很大一部分陽(yáng)離子仍在膠團(tuán)的內(nèi)表面上(相反離子締合)。極性基團(tuán)的電離程度愈大，反膠束內(nèi)表面的電荷密度愈大，產(chǎn)生的反膠束也愈大。6.影響反膠束結(jié)構(gòu)的其他因素1）有機(jī)溶劑的影響:有機(jī)溶劑的種類(lèi)影響反膠束的大小，從而影響水增溶的能力，所以可以利用因溶劑作用引起的不同膠束結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)選擇性增溶生物分子的目的，如α-胰凝乳蛋白酶隨溶劑的不同在反膠束中增溶的比率會(huì)出現(xiàn)顯著的差別。第32頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2）助表面活性劑的影響:當(dāng)使用陽(yáng)離子表面活性劑時(shí)，引入助表面活性劑，能夠增進(jìn)有機(jī)相的溶解容量，這多半是由于膠束尺寸增加而產(chǎn)生的。3）溫度的影響:溫度的變化對(duì)反膠束系統(tǒng)中的物理化學(xué)性質(zhì)有激烈的影響，增加溫度能夠增加蛋白質(zhì)在有機(jī)相的溶解度，例如增加溫度可使α-胰凝乳蛋白酶進(jìn)入NH4-氯仿相并在轉(zhuǎn)移率上分別增加50％。4）蛋白質(zhì)分子量的影響：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量大于30000時(shí)，最大萃取率低于60%，萃取效果明顯下降。因此，如何使反相微膠團(tuán)變得足夠大，使其能包裹住蛋白質(zhì)，是反相微膠團(tuán)萃取中需要解決的一個(gè)重要課題。第33頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、反膠束萃取技術(shù)在食品科學(xué)上的研究1酶學(xué)研究中的應(yīng)用在生物催化體系中，酶的活性與穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)酶催化反應(yīng)并獲得高產(chǎn)率生成物的重要條件。酶的活性與穩(wěn)定性受到諸如底物種類(lèi)、底物濃度、酶濃度、pH、溫度、金屬離子、緩沖液種類(lèi)以及濃度等因素的影響。影響的結(jié)果可使酶活力大幅度升高或失去活性。這是酶的本質(zhì)與作用特點(diǎn)所決定的。利用反膠束就可以解決這個(gè)問(wèn)題，反膠束體系是光學(xué)透明的熱力學(xué)穩(wěn)定的體系，可以很好地模擬酶的天然環(huán)境，并有利于用光學(xué)方法如圓二色柱、熒光發(fā)散、紫外色譜跟蹤酶反應(yīng)進(jìn)程。因此，很多科學(xué)家以反膠束體系來(lái)模擬生物膜酶的作用機(jī)理及構(gòu)象變化，導(dǎo)致反膠束體系中酶系統(tǒng)的應(yīng)用越來(lái)越廣。第34頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三已報(bào)道有50多種酶的反膠束體系中具催化活性。反膠束體系中核心水團(tuán)分為自由水和結(jié)合水。W0較小時(shí)，核心水團(tuán)主要是結(jié)合水；隨W0增大，自由水逐漸增加。核心環(huán)境逐漸接近水溶液。酶分子與表面活性劑間作用取決于酶分子與反膠束性質(zhì)，酶活性主要取決于核心水團(tuán)大小，表面活性劑性質(zhì)，反膠束濃度。Karpe等用AOT/異辛烷體系研究了α-凝乳蛋白酶的超活性，認(rèn)為酶超活性是由于：①“水池”中底物濃度高于水相中底物濃度；②帶負(fù)電的底物與帶負(fù)電的表面活性劑表面產(chǎn)生斥力作用于酶，使酶活性增大。第35頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三輔酶再生：氧化還原酶催化反應(yīng)中，輔酶再生是決定反應(yīng)過(guò)程經(jīng)濟(jì)性的關(guān)鍵因素。PileniM等研究反膠束體系中輔酶NADH的再生。氫的氧化與脂酰氨酶催化NAD+還原結(jié)合，再生的NADH輔酶可以被氧化還原酶利用。第36頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2在油脂的水解和合成中的應(yīng)用眾所周知,脂肪酶能催化具有工業(yè)價(jià)值的反應(yīng)，如低級(jí)、高級(jí)脂肪間的轉(zhuǎn)化，但脂肪酶僅能催化油水界面上的脂肪分子，對(duì)純樣脂肪體系無(wú)能為力。據(jù)此，科學(xué)家們想出了一種新的方法，就是以反膠束體系作為反應(yīng)介質(zhì)，效果也比較理想。目前食品工業(yè)研究較多的是脂肪酶在反膠束體系中催化油脂的合成和水解反應(yīng)。第37頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三脂肪酶催化油脂水解克服了高溫高壓蒸汽裂解工藝高能耗的缺點(diǎn)，然而脂肪酶是一種作用于油水界面上的水解酶，其底物油脂在水中不易分解。當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間接觸有機(jī)溶劑又會(huì)使其失活。反膠束系統(tǒng)一方面提供了巨大的油水相界面，另一方面增溶于其中的脂肪酶又能得到有效的保護(hù)，并且在一定程度上排除了底物或產(chǎn)物對(duì)酶催化活性的抑制。Chen等采用卵磷脂/黃油反膠束體系，利用Candidacylindracea脂酶水解奶油，得到的產(chǎn)品風(fēng)味良好。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度為55℃、pH值為4～6、W0值為10時(shí)，酶活力可達(dá)到最大值。在一定范圍內(nèi)，增大表面活性劑或酶的濃度，酶的活性同時(shí)也增加。且反膠束系統(tǒng)為天然食用級(jí)，另外，此體系中酶的耐熱性有很大提高。這是尋找符合食品要求反膠束系統(tǒng)的有益嘗試，也代表了今后研究的一個(gè)方向。第38頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Donglas等在AOT/反膠束中用Rhizopusdelemar脂酶合成甘油酯，Hayes等研究了固定化酶與游離酶對(duì)酯水解的影響，得到最佳參數(shù)，并預(yù)測(cè)了最適工業(yè)化生產(chǎn)的反膠束體系。GMarangoni等用卵磷脂/正己烷反膠束體系研究了Rhizipusarrhizus酯酶催化三棕櫚酰甘油酯與三油酰甘油酯發(fā)生的酯交換反應(yīng)，這是酶促酯交換第一次使用食品加工中常用的有機(jī)溶劑，表面活性劑為食用級(jí)，反應(yīng)提高了油脂的流變性質(zhì)，可作食用。以反膠束體系作為酶催化反應(yīng)介質(zhì)，不但提高了脂酶的穩(wěn)定性，而且可以大大降低了生產(chǎn)成本，可以進(jìn)一步進(jìn)行深入研究，向大規(guī)模工業(yè)化生長(zhǎng)邁進(jìn)。第39頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

3反膠束萃取技術(shù)分離蛋白質(zhì)和氨基酸反膠束萃取技術(shù)是基于液-液萃取的原理，通常包括萃取和反萃取過(guò)程。在有機(jī)溶劑相和水相兩宏觀相界面間的表面活性劑層同鄰近的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸引，接著兩界面形成含有蛋白質(zhì)的反膠束，然后擴(kuò)散到有機(jī)相中，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取即前萃過(guò)程。改變水相條件(如pH值、離子種類(lèi)或離子強(qiáng)度)，又可使蛋白質(zhì)從有機(jī)相中返回到水相中，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃取即后萃過(guò)程。蛋白質(zhì)或酶在靜電或疏水作用下溶解于反膠束微粒，其溶解模型通常有以下三種形式：Luisi的水殼模型認(rèn)為，蛋白質(zhì)分子的溶解導(dǎo)致反膠束的尺寸增大；Martinek的誘導(dǎo)契合模型認(rèn)為，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子尺寸大于反膠束微粒時(shí)，表面活性劑可在蛋白質(zhì)分子誘導(dǎo)下重新分配，形成更大聚集數(shù)的膠束，使蛋白質(zhì)溶于其中；另外固定尺寸模型認(rèn)為蛋白質(zhì)分子等于或小于反膠束微粒尺寸時(shí)，溶解后的反膠束尺寸不變。第40頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)的溶解模型第41頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1）蛋白質(zhì)混合物的分離提純：不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)分子由于表面電荷分布、體積、疏水性質(zhì)等的不同,在反膠束體系兩相間有不同的分配系數(shù),調(diào)節(jié)體系相關(guān)參數(shù)可以將目標(biāo)蛋白質(zhì)選擇性萃取到反膠束的有機(jī)相,使混合體系的蛋白質(zhì)分級(jí)分離。Nishiki等在二烷基磷酸鹽/異辛烷反膠束體系中研究溶菌酶和肌紅蛋白的分離行為，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)水相KCl濃度為0.1mol/L、pH值為9.0時(shí)，溶菌酶基本進(jìn)入反膠束微粒，而肌紅蛋白則留在水相，主要原因是由于溶菌酶的體積比肌紅蛋白的體積小，所以比較容易全部進(jìn)入反膠束微粒。調(diào)節(jié)第二水相pH值11～12時(shí)，90%以上的溶菌酶可以反萃取到濃度為1.5mol/L的KCl溶液中，是由于KCl的濃度增大后，減弱了溶菌酶與反膠束微粒的靜電吸引作用，而增加了溶菌酶與水分子的作用，因此溶菌酶被反萃到KCl溶液中。第42頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Lee等以反膠束萃取技術(shù)分離混合蛋白質(zhì)體系中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白(質(zhì)量比為1∶1)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)初始水相總蛋白質(zhì)濃度為1mg/mL、pH值為9、鈉離子濃度為0.1mol/L時(shí)，萃取后85%的α-乳白蛋白進(jìn)入AOT/異辛烷反膠束微粒，而80%的β-乳球蛋白仍殘留于水相溶液，主要是由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的表面電荷不同，導(dǎo)致它們與反膠束微粒的作用力有較大差異。Su等用AOT/異辛烷反膠束體系分離牛初乳乳清蛋白質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水相主體溶液pH值為6.35，鈉離子強(qiáng)度為0.1mol/L時(shí)，反膠束萃取后，90%以上的免疫球蛋白G留在水相，而其他的蛋白質(zhì)基本進(jìn)入反膠束有機(jī)相，主要原因是由于免疫球蛋白G與反膠束微粒的疏水作用比較小，因此進(jìn)入反膠束微粒的量比較少。第43頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2）酶的提取和分離：由于反膠束膠核可以將提取的酶包裹起來(lái)，可以避免酶與一些變性劑的直接接觸而導(dǎo)致酶活性的喪失，因此反膠束萃取技術(shù)還可以直接提取酶分子。Giovenco等報(bào)道，反膠束萃取技術(shù)從全料液中提取和純化棕色固氮菌的胞內(nèi)脫氫酶。在反膠束的表面活性劑作用下，菌體細(xì)胞先被溶解，析出的酶進(jìn)入反膠束微粒，可通過(guò)反萃取回收高濃度的活性酶。Regalado等用AOT/異辛烷反膠束體系從辣根的粗滲透水液中經(jīng)兩階段萃取提純辣根過(guò)氧化物酶(HRP)。前萃利用HRP溶解時(shí)窄的pH值范圍而除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，在第二次萃取中，用水相與有機(jī)相之比為10來(lái)選擇性溶解并濃縮HRP。第44頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三STChou等用AOT/異辛烷從雞蛋中提取溶菌酶，提取出的蛋白酶活性為天然狀態(tài)的90%，酶活力達(dá)7.3×10-4U/mg。任虹等以CTAB/異辛烷反膠束溶液萃取纖維素酶，酶的萃取率可達(dá)90%以上，適宜條件下反萃取后纖維素酶的活性基本不損失。劉國(guó)軍等以AOT/異辛烷反膠束溶液從發(fā)酵液中提取納豆激酶，經(jīng)反膠束前萃取和反萃取后，酶的純化倍數(shù)為2.7，活性為天然酶的80%，可見(jiàn)反膠束微粒確實(shí)對(duì)酶起到了一種保護(hù)作用。第45頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3）肽和氨基酸的合成反膠束作為酶催化合成肽介質(zhì)的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)能夠溶解非極性和極性底物。PeterLüthi首次用反膠束技術(shù)合成了三肽，Egger用Bri/Dliquat336/環(huán)己醇體系，以吲哚和絲氨酸為底物，色氨酸酶為催化劑，在膜反應(yīng)器中合成了色氨醇。Serralheiro等在TTAB(溴代三甲銨)/正辛醇/正庚烷體系中合成苯丙氨酰亮氨酸。加入α-胰凝乳蛋白酶，在管式陶瓷膜反應(yīng)器中間歇操作，產(chǎn)物隨底物及副產(chǎn)物一同透過(guò)膜，通過(guò)選擇性作用在超濾膜上截下固體物進(jìn)行分離。由于低聚肽在生化和醫(yī)藥領(lǐng)域中具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值，反膠束體系在此方面有著廣闊的應(yīng)用前景。第46頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4）分離氨基酸：具有不同結(jié)構(gòu)的氨基酸處于反膠束體系的不同部位，疏水性氨基酸主要存在于反膠束界面，親水性氨基酸主要溶解于反膠束的“水池”中。利用氨基酸與反膠束作用的差異，可以選擇性分離某些氨基酸。Cheng等從發(fā)酵液中分離苯丙氨酸；Cardoso用TOMAC/己醇-正庚烷反膠束體系對(duì)混合氨基酸中天氡氨酸(pI3.0)、丙氨酸(pI5.76)和色氨酸(pI5.88)的萃取分離行為進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：等電點(diǎn)十分相近的苯丙氨酸和色氨酸也可以完全分離。第47頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4從油料作物中同時(shí)分離油和蛋白質(zhì)植物蛋白提取的傳統(tǒng)方法是從脫脂粕中萃取的，不僅工藝復(fù)雜、能耗高，更重要的是加工過(guò)程中容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性；另一方面，傳統(tǒng)方法處理量小，造成大量的蛋白資源浪費(fèi)，而反膠束溶液不僅可以萃取植物蛋白，同時(shí)還可以分離出植物油脂，這一技術(shù)一旦有所突破，將引起整個(gè)制油工業(yè)發(fā)生質(zhì)的變革。這一研究已成為反膠束技術(shù)在食品科學(xué)中研究的最大熱點(diǎn)之一。第48頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Leser等用反膠束溶液分別作用于大豆和向日葵，其中的油直接萃入有機(jī)相，蛋白質(zhì)則溶入反膠束極性核內(nèi)，反萃出蛋白質(zhì)，冷卻反膠束溶液使表面活性劑沉淀分離，最后用蒸餾方法將油和烴類(lèi)分開(kāi)。給反膠束萃取技術(shù)的應(yīng)用開(kāi)創(chuàng)了條件。陳復(fù)生等用AOT/異辛浣反膠束體系同時(shí)萃取植物蛋白和油脂，采用正交試驗(yàn)，找到了最佳藝條件：時(shí)間50min，KCl濃度0.15mol/L，AOT/異辛烷為8g/50mL。得到影響萃取效果各因素主次順序：時(shí)間>AOT/異辛烷>KCl濃度。第49頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月2