核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制王鳳鳴

核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制常州市疾病預(yù)防控制中心王鳳鳴目前一頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目錄一、PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作要點(diǎn)二、質(zhì)量控制要點(diǎn)三、實(shí)驗(yàn)室生物安全管理目前二頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)一、PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作要點(diǎn)目前三頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)常用儀器設(shè)備目前四頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)加樣器PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有4套連續(xù)可調(diào)加樣器，分別用于試劑準(zhǔn)備、樣本處理、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測四個(gè)試驗(yàn)區(qū)。目前五頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)加樣器的類型單道連續(xù)可調(diào)式移液器多通道連續(xù)可調(diào)式移液器單道連續(xù)移液器單道移液管配合使用的移液器目前六頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)加樣器的使用目前七頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目前八頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)加樣器的校準(zhǔn)校準(zhǔn)方式計(jì)量局廠家自較時(shí)間視使用頻率定（6個(gè)月-1年）目前九頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)加樣器-注意事項(xiàng)

根據(jù)所需取液量選擇相應(yīng)的移液器及吸頭，基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)要求使用帶濾芯的吸頭，防止交叉污染。目前十頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)吸取液體時(shí)應(yīng)緩慢勻速吸取，避免液體濺到移液器頭上；打出液體后拇指不應(yīng)松開按鈕，將吸液嘴壓掉后再將拇指松開，避免液體回吸。在調(diào)整取液量的旋鈕時(shí)，不要用力過猛，并應(yīng)注意計(jì)數(shù)器顯示的數(shù)值不要超過其可調(diào)范圍。連續(xù)可調(diào)式移液器不可在無吸頭時(shí)使用，吸頭有液體時(shí)不可平放或倒置。加樣器-注意事項(xiàng)目前十一頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)（一）高速（冷凍）離心機(jī)電機(jī)轉(zhuǎn)速最低轉(zhuǎn)速最高轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)頭消毒方式標(biāo)準(zhǔn)配件系統(tǒng)噪音目前十二頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)高速（冷凍）離心機(jī)-使用方法離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地板或平臺上，并力求使機(jī)器處于水平位置以免離心時(shí)造成機(jī)器震動(dòng)。打開電源開關(guān)，按要求裝上所需的轉(zhuǎn)頭，將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。按功能選擇鍵，設(shè)置各項(xiàng)要求：溫度、速度、時(shí)間、加速度及減速度，帶電腦控制的機(jī)器還需按儲存鍵，以便記憶輸入的各項(xiàng)信息。待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)打開機(jī)蓋，取出離心樣品，用柔軟干凈的布擦凈轉(zhuǎn)頭和機(jī)腔內(nèi)壁，待離心機(jī)腔內(nèi)溫度與室溫平衡后方可蓋上機(jī)蓋。目前十三頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)機(jī)體應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線。開機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭按裝是否牢固，機(jī)腔有無異物掉入。離心機(jī)運(yùn)行時(shí)，離心機(jī)周圍30cm范圍內(nèi)不能有人和危險(xiǎn)物品。揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機(jī)腔或造成事故。高速（冷凍）離心機(jī)-使用方法目前十四頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)易燃易爆以及易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)不能離心。在沒有相應(yīng)的防護(hù)措施時(shí)，不能離心有毒的、放射性的物質(zhì)或病原微生物。離心機(jī)運(yùn)行時(shí)不可人為地打開蓋子。如果轉(zhuǎn)頭和蓋子有可見的腐蝕或磨損的痕跡，則應(yīng)立即停止使用。使用的玻璃或塑料離心管應(yīng)能承受相應(yīng)的離心力并大小合適。非金屬轉(zhuǎn)頭不可用紫外照射。高速（冷凍）離心機(jī)-使用方法目前十五頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)全自動(dòng)核酸提取儀目前十六頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)全自動(dòng)核酸提取儀目前十七頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目前十八頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目前十九頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目前二十頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)基于核酸的分子診斷技術(shù)目前二十一頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)病毒顆粒DNARNAFQ-PCRRT-FQPCR裂解熒光信號檢測核酸提取熒光PCR檢測系統(tǒng)熒光定量PCR檢測加樣目前二十二頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)病毒熒光定量PCR反應(yīng)內(nèi)容1份樣品的量DEPC

H2O2.875ulMasterMIX6.25ulRT-MIX0.125ul引物0.25ul探針0.25ul程序循環(huán)數(shù)溫度反應(yīng)時(shí)間115030min219515min3459515sec601min反應(yīng)體系配置反應(yīng)條件設(shè)置對照設(shè)置：陰性對照：滅菌雙蒸水代替標(biāo)本陽性對照：提取好的陽性核酸標(biāo)本目前二十三頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)典型熒光定量PCR結(jié)果

陽性標(biāo)本擴(kuò)增曲線陰性標(biāo)本擴(kuò)增曲線目前二十四頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)

二、質(zhì)量控制要點(diǎn)目前二十五頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的質(zhì)量控制要點(diǎn)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制涉及到整個(gè)基因檢測擴(kuò)增的所有階段，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，嚴(yán)禁各類交叉污染事故的發(fā)生。目前二十六頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的質(zhì)量控制要點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)的過程主要包括：標(biāo)本處理與核酸提取擴(kuò)增試劑的準(zhǔn)備核酸擴(kuò)增與產(chǎn)物分析測定后的結(jié)果報(bào)告目前二十七頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的質(zhì)量控制要點(diǎn)高質(zhì)量無污染無降解的核酸制備嚴(yán)格實(shí)行分區(qū)操作試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本處理和核酸制備區(qū)核酸擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能目前二十八頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)理想的PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)模式產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作“十六字口訣”PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則目前二十九頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)標(biāo)本處理與核酸提取的質(zhì)量控制核酸提取試劑的選擇核酸擴(kuò)增試劑的選擇試劑的分裝保存試劑的配置對照的設(shè)立核酸擴(kuò)增儀器擴(kuò)增參數(shù)的設(shè)定目前三十頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測與分析熒光定量普通凝膠電泳毛細(xì)管電泳目前三十一頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)污染的控制和預(yù)防常見污染的來源控制污染的措施消除污染的措施目前三十二頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)三、實(shí)驗(yàn)室生物安全管理目前三十三頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)為什么關(guān)注實(shí)驗(yàn)室生物安全？三起SARS疫情后期的實(shí)驗(yàn)室感染事件2003年9月8日：新加坡國立大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在P3實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開展西尼羅病毒與SARS病毒的研究，一位27歲華人研究員感染；2003年12月6日：臺灣省國防大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，一名47歲的中校研究員，在P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清理SARS實(shí)驗(yàn)后的廢棄物時(shí)，未戴手套，因而感染；2004年4月22日：中國CDC病毒所，跨室開展SARS病毒研究，并引發(fā)三代、9例病例、1例死亡；另有兩例“隱性”感染者。目前三十四頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)引起實(shí)驗(yàn)室生物污染的原因很多很多人員生物安全概念薄弱和技術(shù)操作不當(dāng)；生物安全柜和高壓滅菌容器的不正常使用或使用不當(dāng)；樣品傳遞、接受和使用、裝有凍干感染性物質(zhì)安瓿的打開；勻漿器、組織研磨器、搖床、攪拌器和超聲處理器的使用；離心機(jī)內(nèi)裝有潛在感染性物質(zhì)的離心管發(fā)生破裂目前三十五頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)生物安全的概念實(shí)驗(yàn)室生物安全

避免危險(xiǎn)生物因子造成實(shí)驗(yàn)室人員暴露、向?qū)嶒?yàn)室外擴(kuò)散并導(dǎo)致危害的綜合措施。生物安全三個(gè)方面：

一指人類的健康安全；二指人類賴以生存的農(nóng)業(yè)生物安全；三指與人類生存有關(guān)的環(huán)境生物安全。目前三十六頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全三項(xiàng)技術(shù)措施樣品隔離技術(shù)（機(jī)械、氣幕)：防止傳染因子進(jìn)入環(huán)境接觸人體定向氣流技術(shù)（負(fù)壓系統(tǒng))：防止傳染因子擴(kuò)散消毒滅菌技術(shù)（物理、化學(xué))：滅活傳染因子目前三十七頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室可以分為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室——

一級生物安全水平基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室——

二級生物安全水平防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——

三級生物安全水平最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——

四級生物安全水平根據(jù)操作不同危險(xiǎn)度等級微生物所需的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)特點(diǎn)、建筑構(gòu)造、防護(hù)設(shè)施、儀器、操作以及操作程序來決定實(shí)驗(yàn)室的生物安全水平。目前三十八頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)屏障一級防護(hù)屏障生物安全柜和個(gè)人防護(hù)裝備等構(gòu)成的防護(hù)屏障。目前三十九頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)生物安全柜高效空氣過濾器。目前四十頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目前四十一頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目前四十二頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目前四十三頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)屏障二級防護(hù)屏障設(shè)施結(jié)構(gòu)和通風(fēng)系統(tǒng)等構(gòu)成的防護(hù)屏障?！昂兄泻小钡慕Y(jié)構(gòu)44李燕目前四十四頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平分級生物安全水平分級根據(jù)生物因子危害程度和采取的防護(hù)措施，將生物安全防護(hù)水平（biosafetylevel，BSL）分為4級（BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示。目前四十五頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)與一般生物潔凈室的區(qū)別1.工作目的BSL實(shí)驗(yàn)室：保護(hù)工作人員和環(huán)境為主，也保護(hù)產(chǎn)品。安全是首要考慮因素。生物潔凈室：以保護(hù)產(chǎn)品（工作對象）為主。潔凈是首要考慮因素2.污染物的種類和來源BSL實(shí)驗(yàn)室：為目標(biāo)微生物。內(nèi)部產(chǎn)生。生物潔凈室：粉塵（可能的熱源）和微生物。外部進(jìn)入以及人的活動(dòng)產(chǎn)生。目前四十六頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)與一般生物潔凈室的區(qū)別3.空氣污染物處理方式BSL實(shí)驗(yàn)室：平面布局和氣流流向的作用,產(chǎn)生環(huán)節(jié)在一級屏障內(nèi)進(jìn)行個(gè)體防護(hù)。生物潔凈室：主要通過進(jìn)氣凈化減少活動(dòng)。4.潔、污概念BSL實(shí)驗(yàn)室：凡有目標(biāo)微生物即視為污；凡無目標(biāo)微生物即視為潔； 對各環(huán)節(jié)潔、污應(yīng)仔細(xì)分析。生物潔凈室：粉塵、微生物（特別是超標(biāo)者）和廢棄物均視為污。目前四十七頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)與一般生物潔凈室的區(qū)別5.排氣處理方式BSL實(shí)驗(yàn)室：不允許室內(nèi)→室外；排氣須凈化，不許回風(fēng)。 生物潔凈室：一般室內(nèi)→室外； 排氣可回風(fēng)。6.實(shí)驗(yàn)室軟、硬件的作用BSL實(shí)驗(yàn)室：對工作人員保護(hù)，實(shí)驗(yàn)室軟件應(yīng)是決定性的；對環(huán)境保護(hù)，實(shí)驗(yàn)室硬件應(yīng)是決定性的；生物潔凈室：均很重要，但硬件設(shè)施作用比較大。目前四十八頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)與一般生物潔凈室的區(qū)別7.壓力遞增方向BSL實(shí)驗(yàn)室：緩沖室＜準(zhǔn)備室＜主實(shí)驗(yàn)室生物潔凈室：緩沖室＞準(zhǔn)備室＞主潔凈室目前四十九頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)

保護(hù)對象

操作區(qū)

壓力

氣體排

放方式

設(shè)備

結(jié)構(gòu)

設(shè)備

造價(jià)

生物安全柜

操作者、

樣品、環(huán)境

負(fù)壓

凈化后排放

復(fù)雜

較貴

潔凈工作臺

樣品

正壓

直接排放

簡單

便宜

生物安全柜與潔凈工作臺的區(qū)別目前五十頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)BSL-1實(shí)驗(yàn)室1)實(shí)驗(yàn)室的門應(yīng)有可視窗并可鎖閉。2)實(shí)驗(yàn)室門口設(shè)掛衣裝置，個(gè)人便裝與工作服分開。3)實(shí)驗(yàn)室各表面平整、易清潔、不滲水、耐腐蝕。4)實(shí)驗(yàn)臺面防水，耐腐蝕、耐熱。5)櫥柜和實(shí)驗(yàn)臺牢固，保持一定距離以便于清潔。6)實(shí)驗(yàn)室可以利用自然通風(fēng)。如果采用機(jī)械通風(fēng)，應(yīng)避免交叉污染。目前五十一頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)BSL-1實(shí)驗(yàn)室7)如有可開啟的窗戶，應(yīng)設(shè)置紗窗。8)保證工作照明，避免不必要的反光和強(qiáng)光。9)有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)備。10)若操作有毒、刺激性、放射性揮發(fā)物質(zhì)，應(yīng)在風(fēng)險(xiǎn)評估的基礎(chǔ)上，配備適當(dāng)?shù)呢?fù)壓排風(fēng)柜。11)應(yīng)設(shè)應(yīng)急照明裝置；應(yīng)有足夠的電力供應(yīng)。12)應(yīng)有防止節(jié)肢動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物進(jìn)入的措施。目前五十二頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)目前五十三頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)典型的一級生物安全水平實(shí)驗(yàn)室目前五十四頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)BSL-2實(shí)驗(yàn)室1)滿足BSL-1的要求。2)實(shí)驗(yàn)室門可自動(dòng)關(guān)閉,門禁系統(tǒng)。3)應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)配備洗眼裝置。4)應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室或其所在的建筑內(nèi)配備高壓蒸汽滅菌器或其他適當(dāng)?shù)南緶缇O(shè)備。5)應(yīng)在操作病原微生物的實(shí)驗(yàn)間內(nèi)配備生物安全柜。6)應(yīng)有可靠的電力供應(yīng)。目前五十五頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)BSL-2實(shí)驗(yàn)室生物危害警告標(biāo)志。目前五十六頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)典型的二級生物安全水平實(shí)驗(yàn)室目前五十七頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)生物安全柜生物安全柜的要求:顆粒經(jīng)HEPA過濾去除氣流為層流氣流有方向目前五十八頁\總數(shù)六十五頁\編于一點(diǎn)生物安全柜的分級I級生物安全柜：保護(hù)工作人員和環(huán)境II級生物安全柜：保護(hù)工作人員、環(huán)境和試樣（產(chǎn)品）III級生物安全柜：采用手套箱更嚴(yán)格地保護(hù)工作人員、環(huán)境和試樣（產(chǎn)品）ClassII生物安全柜目