《豆制品中嘌呤的測(cè)定 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（征求意見稿）

CCS：67.100.10中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)：團(tuán)T/SSFSDeterminationofpurinesinbeanproductsUltraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry上海市食品學(xué)會(huì)發(fā)布IT/SSFS00XX-2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件中附錄A和附錄B為資料性附錄。本文件由上海市食品學(xué)會(huì)提出、歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：上海清美綠色食品（集團(tuán)）有限公司、上海海洋大學(xué)、上海天計(jì)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司、上海清美食品有限公司、上海天智綠色食品有限公司、上海天信綠色食品有限公司、上海天恩綠色食品有限公司、上海清美農(nóng)業(yè)科技有限公司、上海市清美現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院、上海天宣農(nóng)業(yè)科技有限公司。本文件主要起草人：李立、趙勇、沈滬銘、劉海泉、馬新新、楊露露、歐杰、葛春妹、陳婷、杜龍、趙振陽(yáng)、付行、楊麗。聲明：本文件的知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬于上海市食品學(xué)會(huì)，未經(jīng)上海市食品學(xué)會(huì)同意，不得印刷、銷售。任何組織、個(gè)人使用本標(biāo)準(zhǔn)開展認(rèn)證、檢驗(yàn)等活動(dòng)應(yīng)經(jīng)上海市食品學(xué)會(huì)批準(zhǔn)授權(quán)。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件首批承諾執(zhí)行單位：海清美綠色食品（集團(tuán)）有限公司、上海海洋大學(xué)、上海天計(jì)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司、上海清美食品有限公司、上海天智綠色食品有限公司、上海天信綠色食品有限公司、上海天恩綠色食品有限公司、上海清美農(nóng)業(yè)科技有限公司、上海市清美現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院、上海天宣農(nóng)業(yè)科技有限公司、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所、上海德諾產(chǎn)品檢測(cè)有限公司。1T/SSFS00XX-2023豆制品中嘌呤的測(cè)定超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的方法原理、試劑和材料、儀器設(shè)備、測(cè)定步驟、結(jié)果計(jì)算、檢出限、定量限與精密度。本文件適用于以大豆或雜豆為主要原料，經(jīng)加工制成的食品的嘌呤總量（包括腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤）的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和用水方法。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4方法原理用甲酸和三氟乙酸混合溶劑水解提取豆制品中的總嘌呤，經(jīng)90℃水浴，冷卻，離心取清液，旋蒸至干，90%乙腈水溶液復(fù)溶，經(jīng)高速離心后過濾膜，用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。5試劑和材料除非另有說明，本標(biāo)準(zhǔn)方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1試劑5.1.1乙腈（C2H3N，CAS號(hào)：75-05-8）：高效液相色譜級(jí)。5.1.2甲酸（CH2O2，CAS號(hào)：64-18-6）：色譜純。2T/SSFS00XX-20235.1.3三氟乙酸（C2HO2F3，CAS號(hào)：76-05-1）：色譜純。5.1.4氫氧化鈉（NaOH，CAS號(hào)：1310-73-2）。5.2標(biāo)準(zhǔn)品5.2.1腺嘌呤（C5H5N5，CAS號(hào)：73-24-5）：純度≧99%。5.2.2鳥嘌呤（C5H5N5O，CAS號(hào)：73-40-5）：純度≧99%。5.2.3黃嘌呤（C5H4N4O2，CAS號(hào)：69-89-6）：純度≧99%。5.2.4次黃嘌呤（C5H4N4O，CAS號(hào)：68-94-0）：純度≧99%。5.3材料5.3.1聚四氟乙烯濾膜：孔徑0.22μm，有機(jī)相。5.3.2離心管：50mL。5.3.3容量瓶：50mL和100mL。5.3.4樣品篩：孔徑0.4mm（40目）。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制5.4.11mol/L氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉（5.1.4）4.00g，用水溶解并定容至100mL。5.4.290%乙腈水溶液：量取900mL乙腈（5.1.1）和100mL水充分混勻。5.4.3200mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液準(zhǔn)確稱取腺嘌呤（5.2.1）、鳥嘌呤（5.2.2）、黃嘌呤（5.2.3）、次黃嘌呤（5.2.4）各0.01g，用20mL水溶解，于25℃下超聲助溶，其中腺嘌呤溶液分兩次加入500μL1mol/L氫氧化鈉溶液（5.4.1）助溶，鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤溶液各加入250μL1mol/L的氫氧化鈉溶液（5.4.1）助溶，用水分別稀釋并定容至50mL，于0～4℃保存。5.4.4混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別準(zhǔn)確移取0.5μL、2.5μL、5.0μL、12.5μL、25.0μL、40.0μL、50.0μL的腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.4.3），加入2.5mL甲酸（5.1.2）和2.5mL三氟乙酸（5.1.3），渦旋混勻后置入90℃水浴15min，取出立即冰浴，12000r/min離心10min，取清液，于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，用10mL90%乙腈水溶液（5.4.2）復(fù)溶，超聲助溶，12000r/min離心10min，取上清液經(jīng)聚四氟乙烯濾膜（5.3.1）過濾，得到一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（質(zhì)量濃度分別為10μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、800μg/和1000μg/L），于0～4℃保存。3T/SSFS00XX-20236儀器設(shè)備6.1超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）。6.2電子天平：感量0.001g和0.0001g。6.3離心機(jī)：≥12000r/min。6.4恒溫水浴鍋：控溫精度±1℃。6.5超聲波清洗器。6.6組織搗碎機(jī)。6.7粉碎機(jī)。6.8渦旋混合器。6.9旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。6.10茄型瓶：250mL。6.11具塞離心管：50mL。6.12樣品瓶：2mL，帶聚四氟乙烯旋蓋。7樣品制備與保存7.1固體樣品：取有代表性的樣品用四分法縮分出至少200g，用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，充分混勻備用，粉碎過程中避免樣品過熱。分取兩份試樣，裝入清潔容器內(nèi)，密封并標(biāo)記。一份作為檢樣，一份作為留樣，于0～4℃保存。7.2半固體樣品：取有代表性的樣品用四分法縮分出至少200g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎，混勻備用，分取兩份試樣，裝入清潔容器內(nèi)，密封并標(biāo)記。一份作為檢樣，一份作為留樣，于0～4℃保存。7.3液體樣品：將樣品充分混勻均質(zhì)后，采用虹吸法按上、中、下三層取出至少200mL，充分混合后，分取兩份試樣，裝入清潔容器內(nèi)，密封并標(biāo)記。一份作為檢樣，一份作為留樣，于0～4℃保存。8測(cè)定8.1樣品前處理準(zhǔn)確稱量0.20g樣品于50mL離心管中，加入2.5mL甲酸（5.1.2）和2.5mL三氟乙酸（5.1.34T/SSFS00XX-2023渦旋混勻后置入90℃水浴15min，取出立即冰浴，12000r/min離心10min，取清液，于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，用10mL90%乙腈水溶液（5.4.2）復(fù)溶，超聲助溶，12000r/min離心10min，取上清液，經(jīng)聚四氟乙烯濾膜（5.3.1）過濾，0~4℃保存待用。8.2色譜參考條件：a）色譜柱：HILIC色譜柱（2.1mm×100mm，粒徑1.9μm），或相當(dāng)者；b）流速：0.30mL/min；c）流動(dòng)相：——流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：乙腈（5.1.1）；——等度洗脫程序：流動(dòng)相A：流動(dòng)相B=10︰90（v/v）；d）柱溫：30℃;8.3質(zhì)譜參考條件a）離子化模式：電噴霧電離（ESI）；b）掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；c）分辨率：?jiǎn)挝毁|(zhì)量分辨率；d）其他質(zhì)譜條件參見附錄A；e）使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求；詳細(xì)條件參見附錄A；f）毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、氣簾氣壓力、碰撞能量等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度，參考條件和定性離子對(duì)、定量離子對(duì)見附錄A。8.4定性測(cè)定取樣品溶液與混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，樣液中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間偏差在±2.5％之內(nèi)；在試樣譜圖中所選擇的待測(cè)物離子對(duì)均出現(xiàn)且相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對(duì)豐度允許偏差不超過表1規(guī)定的范圍，即可確定為樣液中存在相應(yīng)的目標(biāo)化合物。表1定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度比（%）允許的最大偏差（%）>505T/SSFS00XX-202320～5010～208.5定量測(cè)試采用外標(biāo)校準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定。取樣品溶液與混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，按濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以定量子離子峰面積-濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。待測(cè)樣液中待測(cè)分析物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后測(cè)定。8.6空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按上述步驟進(jìn)行。9結(jié)果計(jì)算與表述樣品中總嘌呤含量（mg/100g）按式（1）計(jì)算：X=×10?4……（1）式中：X——樣品中總嘌呤的含量，單位為毫克每100克（mg/100g）；M——樣品的質(zhì)量，單位為克（g）；V——樣品溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；CS——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的待測(cè)組分溶液中四種嘌呤的濃度之和，單位為微克每升(μg/L）。10-4——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后兩位。10檢出限、定量限和精密度10.1檢出限與定量限本方法的檢出限為0.1mg/kg，定量限為0.5mg/kg。10.2精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的20%。6T/SSFS00XX-2023（資料性）質(zhì)譜儀器參數(shù)參考條件質(zhì)譜儀器參數(shù)參考條件如下：a）電離模式：電噴霧電離（ESI）；b）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiplereactionmonitoring,MRM）；c）源溫：150℃;d）氣簾氣流量：150L/Hr；e）脫溶劑氣溫度：150℃;f）脫溶劑氣流量：800L/Hr；g）錐孔電壓：95.5V；h）碰撞氣流量：0.15mL/min；i）低端分辨率：3.0；j）高端分辨率：15.0；k）霧化氣體：氮?dú)?。l）質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)見表A.1。表A.1四種嘌呤的主要參考質(zhì)譜參數(shù)名稱保留時(shí)間（min）方式定性離子對(duì)（m/z）定量離子對(duì)（m/z）毛細(xì)管電壓（V）碰撞能量（eV）腺嘌呤（Adenine）2.24ESI+136.105＞109.152119.1803000V136.105＞119.180鳥嘌呤（Guanine）2.59ESI-149.985＞108.150149.985＞133.1072500V149.985＞133.107黃嘌呤（Xanthine）ESI-150.974＞80.257150.974＞108.1692500V150.974＞108.169次黃嘌呤（Hypoxanthine）ESI+137.06