鼠疫病原學(xué)及鼠疫實驗室管理和運(yùn)行

鼠疫病原學(xué)及鼠疫實驗室管理和運(yùn)行第1頁/共83頁鼠疫病原學(xué)

一、鼠疫菌的生物學(xué)特性（一）形態(tài)和染色：典型的鼠疫菌呈短而粗，中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染的卵圓形小桿菌,菌體長約1～2μm，寬0.5～0.7μm。有莢膜，無鞭毛，無芽胞。革蘭氏染色陰性。

由于涂片材料來源不同，形態(tài)特點(diǎn)亦不同。

用染疫動物或鼠疫患者及其尸體的新鮮材料所做涂片，一般可見到典型菌體形態(tài)，常散在，或成雙排列，或呈群聚，偶見有短鏈狀排列。第2頁/共83頁

用瓊脂培養(yǎng)物制備的涂片標(biāo)本，鼠疫桿菌呈球桿狀，著色比較均勻，兩極濃染不明顯或無兩極濃染。用肉湯培養(yǎng)物涂片，可見呈散在或者短鏈狀排列的兩端鈍圓，兩極濃染的小桿菌。

鼠疫菌在跳蚤消化道內(nèi)的形態(tài)常發(fā)生變化，常呈近似球狀的卵圓形的球桿菌，有時也呈現(xiàn)兩端濃染。

陳舊性病灶、腐敗材料或在外界環(huán)境中生長的鼠疫菌可有多形性變化，這一特性應(yīng)在鏡檢過程中應(yīng)引起足夠的注意。第3頁/共83頁

（二）培養(yǎng)特性：

鼠疫菌為典型的異養(yǎng)菌，生長時需要多種有機(jī)物作為營養(yǎng)物質(zhì)，不過普通培養(yǎng)基就能滿足鼠疫菌的生長。

鼠疫菌為需氧菌，也能在厭氧條件下生長，但適量供氧生長最好，氧壓過高反而對生長有害。在厭氧環(huán)境生長時，發(fā)育緩慢且常出現(xiàn)變形。

鼠疫菌最適生長溫度為28～30℃，在此溫度下培育的菌落表面干燥，易于用白金耳從培養(yǎng)基表面刮取，也較容易均勻地懸浮在生理鹽水中。在37℃條件下生長緩慢，培養(yǎng)出的菌落表面濕潤、粘稠，不易刮取，不易制成均勻菌懸液。

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培養(yǎng)基的最適pH值為6.9～7.1，但是pH值在5.8～8.0范圍內(nèi)鼠疫菌均可發(fā)育。

鼠疫菌雖然在普通培養(yǎng)基上生長良好，但是發(fā)育緩慢，一般需要24～48小時才能形成肉眼可見的灰白色小菌落，如果培養(yǎng)基質(zhì)量差或者接種菌量過少，發(fā)育至成熟菌落的時間將會更長。

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鼠疫菌在普通培養(yǎng)基上的發(fā)育，其群體形態(tài)具有一定的穩(wěn)定性，在最適溫度條件下在普通培養(yǎng)基上經(jīng)16～18小時培養(yǎng)可見形狀不一，呈碎玻璃樣小菌落，24～48小時后形成肉眼可見灰白色小菌落。在顯微鏡下，成熟的菌落中心發(fā)暗、突起，有黃褐色粗糙顆粒，菌落周邊圍繞一圈寬窄不等、邊緣不整、薄而透明的鋸齒狀花邊。鼠疫菌的這一發(fā)育過程及成熟菌落的形態(tài)特點(diǎn)，是細(xì)菌學(xué)診斷的重要依據(jù)。第6頁/共83頁

二、鼠疫檢驗材料的采集、保存和運(yùn)輸（一）鼠疫檢驗材料的采集：

1.人體標(biāo)本材料的采集：凡疑似鼠疫患者，應(yīng)爭取在服用抗菌藥物前采取被檢材料標(biāo)本，各型鼠疫患者除采靜脈血液3～5ml供細(xì)菌學(xué)及血清學(xué)檢驗用外，可按臨床類型采取以下檢驗材料標(biāo)本.

1.1疑似鼠疫患者和密切接者的取材：（1）疑似腺鼠疫患者：①選取腫大淋巴結(jié)，局部皮膚經(jīng)碘酒、酒精消毒后用注射器刺入腺體中央，抽取適量組織液，保存于滅菌試管中或直接培養(yǎng)在斜面或平板上；

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②如腺腫過小取組織液困難，可用無菌注射器抽取0.3～0.5ml滅菌生理鹽水注入腺腫內(nèi)，停留片刻后，再緩慢抽取液體；③如腺腫開放或有波動感，應(yīng)在腺腫周圍浸潤部位穿刺抽取組織滲出液。

（2）疑似肺鼠疫患者:①疑似鼠疫患者如有咳痰時，應(yīng)用無菌試管、平皿或廣口瓶收集痰液；②患者無痰時用無菌棉簽取咽喉分泌物裝入無菌試管內(nèi)送檢。第8頁/共83頁

（3）疑似敗血型鼠疫患者:該型患者除采靜脈血1ml以上保存于無菌試管送檢外，還應(yīng)采集咽喉分泌物進(jìn)行檢驗。

1.2密切接觸者取材:一般采用滅菌棉簽自咽喉部取材檢查，同時可采取淋巴穿刺液。

1.3疑似鼠疫尸體的取材:經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查和臨床檢查，不能排除鼠疫的尸體應(yīng)以細(xì)菌學(xué)檢查作為最后診斷，取材方法以解剖取材為主，不能解剖取材的可行局部解剖取材或穿刺取材。取材時注意以下事項：第9頁/共83頁

（1）取材前應(yīng)準(zhǔn)備好取材的所有器械、試劑和容器等，如剪刀、鑷子、手術(shù)刀、骨鉗、穿刺針、注射器、生理鹽水、酒精、滅菌廣口瓶、試管等。以及消毒處理、個人防護(hù)的器械和藥品等；（2）取材應(yīng)選取病變損害最明顯的部分采集。肝、脾、肺分別置于滅菌廣口瓶中，心血置于滅菌試管中；取口腔和鼻腔分泌物于滅菌試管中；若尸體已腐敗，可取股骨、脛骨、胸骨、肋骨骨髓。第10頁/共83頁

（3）如不能進(jìn)行尸體解剖時，可行局部取材?？稍谑w的肝、脾、肺相應(yīng)部位做局部小切口，采集相應(yīng)的組織材料；

（4）對鼠疫尸體在不能進(jìn)行解剖取材時，也可行穿刺取材。方法是將要行取材的淋巴腺、肝、脾、肺、心等臟器組織部位皮膚經(jīng)局部70%酒精消毒后，用腰椎穿刺針抽取淋巴腺、肝、脾、肺、心等臟器組織液和心血，分別保存?zhèn)錂z。若尸體腐敗時，則應(yīng)從胸骨柄或髂骨抽取骨髓液送檢。第11頁/共83頁2動物標(biāo)本材料的采集:動物標(biāo)本材料取材前必須做詳細(xì)登記，主要記錄動物名稱、捕獲地點(diǎn)、捕獲時間、捕獲數(shù)量和采集者等信息數(shù)據(jù)。取材時可根據(jù)標(biāo)本的類型采取相應(yīng)的方法。

2.1病、死動物的取材:病、死動物標(biāo)本取材的原則是按先皮下、后胸腔、最后腹腔的順序進(jìn)行取材，并在取材時觀察皮下淋巴結(jié)及各臟器的病理變化。取材注意以下事項：

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（1）用3%來蘇爾液消毒解剖部位的皮毛，但不宜過濕，以免來蘇爾液進(jìn)入體內(nèi)，影響檢驗結(jié)果；（2）取材時應(yīng)選取病變明顯處取材，主要是腹股溝腫大的淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、肺臟和心血等。（3）若臟器腐敗或殘缺不全，則應(yīng)取骨髓檢驗，其方法是剝?nèi)ス峭饧∪?，再用酒精棉包裹，然后在近股骨頭端用骨鉗剪斷，以接種針取紅骨髓檢查。如骨髓已干枯，可用滅菌注射器注入少許生理鹽水抽取之，或?qū)⒘硪欢舜蜷_，用生理鹽水直接沖入平皿內(nèi)培養(yǎng)。第13頁/共83頁

（4）取材時注意每取完一個臟器后均應(yīng)將剪刀、鑷子經(jīng)來蘇爾棉塊、清水棉塊、干棉塊一一擦拭干凈，用火焰灼燒，最后沾酒精過火焰冷卻后備用；（5）病、死動物的材料應(yīng)采取兩份，一份自檢，一份送自治區(qū)疾控中心鼠防科復(fù)檢。

2.2活體動物的取材：捕獲活體動物原則上只采取肝、脾或有病變的組織進(jìn)行檢查。每份材料需獨(dú)立存放于滅菌小瓶內(nèi)。第14頁/共83頁

2.3昆蟲材料的采集：可進(jìn)行鼠疫檢驗的昆蟲材料包括：蚤類、蜱類、螨類、吸虱等，其中以蚤類為重點(diǎn)。在進(jìn)行昆蟲標(biāo)本材料采集時需注意以下事項：

（1）宿主動物要單只裝袋，并注明采集時間、地點(diǎn)、宿主名稱和生境等。

（2）同體或同穴的昆蟲在分類鑒定后，分組或單只揀入裝有蚤類保存液1/20萬龍膽紫2%鹽水的小瓶內(nèi)送檢。第15頁/共83頁

（二）鼠疫檢驗材料的保存

鼠疫材料的檢驗應(yīng)遵循就近檢驗的原則，但在無條件時，應(yīng)采取以下方法妥善保存檢驗材料。

1組織塊的保存：（1）將組織塊保存于生理鹽水中，用石蠟密封容器，可保存幾日。（2）將組織塊保存于中性甘油保存液（中性甘油20ml，蒸餾水80ml，碳酸鈣2g）。將1～2cm3的臟器小塊放入5～10ml上述保存液中，可保存數(shù)日。第16頁/共83頁

（3）野外采集臟器材料時常將組織塊放入中性油脂保存液（液體石蠟1份；羊毛脂1.5份；凡士林或固體石蠟1份）。加熱混勻后，置小廣口瓶中高壓滅菌后備用。

操作時應(yīng)注意先將保存液溶化，待溫度降至不燙手時（約40～45℃）倒入放置臟器塊的小瓶內(nèi)，保存液應(yīng)將臟器塊完全覆蓋。該保存液在低溫下保存時限不應(yīng)超過一周。

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2蚤類標(biāo)本的保存：（1）活蚤的保存：將活蚤置于清潔的試管或小瓶中，用白布封好瓶口。并放入幾片無味的綠草，管底放少許干沙或干燥的濾紙塊（厚度約1cm）置于陰暗處，避免接觸消毒液及有毒氣體。

（2）保存液法：將蚤放入1/20萬龍膽紫鹽水中保存，（配方為2%氯化鈉100ml中加入1:1000龍膽紫液0.5ml）。

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（三）檢驗標(biāo)本（菌種）的包裝與運(yùn)輸

1）準(zhǔn)確詳細(xì)填寫送檢單。應(yīng)包括：標(biāo)本（菌種）種類、標(biāo)本（菌種）數(shù)量、采集地點(diǎn)、采集時間、采取標(biāo)本名稱、采集者、送檢者、菌種檢驗者、菌種檢驗時間、送檢單位等。

2）按照國家生物安全的相關(guān)規(guī)定，將裝有材料的容器（試管、小瓶等）用石蠟或膠布密封，外裹以塑料布，再用浸有消毒液的棉花包裹后裝入特制的容器內(nèi)并附上詳細(xì)送檢報告單，指派2名人員（其中1名為專業(yè)人員）用當(dāng)?shù)刈羁斓慕煌üぞ哌\(yùn)送。

第19頁/共83頁三、鼠疫病原學(xué)檢驗

（一）鼠疫細(xì)菌學(xué)檢驗和鑒定程序常規(guī)的鼠疫病原體檢驗包括：菌體形態(tài)檢查、細(xì)菌培養(yǎng)、鼠疫噬菌體裂解試驗和動物試驗四步，通稱“四步檢驗”。

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Ⅰ鼠疫菌體形態(tài)檢查

1涂片在收集到檢驗材料之后要盡快地涂片，剪取腺體、肝、脾、肺、心，用臟器切面在潔凈載玻片上壓印，或取骨髓、腦脊液及各種滲出液、痰等用接種環(huán)直接涂片，或挑取可疑菌落用生理鹽水研磨涂片。

2

固定在緊急情況下，允許加熱固定，但如果用甲醇（或95%酒精或95%酒精和乙醚各半）固定，可以促進(jìn)鼠疫菌兩端濃染效果更好，并能殺死鼠疫菌。將可疑鼠疫材料涂抹在載玻片上，晾干或制成壓印涂片，浸在固定液中，固定5～10分鐘，取出晾干染色。

第21頁/共83頁3染色分別用革蘭氏染液、美蘭染液進(jìn)行染色。

1）革蘭氏染色將結(jié)晶紫染液加于已固定的標(biāo)本上，染1分鐘；水洗后用盧戈氏碘液染1分鐘；水洗后用95%酒精脫色約0.5～1分鐘，將玻片輕輕搖動直到無紫色繼續(xù)脫落為止；水洗后用稀釋石碳酸復(fù)紅復(fù)染1分鐘，水洗待干。

2）美蘭染色

將染液加在已固定的涂片上，染3～5分鐘，然后再水洗，待干，鏡檢。第22頁/共83頁4鏡檢在顯微鏡下，查找典型鼠疫菌，即兩端鈍園、兩極濃染、卵園形，革蘭氏陰性小桿菌（菌體長1～2um,寬0.5～0.7um）。顯微鏡標(biāo)本對鼠疫菌的鑒別診斷有一定幫助，僅根據(jù)鼠疫菌的形態(tài)，不能做最后確診。第23頁/共83頁

Ⅱ細(xì)菌培養(yǎng)鼠疫菌培養(yǎng)可根據(jù)待檢標(biāo)本的種類和新鮮程度選用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，腐敗材料最好經(jīng)皮感染實驗動物，待接種動物死亡或7日處死后取材培養(yǎng)。

1培養(yǎng)基:培養(yǎng)基是細(xì)菌培養(yǎng)獲得準(zhǔn)確結(jié)果的基礎(chǔ),必須在營養(yǎng)成分、酸堿度、透明度及高壓滅菌等方面嚴(yán)格把關(guān)。并進(jìn)行質(zhì)量控制。第24頁/共83頁

細(xì)菌學(xué)監(jiān)測中常用培養(yǎng)基有：

1）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：

一般市場有售，按說明溶解于蒸餾水中，按一定量分裝克氏瓶內(nèi)，15磅30min高壓滅菌后倒制平板備用。第25頁/共83頁

2）LB培養(yǎng)基：

胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉5g、瓊脂粉6g（不同生產(chǎn)廠家的瓊脂粉加量不同，需做預(yù)試驗確定加入量）、蒸餾水1000ml。制備時將所有成分加熱溶解，用1N氫氧化鈉將pH調(diào)至7.2；分裝克氏瓶內(nèi)，每瓶約300ml；15磅30min高壓滅菌；待克氏瓶中培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，無菌條件下倒制平板，每個平板倒入約15ml，分離細(xì)菌時使用。第26頁/共83頁

3）瓊脂斜面：將上述溶化好的瓊脂培基分裝量為試管的1/5，15磅30min高壓滅菌后，取出趁熱擺放制成斜面，斜面長度約為試管長度的1/3。

4）瓊脂高層：將上述溶化好的瓊脂培基分裝量為試管的1/3，15磅30min高壓滅菌后，取出豎直擺放冷卻備用。第27頁/共83頁

2取材和接種

培養(yǎng)前取材的器械消毒應(yīng)按以下順序進(jìn)行:

剪刀、鑷子等先用浸有來蘇爾液的棉球擦試→清水棉球擦→干棉球擦干→過火焰→浸入95%酒精中→取出過火焰，冷卻后取材。每取完一個臟器，剪刀、鑷子等都需重新嚴(yán)格消毒。

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1）疑似患者的材料:①淋巴腺穿刺液：在含菌量高時，用白金耳劃線培養(yǎng)，如已用生理鹽水稀釋的穿刺液，則必須充分振蕩，然后用白金耳做劃線培養(yǎng)?；蛴妹?xì)管滴于培養(yǎng)基表面1～2滴，再用白金耳劃線。②痰：痰的培養(yǎng)以稀釋培養(yǎng)法較宜。用棉簽采取的咽喉分泌物可直接涂于培養(yǎng)基。③血液：直接培養(yǎng)。將1ml血液加入5ml肉湯內(nèi)，培養(yǎng)24小時后，再用白金耳取出，培養(yǎng)在平板上。④膿汁：培養(yǎng)法同痰液。第29頁/共83頁

2）尸體材料:①臟器：根據(jù)不同的臟器材料，采取不同的培養(yǎng)方法，并做好詳細(xì)標(biāo)記。用滅菌剪刀剪下一小塊臟器材料，以鑷子夾住，直接點(diǎn)于培養(yǎng)基靠邊處,然后用白金耳劃線。

②骨髓：一般以接種針采取骨髓，直接劃線培養(yǎng)。

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3）病死鼠臟器材料:培養(yǎng)的原則是單只培養(yǎng)、單只接種。將新鮮臟器切面直接點(diǎn)種于瓊脂平板靠邊處，然后用白金耳劃線培養(yǎng)。點(diǎn)種后的臟器制成懸液接種試驗動物。對于較腐敗的死鼠臟器，可直接用白金耳從臟器切面上取材劃線培養(yǎng)，或通過小白鼠后再進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

第31頁/共83頁4）捕獲活鼠臟器材料：

培養(yǎng)原則是單只培養(yǎng)，集組接種，每組10只。一般情況下只取肝、脾檢驗，每兩只鼠臟器，分別培養(yǎng)于1個平皿上。按同一時間、同一地點(diǎn)捕獲的同種動物培養(yǎng)后可分組進(jìn)行動物試驗，但每組一般不得超過10只，小型嚙齒動物不得超過15只。第32頁/共83頁

5）蚤、蜱等昆蟲材料：

病死鼠體蚤均需單只檢菌，將蚤體放入滅菌的凹玻璃板上，用生理鹽水冼3次，將后胸背板和第一腹節(jié)剝開，用解剖針固定肛門前方，再用另一解剖針從頭部刺入，拉出蚤胃，用滅菌白金耳在板上將胃磨破，接種于培養(yǎng)基上。

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3培養(yǎng)鼠疫菌的最適培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)的動物材料連續(xù)觀察3天，病死材料及蚤類材料連續(xù)觀察5天，3天或5天不生長即可處理。值得注意的是，野外實驗室應(yīng)隨時觀察孵箱溫度的變化，始終保持在28~30℃之間。第34頁/共83頁

4結(jié)果觀察培養(yǎng)24～48小時后肉眼可見菌落形成，直徑約0.1～0.2mm,中央突起半透明淡灰色小菌落.鏡下菌落中央呈黃褐色,有粗糙顆粒,邊緣薄呈半透明有鋸齒狀花邊。

將具有上述特點(diǎn)的菌落挑選出來進(jìn)一步做鼠疫噬菌體試驗。菌落觀察必須仔細(xì)認(rèn)真，肉眼初篩后，應(yīng)勾畫出可疑菌在鏡下進(jìn)一步觀察確認(rèn)，不得輕意丟棄。第35頁/共83頁

Ⅲ鼠疫噬菌體裂解試驗鼠疫噬菌體裂解試驗是鼠疫細(xì)菌學(xué)診斷中較特異的診斷方法。

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培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)的可疑菌落，用白金耳勾出移種在另一個瓊脂平皿上，接種劃線要密。然后用注射器滴加1滴鼠疫噬菌體于劃線部位起點(diǎn)中心部分，合起平板并傾斜使噬菌體流線與培養(yǎng)劃線垂直交叉流下，放入28℃溫箱中，次日觀察結(jié)果。如出現(xiàn)噬菌帶則判為鼠疫噬菌體裂解試驗陽性。即可判定為鼠疫菌。

一般做培養(yǎng)檢查的同時做噬菌體裂解試驗。即同時接種兩個瓊脂平皿，一個做培養(yǎng)檢查，另一個做鼠疫噬菌體裂解試驗。第37頁/共83頁操作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1）疫噬菌體必須保持足夠的效價（一般是>10-8）效價降低到一定程度，則噬菌帶不明顯，噬菌體失效則不出現(xiàn)噬菌斑，造成錯誤的判斷。

2）使用噬菌體前需觀察有無污染，如有污染不得使用。3）操作要規(guī)范，滴加噬菌體時，必須讓噬菌體液自然流下。第38頁/共83頁

4）真假陽性的區(qū)別：陽性：噬菌帶中間無鼠疫菌生長，噬菌帶邊緣在顯微鏡下有被侵噬的斑紋噬菌帶逐漸擴(kuò)展，擴(kuò)展后兩邊有形象模糊的邊緣。假陽性：噬菌體流道中間有與培養(yǎng)菌相同的菌落，流道邊緣菌落或菌苔完整，由于細(xì)菌生長，流道逐漸縮小或不明顯。第39頁/共83頁

Ⅳ動物試驗動物試驗在鼠疫細(xì)菌學(xué)檢查中有2種目的。一種目的是材料含菌量少或材料腐敗，培養(yǎng)不易獲得陽性結(jié)果時，以敏感動物體培養(yǎng)，同時也為了觀察細(xì)菌對動物的致病性和病理變化；另一種目的是菌株已經(jīng)分離出來，為了測定該菌株毒力的強(qiáng)弱，或者為了增強(qiáng)菌株的毒力，而作動物試驗。試驗動物常用小白鼠（18-20g）和豚鼠（250-300g），而以豚鼠最好，因小白鼠對鼠疫菌的毒素較敏感且在夏季死亡后極易腐敗，分離鼠疫菌較困難。

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1被檢懸液的制備：（1）臟器：將所取臟器塊放入已消毒好的乳缽中剪碎研磨后，按1:10的比例加入生理鹽水，為了便于注射器吸取臟器懸液，可在臟器懸液中加一小塊滅菌脫脂棉。（2）昆蟲：將已分類好的蚤、蜱從保存液取出，用滅菌鹽水反復(fù)沖洗數(shù)次，然后研磨制成懸液，接種動物；當(dāng)檢獲大量蚤類時，可按地區(qū)、宿主、蚤種進(jìn)行分組，每組30只。第41頁/共83頁

2接種方法：

根據(jù)不同目的、被檢材料新鮮及腐敗程度來決定接種方法。（1）腹腔接種：一般新鮮材料和純培養(yǎng)的菌液，為了迅速獲取陽性結(jié)果而又不期待它出現(xiàn)較完全的病理變化時多用腹腔接種。將腹部皮膚注射部位剪毛，經(jīng)消毒后提起腹部，將被檢懸液注入腹腔，注意不得損傷內(nèi)臟器官。接種量為小白鼠每只0.2～0.4ml，豚鼠每只接種0.5～0.6ml。第42頁/共83頁

（2）經(jīng)皮接種：這種方法多用于腐敗或污染程度嚴(yán)重的材料。將小白鼠或豚鼠腹部毛剪去一小塊，用刀刮至有出血點(diǎn)后，將待檢材料以棉拭子涂布于已刮過的皮上并反復(fù)揉擦，使液體充分浸入。（3）皮下接種：材料不太腐敗時此方法較好，一般病程短，病理變化較明顯。是動物接種最常用的方法。第43頁/共83頁試驗動物鼠蹊部經(jīng)消毒后將被檢懸液注入皮下，接種劑量同腹腔接種法。一般每份材料接種兩只小白鼠，按材料的新鮮與腐敗的不同程度常采取兩種不同途徑進(jìn)行接種。如材料新鮮可采用皮下、腹腔各一只，如果材料腐敗，則可采取皮下、經(jīng)皮各接種一只。第44頁/共83頁

3飼養(yǎng)與結(jié)果觀察:（1）實驗動物接種后，放入飼養(yǎng)盒內(nèi)，詳細(xì)記錄編號、接種日期等，每日觀察1～2次，直至動物死亡或5～7天觀察期滿，處死剖檢。同時應(yīng)注意感染動物死亡后，飼養(yǎng)盒的清洗與消毒。

第45頁/共83頁（2）鼠疫材料的實驗動物，一般1～3天發(fā)?。òY狀為不攝食，豎毛尤以背部為明顯衰弱），3～7日死亡。動物死亡后應(yīng)迅速解剖，觀察病理變化并做培養(yǎng)及噬菌體裂解試驗。必要時可進(jìn)行動物傳代。

感染3～4天死亡的動物，解剖時常見急性鼠疫特有的病理變化，皮下血管充血，肝、脾有微小病死灶，充血并腫大，肺充血，心血不凝，皮下注射部位可見出血性浸潤，注射部位淋巴結(jié)腫大。第46頁/共83頁

（二）鼠疫菌的判定依據(jù)及鑒定：

（1）形態(tài)特征與染色特征與鼠疫菌相符。（2）培養(yǎng)特征與鼠疫菌一致。（3）被鼠疫噬菌體裂解，但應(yīng)注意排除假噬菌現(xiàn)象，該項指標(biāo)為判定鼠疫菌的主要依據(jù)。（4）實驗感染的小白鼠或豚鼠，具有鼠疫特有的病理改變，并從實驗動物體內(nèi)分離出鼠疫菌。第47頁/共83頁

（三）結(jié)果報告：

判定為鼠疫菌時，除通知送檢單位以便及時采取防治措施外，應(yīng)立即以書面形式連同兩只試管培養(yǎng)物，按照衛(wèi)生部《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》進(jìn)行包裝和運(yùn)輸，派專人專車上送省級專業(yè)機(jī)構(gòu)作復(fù)查判定。上報內(nèi)容包括：被檢材料的種類、數(shù)量、來源、時間、送檢者、收到時間、檢驗者（單位、姓名并蓋章）主要判定依據(jù)。培養(yǎng)物在送檢同時要留一份備查，待作出最終判定后再行銷毀或上送。第48頁/共83頁

鼠疫實驗室及其管理和運(yùn)行

按照中國的《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務(wù)院令424號）和《實驗室生物通用要求》（GB19589-2004）的規(guī)定，鼠疫病原微生物操作實驗室應(yīng)具備國家二級生物安全水平（BSL-2）。第49頁/共83頁（一）基本要求

1鼠疫細(xì)菌學(xué)檢驗必須在專用的BSL-2實驗室內(nèi)進(jìn)行。

2檢驗人員必熟悉并遵守BSL-2實驗室工作制度、自身防護(hù)規(guī)則及有關(guān)技術(shù)操作規(guī)程。第50頁/共83頁3.凡進(jìn)入毒菌室操作，必須2人以上同時工作。及時準(zhǔn)確做好檢驗的各項實驗記錄。4.實驗室管理實行人員準(zhǔn)入和使用審批制度。5.實驗室工作人員，實行資格證書和準(zhǔn)入制度，符合規(guī)定資質(zhì)的人員經(jīng)生物安全崗前培訓(xùn)，考試合格，獲得崗位資質(zhì)證書；并簽定生物安全責(zé)任書后方可辦理準(zhǔn)入手續(xù)。第51頁/共83頁

（二）生物安全實驗室的建立和要求生物安全實驗室是進(jìn)行病原微生物分離、培養(yǎng)、鑒定和保存的專用實驗室，它可以保證工作人員自身安全、防止環(huán)境污染的意外事故發(fā)生，提高疾病控制機(jī)構(gòu)抗御事故的能力。完整的生物安全實驗室由以下三部分構(gòu)成：（1）生物安全實驗室設(shè)施、設(shè)備和個人防護(hù)裝備；（2）有一定數(shù)量的、經(jīng)正規(guī)培訓(xùn)的技術(shù)人員；（3）綜合的生物安全管理手冊、標(biāo)準(zhǔn)操作程序。第52頁/共83頁

實驗室的設(shè)施要求：實驗室生物安全防護(hù)屏障：Ⅰ級生物安全防護(hù)水平（BSL-1）：Ⅰ級生物安全水平是指實驗室操作、安全設(shè)施適應(yīng)于從事明確生物學(xué)特征的、已知在健康成人中不引起疾病的、活的微生物菌（毒）株的實驗活動要求達(dá)到的水平。第53頁/共83頁

Ⅱ級生物安全防護(hù)水平（BSL-2）：標(biāo)準(zhǔn)的BSL-2實驗室除了滿足BSL-1的要求以外，在門上增加生物危險標(biāo)志、Ⅱ級生物安全柜、高壓蒸汽滅菌器、安全離心機(jī)罩帽、防濺罩或眼罩、冼眼器等。1）使用設(shè)計原則：①必須為實驗室安全運(yùn)行、清潔和維護(hù)提供足夠的空間。應(yīng)設(shè)有各自獨(dú)立的個人辦公室、輔助實驗室（存儲與實驗準(zhǔn)備間）、操作實驗室。②實驗室門應(yīng)帶鎖并可自動關(guān)閉。實驗室門應(yīng)有可視窗，門口應(yīng)設(shè)有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進(jìn)入的設(shè)施。門上貼有符合要求的BSL-2實驗室危險標(biāo)志。如應(yīng)用窗戶自然通風(fēng)，應(yīng)有防蟲紗窗。第54頁/共83頁

③每個實驗室的墻壁、天花板和地面應(yīng)平整、易清潔、不滲水、耐化學(xué)藥品和消毒劑的腐蝕。地面應(yīng)防滑，不得鋪地毯。④實驗臺應(yīng)防水，耐腐蝕、耐熱。實驗室中的廚柜和實驗臺應(yīng)牢固。廚柜、實驗臺之間應(yīng)保持一定距離，以便于清潔。⑤在實驗室門口應(yīng)設(shè)有掛衣裝置，個人便裝與實驗室工作服分開放置。在實驗室內(nèi)應(yīng)穿專門工作服；戴乳膠手套。⑥實驗室應(yīng)保證工作照明，避免不必要的反光和強(qiáng)光。⑦有可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明。必要時，重要設(shè)備如培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱等應(yīng)設(shè)專用電源。第55頁/共83頁

⑧應(yīng)在實驗室內(nèi)配備生物安全柜，生物安全柜應(yīng)安裝于人走動少的地方，不應(yīng)安裝在門口。生物安全柜的背面、側(cè)面與墻壁之間的距離宜保持不小于150~300mm的檢修距離，頂部也應(yīng)留有不小于300mm的空間。⑨應(yīng)有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)備，在靠近實驗室的位置配備高壓蒸汽滅菌器，并按期檢查和驗證，以保證符合要求。第56頁/共83頁

2）縣級BSL-2建設(shè)要求：①設(shè)施要求：要滿足上述通用要求，可在公用實驗室區(qū)域選取足夠的房間，一間作為工作人員的辦公室兼作個人物品存放和倉儲,按進(jìn)入次序依次為準(zhǔn)備間，面積適宜；最后是操作感染性材料的實驗室，面積30km2左右為宜（詳見通用要求）。②裝備要求：有條件的在BSL-1和BSL-2實驗室都應(yīng)設(shè)置通風(fēng)廚或負(fù)壓罩，用作有害氣體、化學(xué)物操作；必須安裝生物安全柜，用于操作感染性材料中容易產(chǎn)生氣溶膠和噴濺的操作。建議選用CLASSⅡ級安全柜，符合國際分級標(biāo)準(zhǔn)；配備高壓蒸汽滅菌器和生化培養(yǎng)箱。第57頁/共83頁

（三）鼠疫BSL-2實驗室的管理

1、生物安全管理

(1)實驗室主任（對實驗室直接負(fù)責(zé)的人員）負(fù)責(zé)制訂和采用生物安全管理計劃以及安全或操作手冊。

(2)實驗室主管（向?qū)嶒炇抑魅螀R報）應(yīng)當(dāng)保證提供常規(guī)的實驗室安全培訓(xùn)。

(3)要將生物安全實驗室的特殊危害告知實驗室人員，同時要求他們閱讀生物安全或操作手冊，并遵循標(biāo)準(zhǔn)的操作和規(guī)程。實驗室主管應(yīng)當(dāng)確保所有實驗室人員都了解這些要求。實驗室內(nèi)應(yīng)備有可供取閱安全或操作手冊。

(4)應(yīng)當(dāng)制訂節(jié)肢動物和嚙齒動物的控制方案。

(5)如有必要，應(yīng)為所有實驗室人員提供適宜的醫(yī)學(xué)評估、監(jiān)測和治療，并應(yīng)妥善保存相應(yīng)的醫(yī)學(xué)記錄。

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2、實驗室管理

（1）實驗室應(yīng)保持清潔整齊，嚴(yán)禁擺放和實驗無關(guān)的的物品。（2）發(fā)生具有潛在危險性的材料溢出以及在每天工作結(jié)束之后，都必須清除工作臺面的污染。所有受到污染的材料、標(biāo)本和培養(yǎng)物在廢棄和清潔再利用之前，必須清除污染。

（3）認(rèn)真做好實驗記錄，特別做好各種儀器設(shè)備運(yùn)行記錄。第59頁/共83頁

（4）各種儀器、設(shè)備要經(jīng)過有資格的計量部門的鑒定，并有標(biāo)志。（5）妥善保管易燃、易爆的有害化學(xué)物和氣體，對其操作時要在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行。（6）按要求做好水電的管理和安全。

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（四）實驗室操作規(guī)范從事鼠疫微生物的操作，都應(yīng)遵循下列基本原則：（1）所有操作人員必須經(jīng)過專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)，經(jīng)考核批準(zhǔn)才能工作。（2）熟悉各種儀器的操作步驟和要點(diǎn)，進(jìn)行正確的操作和使用。（3）應(yīng)掌握各種感染性物質(zhì)操作的一般準(zhǔn)則和技術(shù)要點(diǎn)。嚴(yán)格按照鼠疫操作手冊進(jìn)行操作。第61頁/共83頁（五）鼠疫強(qiáng)毒實驗室操作規(guī)程

1、凡是鼠疫材料、疑似材料的檢驗或鑒定等項工作必須在鼠疫強(qiáng)毒實驗室內(nèi)進(jìn)行。2、鼠疫強(qiáng)毒實驗室操作，需有2名工作人員同時進(jìn)入。3、強(qiáng)毒區(qū)工作前，用紫外燈照射半小時消毒工作區(qū)域。

4、工作人員按要求著裝，才能進(jìn)入強(qiáng)毒區(qū)域。第62頁/共83頁5、進(jìn)入實驗室（1）進(jìn)入實驗室時，每進(jìn)入一道門，應(yīng)先將此門關(guān)好，再開啟下一道門。（2）實驗過程中所需要的其它物品應(yīng)從傳遞窗送入。（3）進(jìn)入實驗室后，關(guān)閉紫外燈。（4）做好開始實驗的各項準(zhǔn)備。第63頁/共83頁6、實驗操作1）凡是鼠疫材料及疑似材料的檢驗或鑒定，包括菌種開封、細(xì)菌分離、培養(yǎng)或其它操作，均應(yīng)在實驗室生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。2）在進(jìn)行實驗工作之前，工作臺面先用消毒液滅菌并鋪放浸有消毒液的毛巾，隨時進(jìn)行工作臺面的消毒。3）進(jìn)行細(xì)菌操作時，使用一次性接種環(huán)或使用接種環(huán)電熱滅菌器燃燒滅菌接種環(huán)，避免菌液或菌塊飛濺。4）稀釋菌液時，將吸管插入試管或燒瓶底部，用吸球緩慢打擊菌液，避免產(chǎn)生氣泡。第64頁/共83頁5）實驗中需使用酚、氯仿等腐蝕性試劑時，應(yīng)在乳膠套外加戴一次性塑料手套。6）離心時，應(yīng)使用雙蓋封閉式離心機(jī)和全封閉試管，每管離心液總量至少低于最高容量1個刻度單位；平衡時不得有菌液滲漏到套管中，離心機(jī)使用后立即用消毒液擦洗消毒。7）進(jìn)行實驗操作時，勿用手直接對接或拔開注射器和針頭，以免劃破皮膚或無意接種。8）禁止在空氣中直接排放含有菌液注射器內(nèi)的氣泡，以免

形成氣溶膠。9）實驗中使用的利器，應(yīng)用利器盒直接收集處理。

第65頁/共83頁10）接種了強(qiáng)毒鼠疫菌的動物必須飼養(yǎng)在封閉的實驗動物室內(nèi)，并有明確的實驗記錄11）未分離到鼠疫菌的動物尸體必須在實驗室內(nèi)用5%來蘇兒浸泡5晝夜，然后深坑掩埋。染疫動物尸體必須5%來蘇兒浸泡后，再高壓滅菌后深埋。12）工作完畢，檢查各儀器設(shè)備是否恢復(fù)零位，做好使用記錄。13）實驗操作結(jié)束后，用消毒液消毒、清理工作臺面、地面等，并詳細(xì)記錄所做的工作內(nèi)容。第66頁/共83頁7、出實驗室及脫個人防護(hù)裝備。

1）先用消毒液浸泡手套、長筒膠靴5分鐘。2）用噴霧器從上至下噴霧消毒防護(hù)服。3）脫個人防護(hù)裝備并按要求進(jìn)行消毒滅菌。

4）最后使用75%酒精對手部、面部及暴露部位擦拭消毒，用3%硼酸水漱口后離開實驗室。

8、關(guān)閉實驗室，打開實驗室紫外燈進(jìn)行30分鐘消毒。第67頁/共83頁

（六）實驗室操作防護(hù)和個人防護(hù)：

1、實驗室操作防護(hù)（1）進(jìn)行實驗室操作，任何時候都必須戴口罩和防護(hù)眼鏡、穿著反背隔離防護(hù)服，穿防護(hù)鞋襪，不得裸露腿部和腳趾，必要時穿連體衣。（2）在進(jìn)行可能直接或意外接觸到血液、體液以及其他具有潛在感染性的材料或感染性動物的操作時，應(yīng)戴上合適的手套。手套用完后，先消毒再摘除，隨后必須洗手。（3）在處理完感染性實驗材料和動物后，以及在離開實驗室工作區(qū)域前，都必須洗手。第68頁/共83頁

（4）為了防止眼睛或面部受到灑濺物、碰撞物或人工紫外線輻射的傷害，必須戴安全眼鏡，必要時戴面罩（面具）或其他防護(hù)裝備。（5）嚴(yán)禁穿著實驗室防護(hù)裝備離開（如去餐廳、辦公室、圖書館、員工休息室和衛(wèi)生間等），更不能把防護(hù)器材帶回家。（6）禁止在實驗室的準(zhǔn)備間和操作間里進(jìn)食、飲水、吸煙、化妝、處理隱形眼鏡和儲存食品和飲料。（7）在實驗室內(nèi)用過的防護(hù)服要消毒后再清洗，不得和日常服裝放在同一柜子內(nèi)。第69頁/共83頁2個人防護(hù)除符合BSL－2的要求外，還應(yīng)該符合下列條件：

（1）工作人員在進(jìn)入實驗室時必須使用個體防護(hù)裝備，包括兩層防護(hù)服、兩層手套、生物安全專業(yè)防護(hù)口罩（不應(yīng)使用醫(yī)用外科口罩等），必要時佩戴眼罩、呼吸保護(hù)裝置等。工作完畢必須脫下工作服，不得穿工作服離開實驗室?？稍俅问褂玫墓ぷ鞣仨毾认竞笄逑础?/p>

（2）在實驗室中必須配備有效的消毒劑、眼部清洗劑或生理鹽水，且易于取用。實驗室區(qū)域內(nèi)應(yīng)配備應(yīng)急藥品。

第70頁/共83頁（3）個人防護(hù)用品的穿脫順序穿脫順序應(yīng)根據(jù)使用的防護(hù)服而定，一般原則是先穿后脫，后穿先脫，嚴(yán)格區(qū)分潔凈品和污染品。（1）穿防護(hù)用品順序：穿內(nèi)防護(hù)衣、褲-穿靴套-穿膠靴-戴帽子-戴口罩-戴手套-戴猴帽

-穿外防護(hù)衣-戴大口罩-戴手套-戴防護(hù)眼鏡或面罩。（2）脫防護(hù)用品順序：全身噴霧消毒-消毒液泡手-摘下防護(hù)眼鏡或面罩-脫外防護(hù)服-摘下大口罩-摘下猴帽-摘外層手套-摘帽子、口罩-脫膠靴-脫靴套-摘內(nèi)層手套-脫內(nèi)防護(hù)褲、衣-使用75%酒精對手部、面部及暴露部位擦拭消毒。第71頁/共83頁（七）實驗室消毒

1）鼠疫實驗室日常消毒要求1、實驗室應(yīng)制定日常消毒制度，定期進(jìn)行消毒處理，有專人負(fù)責(zé)檢查實驗室日常消毒情況。2、實驗室常備75％酒精、實驗室消毒槽（池）、浸泡缸、噴霧器并備有足量500-1000mg/L二氧化氯溶液或3-5％的來蘇兒（或石炭酸）溶液供隨時消毒使用。3、實驗室使用前后均應(yīng)開啟紫外線消毒裝置進(jìn)行空氣消毒，照射時間不低于30min。第72頁/共83頁

4、進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗操作時，用1000mg/L二氧化氯溶液或3-5％的來蘇兒溶液浸濕的毛巾鋪工作臺面，工作結(jié)束后，將毛巾和廢棄物置浸泡缸消毒后高壓處理。用75％酒精擦拭工作臺面，用500-1000mg/L二氧化氯溶液或3-5％的來蘇兒溶液擦抹地面。如發(fā)生工作面污染，培養(yǎng)物濺落等情況，在污染部位噴灑消毒液，保持十分鐘，抹去消毒液，再以75%乙醇擦拭。5、鼠疫現(xiàn)場實驗室可以定期用甲醛熏蒸，密閉過夜，充分通風(fēng)后使用。生物安全實驗室按規(guī)定操作。第73頁/共83頁

2）實驗室消毒方法：

1、人員卸裝消毒：在簡易和普通鼠疫強(qiáng)毒實驗室內(nèi)，工作結(jié)束后將手和腳（穿著膠靴和手套）在消毒液內(nèi)浸1-3分鐘，全身經(jīng)噴霧消毒,然后在消毒間按著裝相反順序脫下(手術(shù)手套在偏衫后脫)，可高壓的防護(hù)裝備經(jīng)高壓