基因工程制藥技術(shù)

第二章基因工程制藥技術(shù)獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌（或細(xì)胞）培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過(guò)濾半成品檢定成品檢定包裝制備基因工程藥物的一般程序上游階段下游階段

基因工程菌構(gòu)建流程一表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體設(shè)計(jì)目標(biāo)基因的定位克隆酶切反應(yīng)連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化篩選與鑒定1.表達(dá)載體的設(shè)計(jì)表達(dá)載體概念：expressionvector在質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，在多克隆位點(diǎn)處插入外源基因表達(dá)盒所構(gòu)成。外源基因表達(dá)盒(操縱子模型)：2、目標(biāo)基因PCR定位克隆PCR循環(huán)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成模板DNA：目標(biāo)序列,100－10000bp,pg引物：兩條寡核苷酸，21～27bp。脫氧核苷酸：4種dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPDNA聚合酶:Taq聚合酶，耐高溫緩沖溶液：50mMKCl、10mMTris-HCl,1.5mMMgCl23.酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶連接酶4.轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定非轉(zhuǎn)化子：沒(méi)有導(dǎo)入外源DNA的非轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞非重組子：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子目標(biāo)重組子：含有連接正確的重組分子（目的）非目標(biāo)重組子：不含目的基因重組子轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞類型篩選方法將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞以后，首要任務(wù)是篩選含有目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。（1）遺傳學(xué)方法A.抗生素篩選法a.單抗生素篩選大多數(shù)克隆載體帶有抗生素抗性基因，如氨芐青霉素（ampicillin,Amp）、四環(huán)素(tetracycline,Tet)、卡那霉素(kanamycin,Kan)抗性基因。帶有完整抗生素基因的載體轉(zhuǎn)化宿主菌后，其宿主菌能在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長(zhǎng)。b.雙抗生素篩選雙抗生素篩選結(jié)果示意圖B.藍(lán)-白篩選（α互補(bǔ)）許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無(wú)酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這種現(xiàn)象稱為α互補(bǔ)。

因此，當(dāng)載體的多克隆位點(diǎn)沒(méi)有插入外源DNA片段時(shí)，α互補(bǔ)能正常進(jìn)行，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶。能使人工底物X-gal變成藍(lán)色,產(chǎn)生藍(lán)色菌斑或菌落。如果載體的多克隆位點(diǎn)插入了外源DNA片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的氨基端片段,帶重組體的細(xì)菌形成白色菌斑或菌落。（2）免疫學(xué)方法

如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達(dá)，因而可用相應(yīng)的抗血清或單克隆抗體，通過(guò)放射免疫、化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選。（3）核酸雜交法

對(duì)菌斑或菌落進(jìn)行原位分子雜交是從基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，而且這種篩選不取決于目的基因是否表達(dá)。菌落原位雜交的原理鑒定方法菌落PCR：是否含有目標(biāo)基因載體大?。弘娪緳z測(cè)酶切鑒定：插入片段大小及插入方向測(cè)序確證：目標(biāo)基因的序列準(zhǔn)確無(wú)誤，閱讀框架通讀二基因鏟工程菌的債構(gòu)建基因工程蹲菌：微生物為挑操作對(duì)象且，通過(guò)基蛛因工程技?jí)盒g(shù)獲得的紡表達(dá)外源悼基因或過(guò)皂量或抑制演表達(dá)自身疏基因的工巧程生物體沈?；蚬づ蟪叹N類：細(xì)菌和酵店母是重要需的表達(dá)重大組藥物的養(yǎng)制藥生物憑。1.大孫腸桿菌包表達(dá)系嫂統(tǒng)細(xì)胞：抓G－，鄭單細(xì)胞認(rèn)，桿狀泛。鞭毛姿，無(wú)芽拌孢，一意般無(wú)莢背膜。裂香殖。菌落:蛇白色至帆黃白色亦，光滑親，直徑撐2－3勵(lì)mm。大腸桿浪菌表達(dá)魔系統(tǒng)是發(fā)展最撒早、應(yīng)然用最廣拔泛的經(jīng)允典的表霞達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：遺傳背慰景清楚套、目標(biāo)討基因表機(jī)達(dá)水平姥高（高龍達(dá)70倍％），踐培養(yǎng)周染期短，銜抗污染驗(yàn)?zāi)芰?qiáng)缺點(diǎn)：以包涵稼體形式常表達(dá)的為重組蛋透白喪失奮了原有沸的生物租活性不能用于連加工修飾希化（糖基纏化、酰胺逝化）蛋白輪表達(dá)細(xì)胞死亡組后，細(xì)胞維壁脂多糖再游離出來(lái)倦，形成內(nèi)聰毒素，具豬有抗原性殘，產(chǎn)生熱原基因工程侮大腸桿菌寄的應(yīng)用多肽類鴨2種（鋒甲狀旁追腺激素嗚(1-睛34)網(wǎng)、利尿飽鈉肽）激素：胰部島素及2概種突變體蟻、8種生盟長(zhǎng)素(1留種PEG溪化)細(xì)胞因子米類：5種敬干擾素α切（1種P甚EG化）怠、干擾素崗β和γ，賀2種G-引CSF(拆1種PE鍋G化)，錄白介素-帽2、白介倍素-11燈、白介素沫-1拮抗租劑溶栓酶類軋：rPA白喉毒素司-IL龍2融合蛋排白、Os那pA脂蛋萍白（疫苗示）等PEG聚乙二醇惱（PEG渾）是中性艦、無(wú)毒且捕具有獨(dú)特?zé)o理化性質(zhì)晃和良好的度生物相容敘性的高分箏子聚合物霸，也是經(jīng)宏FDA批桃準(zhǔn)的極少橡數(shù)能作為襪體內(nèi)注射嘴藥用的合禽成聚合物憐之一。具有高度虹的親水性乎，在水溶派液中有較際大的水動(dòng)木力學(xué)體積臥，并且沒(méi)宅有免疫原姐性。當(dāng)藕移聯(lián)到藥物增分子或藥充物表面時(shí)勞，能防止腎小伏球?yàn)V過(guò)減少免疫囑原性阻止蛋懷白酶降仁解2.酵母表達(dá)向系統(tǒng)細(xì)胞：?jiǎn)吾灱?xì)胞真核印生物，球歸形、橢圓霞形、卵形號(hào)。繁殖：芽劍殖、裂殖撐。在特定倉(cāng)條件下才削產(chǎn)生子囊親孢子。菌落：暢乳白色射，有光鏟澤，邊副沿整齊才。優(yōu)點(diǎn)：安全、森無(wú)毒。營(yíng)養(yǎng)缺購(gòu)陷選擇沒(méi)外來(lái)質(zhì)旦粒。培養(yǎng)條慣件簡(jiǎn)單胃、大規(guī)蕩模培養(yǎng)北技術(shù)成蹲熟。亞細(xì)胞器霜分化，進(jìn)索行蛋白質(zhì)戶的翻譯后外正確修飾仰和加工，樣并具有良賭好的蛋白肆質(zhì)分泌能等力。缺點(diǎn)：釀酒酵僑母發(fā)酵買產(chǎn)生乙輔醇，制迎約了高挪密度發(fā)崖酵。修飾的蛋筆白質(zhì)糖基尸化側(cè)鏈過(guò)喇長(zhǎng)，會(huì)引購(gòu)起副作用制?；蚬じ渤探湍刚鄣膽?yīng)用198絮1年H便itz乎man掩等：酵字母表達(dá)最人干擾怨素激素類瞎：6種搞人胰島治素及1絲式種突變嫁體，尿隆酸水解門酶和水準(zhǔn)蛭素；細(xì)胞因懼子：G卸M-C猶SF和度血小板朝衍生生析長(zhǎng)因子多肽類絮：高血欄糖素2種乙肝衣疫苗等。水蛭素水蛭素舍：從水蛭唾猴液中提取的天然訊特效凝資血酶抑險(xiǎn)制劑天然水蛭咳素是由6科5個(gè)氨基打酸組成的哈多肽化合悲物，在低孫于70攝進(jìn)氏度的環(huán)于境溫度下擱都能保持演活性。它扒溶于水，烈能夠阻止?fàn)垦褐欣w鞏維蛋白的可凝固，抑牢制凝血酶仔與血小板稀的結(jié)合，酷有極強(qiáng)的賣溶解血栓喝作用。重組水蛭像素是用基酬因工程通唐過(guò)大腸桿海菌、噬菌鑰體或酵母借菌表達(dá)產(chǎn)階生，其氨妻基酸序列層和結(jié)構(gòu)與渡天然水蛭榴素唯一不茶同的是其犁63位酪氧氨酸殘基既未硫酸化疲，該特點(diǎn)艘使其對(duì)凝返血酶的抑俊制作用明飲顯降低，文僅為天然稀水蛭素的阻1/10茫。但這種濟(jì)方法能獲蜻得相當(dāng)量火的重組水雪蛭素，所吸以極大地胖推動(dòng)了水?dāng)y蛭素的藥恢理、臨床勻等方面研暗究工作的畜深人開展?jié)姟Ｈ蚬こ坛鼍呐囵B(yǎng)與發(fā)寨酵（1）培養(yǎng)基潔組成與震控制碳源氮源無(wú)機(jī)鹽選擇劑誘導(dǎo)物碳源大腸桿菌酒：蛋白胨營(yíng)等蛋白質(zhì)葵的降解物宗作為碳源酵母：利滋用葡萄糖灶、半乳糖朱等單糖類遺物質(zhì)。添加低濃晉度的單糖喉和雙糖及皮其他有機(jī)模物如甘油樸等對(duì)菌體巾生長(zhǎng)具有雹一定的促晉進(jìn)作用。濃度稍百高后就增表現(xiàn)出剩底物抑屯制作用另。葡萄糖美優(yōu)先利迅用會(huì)造甜成培養(yǎng)糟基的酸啄化。氮源直接很況好地吸壟收利用朋銨鹽等征，一般雹不能利寇用硝態(tài)瓶氮。幾嚷乎都能脫利用有揮機(jī)氮源早。不同工挪程菌對(duì)的氮源利妄用能力贊差異很蛾大，具陣有很高霜的選擇憲性。大腸桿菌前：利用大壇分子有機(jī)峽氮源，酵拌母粉等。酵母：封利用氨巧基酸為晴氮源無(wú)機(jī)鹽磷、硫、鳥鉀、鈣、兵鎂、鈉等戴大量元素?cái)z和鐵、銅惑、鋅、錳政、鉬等微壓量元素的軍鹽離子形悔態(tài)基因工程漲菌生長(zhǎng)提的供必需的花礦物質(zhì)。選擇劑趟sel膊ect酬ive創(chuàng)ag滋ent維持工茂程菌的妻純正性超和質(zhì)粒罰的穩(wěn)定狡性的化轎合物。發(fā)酵培養(yǎng)臨過(guò)程中質(zhì)邪粒容易丟弦失，使之啦成為宿主鴿菌為了保眾證質(zhì)粒的爬穩(wěn)定性，忽不丟失，根據(jù)質(zhì)比粒上的怕營(yíng)養(yǎng)缺遭陷或選證擇性標(biāo)給記基因訓(xùn)，添加杠或缺陷妄選擇劑蠅。誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表盡達(dá)型工障程菌：屯在細(xì)胞訪生長(zhǎng)到送一定階蛙段，必拐需添加勒誘導(dǎo)物屯，以解但除目標(biāo)憤基因的唇抑制狀沉態(tài)，活種化基因蓬，進(jìn)行轎轉(zhuǎn)錄和薄翻譯，定生成產(chǎn)聞物。誘導(dǎo)物協(xié)成為產(chǎn)逮物表達(dá)奴必不可思少的。Lac襪啟動(dòng)子秩表達(dá)系翻統(tǒng)：I哭PTG梨誘導(dǎo)。甲基營(yíng)秋養(yǎng)型酵丈母：加般入甲醇沉進(jìn)行誘躬導(dǎo)2.培養(yǎng)充工藝與控朽制溫度溶解氧pH大腸桿吼菌和釀碰酒酵母薪生長(zhǎng)最機(jī)低溫度家為10瞧℃大腸桿菌辮生長(zhǎng)最適曉溫度為3完7℃，最箏高溫度為俯45℃。釀酒酵屬母生長(zhǎng)額最適溫瓶度為3播0℃，掃最高溫垂度為4吹0℃。溫度對(duì)工門程菌發(fā)酵系的影響兩段變氣溫發(fā)酵蠢培養(yǎng)：前期：較徐高溫度發(fā)門酵，獲得據(jù)足夠高的博菌體密度煎；后期：忠較低溫披培養(yǎng)發(fā)盒酵，對(duì)慰菌體合區(qū)成目標(biāo)驢產(chǎn)物的牛抑制不飲明顯，懼但可有書效抑制濾目標(biāo)產(chǎn)崖物的降枯解和包多涵體形唯成，總敢體提高簽工程菌丹的生產(chǎn)乒能力。溫度誘秧導(dǎo)型大鉗腸桿菌夏表達(dá)系閥統(tǒng)：生咐長(zhǎng)期維輸持37堪℃，生樹產(chǎn)期提印高溫度轟42℃鼻。溫度控制pH值說(shuō)對(duì)發(fā)酵把的影響細(xì)菌喜激歡偏堿舒性：大自腸桿菌竄適宜p筒H為6評(píng).5～放7.5透，真菌喜歡微微酸性：獻(xiàn)酵母適宜僚pH為5倘.0～6象.0。影響產(chǎn)茄物穩(wěn)定街性，最輸適生長(zhǎng)極和最適馬生產(chǎn)p圾H不同打。干擾素權(quán)是在酸雨性條件慢下穩(wěn)定染，而在脹堿性條號(hào)件下容正易降解掌。酸性睜環(huán)境有烤利于發(fā)尚揮菌株挨生產(chǎn)能票力。乙酸的產(chǎn)生使密菌體生長(zhǎng)老速率下降乒，也抑制桂基因表達(dá)脆。pH值圍控制了解發(fā)酵豪過(guò)程中各賄個(gè)階段的志適宜pH紙以后，需弱要進(jìn)一步誦設(shè)法控制打pH在合船適的范圍慨內(nèi)。分階段控珠制pH：根據(jù)試火驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定努生長(zhǎng)最搬適pH維和產(chǎn)物珠最適p六H，以丹達(dá)到最斃佳生產(chǎn)膠。溶解氧控劑制工程菌是單好氧微生鍵物，生長(zhǎng)角過(guò)程需要汪大量氧。從供應(yīng)淋量和需撞要量（鵝菌體生同長(zhǎng)、質(zhì)磚粒穩(wěn)定啄性、產(chǎn)留物積累械）二個(gè)診方面考敏慮，使膜之需氧淋不超過(guò)惑設(shè)備的維供氧能日力考慮溶氧輕對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)欣定性的影捎響：調(diào)節(jié)流攪拌轉(zhuǎn)速乳和通氣量四重組人干胳擾素生產(chǎn)舒工藝概念：枝（in亭ter膝fer手on，碗IFN伏）機(jī)體受到例病毒感染勝時(shí)，免疫漠細(xì)胞產(chǎn)生針的一組結(jié)睛構(gòu)類似、霧功能接近雙的細(xì)胞因醋子功能：干狡擾病毒在斷細(xì)胞內(nèi)的錦繁殖天然干擾緊素分類：I干謊擾素：I規(guī)FNα、弄IFNβ服、IFN醉τ、IF鋤Nε、I砌FNωII迅干擾素：惡IFNγ上市重放組干擾猶素:醋α2a污、α2弦b、α鋤1b、定β1b隨，γ研發(fā)中而的重組冊(cè)干擾素液：IF你Nω枯，臨床滋階段廣譜抗病陣毒活性（岔rhuI倡FNα）慢性乙熟型、丙扁型、丁堡型肝炎麻；皰疹灘、病毒乳性角膜慣炎。直接抗腫蘿瘤活性（拳rhuI錯(cuò)FNα）毛液細(xì)胞和車慢性髓葛樣白血少病、K熄apo喪si肉纖瘤、非囑霍奇金鄭淋巴瘤恭。免疫調(diào)節(jié)墳活性——治療慢性目肉芽腫瘤斜（rhu朋IFNγ背）多發(fā)性繪硬化癥歡rhu監(jiān)IFN炕β重組干能擾素的諷臨床應(yīng)怕用體外誘趕生干擾漂素制備宋工藝：泊Sen晉dai絕病毒誘度導(dǎo)人白止細(xì)胞干擾素生堪產(chǎn)工藝路市線（1）198兼9年：斤IFN眾α-n科3/A皺lfe侍ron怕，批準(zhǔn)弟上市產(chǎn)量低：科1gI罰FNα，海需要3億昨ml人血顆白細(xì)胞來(lái)源困虛難，工騎藝復(fù)雜溜，收率財(cái)?shù)?，價(jià)琴格昂貴潛在的紋血源性鏡病毒污煉染的可澆能性人源轉(zhuǎn)化吧細(xì)胞系培遲養(yǎng)生產(chǎn)工未藝：干擾素生嫩產(chǎn)工藝路鴉線（2）199予9年：己IFN導(dǎo)α-癥n1/寶Wel久lfe糊ron質(zhì),批吃準(zhǔn)用于輸臨床。優(yōu)點(diǎn)：首改次實(shí)現(xiàn)大虎規(guī)模商業(yè)捧化生產(chǎn)。缺點(diǎn)：暖活性低技，退出弟臨床應(yīng)議用。基因工律程大腸吩桿菌發(fā)勞酵生產(chǎn)高工藝：干擾素生全產(chǎn)工藝路蒸線（3）上市產(chǎn)品防：重組人徒干擾素r趣huIF揪N1眾986殘，rh字uIF逮Nα-計(jì)2a，銀rhu幅IFN慘α-2叢b；19芳90，r膝huIF撞Nγ-1洋b；19客93，r將huIF朗Nβ-1卻b；20堪01－2妻002：惹PEG化遼IFN，言PEG-伴Intr協(xié)on,綢Pega東sys表達(dá)產(chǎn)物華：無(wú)糖基漿化，N-召met，圣無(wú)活性包剖涵體工藝特梢點(diǎn)：發(fā)尊酵過(guò)程甚，隨后長(zhǎng)變性、肅復(fù)性過(guò)健程。干擾素生絮產(chǎn)工藝路勻線（4）動(dòng)物無(wú)限制細(xì)胞系培乖養(yǎng)生產(chǎn)工閣藝：上市產(chǎn)品饅：rhu爺IFNβ間-1a19絡(luò)96，A栽vone擱x(Bi啟ogen湖)；20米02，R志ebif思(Ser諸ono)表達(dá)產(chǎn)財(cái)物：1黑66碼aa糖掏基化蛋蕩白，2夠2.5決ku工藝特份點(diǎn)：分漂泌表達(dá)避，產(chǎn)量光低，成霞本高,曠過(guò)程嚴(yán)井格宿主：修腐生型刪假單胞膜桿菌（悟Pse勻udo童mon木as距put豪ida族）上市產(chǎn)品在：IFN匆α-2插b/安福常隆表達(dá)產(chǎn)物谷：無(wú)糖基睡化可溶性犧蛋白質(zhì)，肯具有天然疏分子結(jié)構(gòu)堵和生物活域性工藝特點(diǎn)粱：發(fā)賴酵周期嶄短：幾猾個(gè)小時(shí)無(wú)漫需變性蓋、復(fù)性表過(guò)程，寨獲得有剪活性產(chǎn)剃品純化科過(guò)程：淘村汰抗體親燦和層析干擾素恩生產(chǎn)工芝藝路線狀（5）五轉(zhuǎn)犬基因動(dòng)堂物技術(shù)主要步巖驟：獲取外窄源目的?；蛲庠茨康牧T基因?qū)氚羯臣?xì)胞伸或胚胎干勒細(xì)胞選擇攜么帶目的龜基因的盲細(xì)胞，捉選擇體暫外培養(yǎng)徹系統(tǒng)和額宿主動(dòng)沿物轉(zhuǎn)基因耕胚胎的沿發(fā)育及幕鑒定篩選所諒得的轉(zhuǎn)跌基因動(dòng)燈物經(jīng)典的技哪術(shù)路線目的基因顯微注射已交配的取出移植受體動(dòng)給物妊娠供體動(dòng)瓜物積受熟精卵資輸卵管館轉(zhuǎn)基殼因動(dòng)物缺點(diǎn)：注聰入目的基批因的命中眼率低，目扣的基因的面整合率低嫌，受精卵牽移植的受遇孕率低。轉(zhuǎn)基因動(dòng)晴物的技術(shù)靜路線整合胚胎轟移植的技罪術(shù)路線轉(zhuǎn)基因兵動(dòng)物完受體皮動(dòng)物子示宮挑目的漠基因非手術(shù)胚胎移植體外受膚精體外培養(yǎng)多細(xì)胞鞠胚胎檢測(cè)整合外源蓬基因

卵乳子趣受汪精卵竹或囊胚雷的胚胎穩(wěn)精子優(yōu)點(diǎn)：妄受精卵隸的成活跨率高達(dá)厘90％鏈以上，享外源基躬因整合域率高，酷提高受草孕率。轉(zhuǎn)基因飛動(dòng)物的否技術(shù)路逃線（續(xù)盲）轉(zhuǎn)基因動(dòng)襲物的技術(shù)導(dǎo)路線（續(xù)禾）核移植簽（克隆戰(zhàn)）的技脆術(shù)路線目的基巧因晌轉(zhuǎn)基因互動(dòng)物導(dǎo)入動(dòng)物胎男兒成纖犬維細(xì)胞妊娠取核動(dòng)物去核重組的體外培養(yǎng)囊胚期胚胎移聾植卵細(xì)胞同受精繞卵千胚胎女受艙體動(dòng)物酒子宮特點(diǎn)：體確細(xì)胞核移納植；核移文植前導(dǎo)入塑目的基因史。轉(zhuǎn)基因動(dòng)液物的技術(shù)漸路線（續(xù)洪）整合卵受包精的技術(shù)寨路線：目的基災(zāi)因革轉(zhuǎn)基因?yàn)硠?dòng)物導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄牙病毒妊娠精子感染體外受渡精胚胎移植卵母細(xì)狹胞似成大熟卵細(xì)最胞哄囊胚必受馳體動(dòng)物腫子宮特點(diǎn)：滾卵母細(xì)攀胞導(dǎo)入兆目的基拉因后再痰與精子午受精。目的基因往的制備和迫轉(zhuǎn)基因的賄方法目的基突因的制咳備·目的信基因的養(yǎng)獲得借逆轉(zhuǎn)絡(luò)錄合成疫法觸化學(xué)合貌成法雜PC藥R擴(kuò)增貴法·目的基悔因的擴(kuò)增通過(guò)載馳體在宿網(wǎng)主中克抬隆通過(guò)PC奴R擴(kuò)增目皂的基因轉(zhuǎn)基因愁動(dòng)物的態(tài)方法·顯摘微注射柄法蔥·生姨殖細(xì)胞植載體法·胚縱胎干細(xì)霧胞法掉·病經(jīng)毒載體窩法顯微注射妥法顯微注章射法是歡在顯微璃注射儀摟上，一備側(cè)用吸話管固定酬受精卵紋，另一兄側(cè)將注瀉射針插尼入受精僚卵原核巡壽（一般婆是雄原粉核）。仰拔出顯炒微注射太針解除度固定管壺的負(fù)壓擠，操作洪完成。拴顯偶微注射豆法是最裕早使用斗、至今綱仍在使短用的較歌成熟的荒基因?qū)Ц等敕椒?。其缺彈點(diǎn)是：說(shuō)整合效祝率低（借小于1腿%）；忠不能定軌點(diǎn)整合瘋，影響其基因表儲(chǔ)達(dá)和遺題傳穩(wěn)定勒性；方隔法復(fù)雜強(qiáng)、設(shè)備央昂貴。生殖細(xì)胞避載體法有體外和濟(jì)體內(nèi)轉(zhuǎn)染糕生殖細(xì)胞技的兩種方豎法，前者預(yù)又包括精導(dǎo)子載體法尖、卵子載尖體法、受君精卵載體挽法、胞漿忍內(nèi)精子注肆射法等。摸精型子載體法短是將成熟食的精子與案外源DN杰A的載體紫共同孵育睬，使精子湯攜帶外源載DNA，軍受精后外嚷源DNA敢整合至染粉色體中。把此駱?lè)ɡ碚撋险词强尚械娜?、也有成劫功的先例軍，但成功買率不高、壯效果不穩(wěn)做定，有待趁繼續(xù)探索疤、完善。胚胎干奴細(xì)胞介斬導(dǎo)法胚胎干高細(xì)胞（熄emb孕ryo飛nic嗎st寫em腳cel唯l，ES細(xì)胞）所是從胚問(wèn)泡內(nèi)細(xì)蒙胞團(tuán)分拘離得到疾的多潛域能細(xì)胞壩。譽(yù)將外源包基因?qū)⑷塍w外批培養(yǎng)的皮ES細(xì)起胞，經(jīng)劑篩選后財(cái)獲得整流合穩(wěn)定末和表現(xiàn)引良好的厚細(xì)胞，快將這些健細(xì)胞注滴射到小警鼠胚泡它腔中，帽部分E奇S細(xì)胞露可與內(nèi)晝細(xì)胞團(tuán)抹融合并嚼參與其私分化，漠形成嵌召合體。月在棄嵌合過(guò)餃程中，桌帶有外詳源基因屠的ES伸細(xì)胞可班能進(jìn)入迫生殖系炭，在經(jīng)鉤雜交育禿種可得宏到純合耗體，即盛為所需垮的轉(zhuǎn)基廚因小鼠獸。病毒載體三法細(xì)菌質(zhì)囑粒和噬挑菌體載呆體只能櫻將目的排基因運(yùn)耍載至細(xì)撒菌中擴(kuò)藝增和表易達(dá)。動(dòng)免物病毒限載體是寬較理想柳的真核江基因工符程載體域。冒病蠢毒DN確A序列叛中有很貴強(qiáng)的啟扯動(dòng)子，怖可使其隸后方的虧外源基僑因高產(chǎn)淺量和高飛頻率地吩表達(dá)。迅常用的窄有桿狀庭病毒載脫體、S憶V40神載體、殘痘苗病襯毒載體叉、逆轉(zhuǎn)板錄病毒蛋載體等雪。轉(zhuǎn)基因擦動(dòng)物的寶應(yīng)用研夜究改良動(dòng)物主經(jīng)濟(jì)性狀酒的嘗試試圖通過(guò)旗轉(zhuǎn)移單個(gè)輩基因改良楚動(dòng)物經(jīng)濟(jì)半性狀的研何究，至今語(yǔ)仍未見成辱功的報(bào)道般，尚需對(duì)壤性狀表現(xiàn)雙的生化代垃謝途徑，音有關(guān)基因賄的相互作濃用以及基用因定位整催合，基因談定量表達(dá)但、組織特肯異性表達(dá)干等進(jìn)行深彎入的研究妻。乳腺生告物反應(yīng)扒器的研可究198鋸7年，梅Gor渡don子首次報(bào)種道小鼠頭乳腺中議表達(dá)t潔PA蛋問(wèn)白。至肉今國(guó)際負(fù)上轉(zhuǎn)基慕因羊、糟轉(zhuǎn)基因害牛等的液成功報(bào)某道實(shí)例飲已有1尤0多種業(yè)，生產(chǎn)折出抗胰烏蛋白酶鳳、乳鐵中蛋白、微人凝血猾蛋白因繪子Ⅷ、型蛋