第四五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準(zhǔn)備重組及重組子的鑒定詳解演示文稿

第四五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準(zhǔn)備重組及重組子的鑒定詳解演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)優(yōu)選第四五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準(zhǔn)備重組及重組子的鑒定目前二頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前三頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前四頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)三、噬菌體的體外包裝*重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染(transfection)作用105~106噬菌斑/gDNA*體外包裝轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)目前五頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)天然包裝過(guò)程目前六頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)體外包裝過(guò)程尾部突變-頭頭部突變-尾E-72%E--累積尾部蛋白D-與DNA進(jìn)入頭部及頭部成熟有關(guān)D--累積頭部蛋白目前七頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)四、凱倫噬菌體載體(charon)兩類(lèi)特點(diǎn)：酶切位點(diǎn)多、含LacZ、容量大克隆程序:分離線性噬菌體DNA-酶切分離左右臂+中央?yún)^(qū)段-與外源DNA混合-包裝幾kb~23kb噬菌體載體及派生載體的優(yōu)點(diǎn)：感染效率高目前八頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)五、柯斯質(zhì)粒載體1、柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建定義：(cossite-carryingplasmid)eg.pHC79(+pBR322)cos+與噬菌體包裝有關(guān)的序列ori+Ampr+Tetr容量：31~45kb目前九頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前十頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)2、柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)*具有噬菌體的特性（環(huán)化）*具有質(zhì)粒載體的特性*高容量3、柯斯克隆優(yōu)點(diǎn)：容量大、非重組體少問(wèn)題：分子內(nèi)重組成多聚體（堿性磷酸酶處理）基因間連接（電泳分級(jí)分離）目前十一頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前十二頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)六、單鏈DNA噬菌體載體*M13、f1、fd*優(yōu)點(diǎn)：雙鏈復(fù)制型、單雙鏈均可轉(zhuǎn)染宿主、顆粒大小受DNA多寡制約、易測(cè)出插入方向*M13克隆體系特性：LacZ、誘導(dǎo)及組成型的LacZ、成對(duì)構(gòu)建（M13mp8、M13mp9）

目前十三頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前十四頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)七、噬菌體展示載體(phagedisplay)絲狀噬菌體（M13/fd)表面-3~5拷貝geneIII產(chǎn)物-顆粒組裝及F性須吸附G.P.Smith-1985建立-在噬菌體表面表達(dá)蛋白應(yīng)用：噬菌體表面展示文庫(kù)*原理*分離hGH變體目前十五頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前十六頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前十七頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前十八頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)八、噬菌粒載體(phasmid)M13類(lèi)的缺陷：-插入后遺傳穩(wěn)定性下降，且與片段大小有關(guān)-實(shí)際上總以正向插入-容量有限（1500bp）改進(jìn)的M13類(lèi)-噬菌粒-分子?。?kb-容量10kb-雙向性（細(xì)菌質(zhì)粒和phage）目前十九頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前二十頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)T3+T7目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)1、噬菌體載體的類(lèi)型及其比較。2、噬菌體的體外包裝原理。3、什么是凱倫噬菌體載體？有怎樣的特點(diǎn)？4、什么是柯斯質(zhì)粒載體？有怎樣的特點(diǎn)？5、單鏈DNA噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)。6、噬菌體展示載體的工作原理。7、噬菌粒載體的特點(diǎn)。復(fù)習(xí)提綱目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)第五章目的基因的準(zhǔn)備、重組及重組子的鑒定一、cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建（匯集生物體所有cDNA序列的重組DNA群體）1、cDNA基因文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)：病毒RNA篩選簡(jiǎn)單表達(dá)測(cè)定基因結(jié)構(gòu)（內(nèi)含子外顯子）、時(shí)間調(diào)節(jié)基因表達(dá)特征分析2、缺點(diǎn)：無(wú)調(diào)節(jié)序列低豐度mRNA克隆難目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)

Clerke&Carbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/g)特異mRNA拷貝數(shù)/總mRNA種類(lèi)可克隆片段大小/基因組總長(zhǎng)度mRNA豐度克隆基因的大小(載體容量)10670/29%=87000N=ln(1-99%)/ln(1-1/87000)=1.7x105目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)3、RNA的制備及純化總RNA的提取mRNA的純化-oligodT-纖維素柱層析特異mRNA的富集（mRNA分級(jí)分離、蔗糖密度梯度離心）特異mRNA的分析鑒定*mRNA體外翻譯（麥胚、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞）*RNA電泳-NorthernBlot目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)4、cDNA兩鏈的合成5、雙鏈cDNA分子與載體的連接*同聚物加尾*linker-連接子6、重組體導(dǎo)入宿主轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電脈沖目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)RNaseH方法目前二十七頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)Self-priming目前二十八頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)同聚物加尾目前二十九頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)重組-linker目前三十頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)二、cDNA基因文庫(kù)的篩選與特異重組體的鑒定1、遺傳檢測(cè)*利用載體提供的表型特征*插入基因功能表達(dá)2、物理檢測(cè)*凝膠電泳目前三十一頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)3、核酸探針（screeningalibrary)目前三十二頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)4、免疫化學(xué)檢測(cè)*標(biāo)記抗體探針*免疫沉淀5、轉(zhuǎn)譯篩選法*雜交抑制的轉(zhuǎn)譯-豐富mRNA*雜交選擇的轉(zhuǎn)譯-低豐度mRNA-insulin6、正負(fù)篩選法組織特異性、發(fā)育階段特異性、特殊處理后基因表達(dá)差異目前三十三頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)目前三十四頁(yè)\總數(shù)三十六頁(yè)\編于十點(diǎn)三、基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選1、基因組DNA文庫(kù)：匯集生物體所有DNA序列的重組DNA群體2、目的研究結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控序列基因組結(jié)構(gòu)3、目的基因的準(zhǔn)備*限制酶切法-鳥(niǎo)槍法(shot-gun