細(xì)胞工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物詳解演示文稿

細(xì)胞工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)（優(yōu)選）細(xì)胞工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物目前二頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目前三頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目前四頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)Histroyoftransgenicanimalproduction1970’sfirsttransgenicmiceviaviralinfection,butnotgermlinetransmission(Jaenisch:1974/1975)1980’s,firsttransgenicmiceviamicroinjection,themostpopulartechnique(Gordon,80,Brinster,Wagner-s,Constantini,81)EScellsforgenetransfer(Evans/Kaufman,Mintz,1980)1985,firsttransgenicrabbits,sheep,pigsandcattle.80-90,commercialtransgenicservices,viatransgenicfacility.1990’s,transgenicfarmanimalcompaniesasbioreactorsandorgandonors.目前五頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)主要內(nèi)容第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備目的基因?qū)朕D(zhuǎn)基因胚胎培養(yǎng)與移植轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物存在的問題目前六頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備外源目的基因制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育和鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系目前七頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)主要方法1基因顯微注射法2反轉(zhuǎn)錄病毒感染法3精子載體法4胚胎干細(xì)胞法5核移植法6受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移一、目的基因的導(dǎo)入目的基因成功導(dǎo)入是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的核心技術(shù)。目前八頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目的基因構(gòu)建用于轉(zhuǎn)基因的目的基因的要素：Promoter/enhancer–when,where,howmuch啟動(dòng)子/增強(qiáng)子-決定基因何時(shí)、何地表達(dá)及表達(dá)強(qiáng)度Codingsequence–codingthespecificprotein

編碼區(qū)-編碼哪個(gè)蛋白采用技術(shù)：DNA克隆、重組技術(shù)目前九頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)載體的特點(diǎn)克隆載體要有復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體要有啟動(dòng)子。多克隆位點(diǎn)：一種內(nèi)切酶一個(gè)酶切位點(diǎn)，(置換型載體，兩個(gè)酶切位點(diǎn)，置換片段的兩側(cè))，位于不影響載體復(fù)制和表達(dá)的DNA序列上。分子量不宜過大，容易分離純化。篩選標(biāo)記：報(bào)告基因或選擇標(biāo)記基因。目前十頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)Example.Geneconstruct

目前十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目的基因制備內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物時(shí)需加入酶切位點(diǎn)內(nèi)切酶位點(diǎn)酶切連接目前十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)將重組DNA顯微注射到動(dòng)物受精卵中。1基因顯微注射法目前十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目前十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠：受精卵的準(zhǔn)備：雌雄鼠交配，收集受精卵?；?qū)耄簩⒛康幕蝻@微注射到受精卵雄原核內(nèi)。胚胎移植：體外培養(yǎng)至早期囊胚或桑椹胚，再將其移植入假孕養(yǎng)母子宮內(nèi)。產(chǎn)出嵌合體小鼠。雜交篩選，獲得純合體轉(zhuǎn)基因小鼠。

目前十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)顯微注射法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)基因范圍廣，轉(zhuǎn)移基因大，可達(dá)數(shù)百Kb，且不含任何病毒基因組片段，安全。缺點(diǎn)整合機(jī)制不明確，容易隨機(jī)整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)入基因不表達(dá)；整合位點(diǎn)隨機(jī)發(fā)生會造成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組重排、突變、易位缺失等；需顯微操作儀，技術(shù)性要求強(qiáng)。目前十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)

2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法目前十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的原理目前十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建過程①提取病毒未整合的環(huán)狀形式DNA②將環(huán)狀DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中③選擇適當(dāng)?shù)拿笇⒉《窘Y(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)切除，或切除非結(jié)構(gòu)蛋白基因④將外源目的基因克隆到載體中⑤轉(zhuǎn)染細(xì)胞，測定外源基因的表達(dá)

目前十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的類型可復(fù)制型載體復(fù)制缺陷型載體，復(fù)制單個(gè)周期，依賴于輔助細(xì)胞（包裝細(xì)胞）。Φ-2細(xì)胞株輔助細(xì)胞的作用：為病毒提供包裝蛋白，決定著病毒效價(jià)及其宿主范圍。目前二十頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒制作轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠8細(xì)胞胚胎制備交配48h后處死，取8-細(xì)胞胚胎。酸性泰洛氏液中脫去透明帶重組病毒載體轉(zhuǎn)染8細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)染8細(xì)胞胚胎和輔助細(xì)胞共培養(yǎng)24h，桑葚胚晚期或囊胚早期。將胚胎移植到假孕母體子宮內(nèi)，產(chǎn)出子代。子代經(jīng)篩選、雜交，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前二十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒法的優(yōu)缺點(diǎn)該法的優(yōu)點(diǎn)：

基因轉(zhuǎn)移效率高，感染率和整合率高，尤其適用于處于多細(xì)胞發(fā)育階段的胚胎。如禽類轉(zhuǎn)入后能穩(wěn)定遺傳，整合機(jī)制明確缺點(diǎn)：

這類載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(≤10kb)。缺少調(diào)控元件可能影響表達(dá)盡管為復(fù)制缺陷型，若與整合型輔助表達(dá)基因組發(fā)生同源重組，可能組裝成野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒。

危險(xiǎn)目前二十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)3精子載體法原理：

精子吸附DNA，再通過受精作用把目的基因傳給子代動(dòng)物，從而獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。精子吸附DNA的方法主要有：

DNA與精子共育法

電穿孔導(dǎo)入法

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

目前二十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)4胚胎干細(xì)胞方法

為什么胚胎干細(xì)胞適用轉(zhuǎn)基因操作？胚胎干細(xì)胞(ES)是培養(yǎng)的細(xì)胞。具有發(fā)育全能性。能通過構(gòu)建嵌合體而產(chǎn)生有功能的生殖細(xì)胞。技術(shù)關(guān)鍵外源基因?qū)牒?，既能高效穩(wěn)定表達(dá)，又不影響ES細(xì)胞的各種功能目前二十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)操作過程對ES細(xì)胞進(jìn)行基因操作，將外源目的基因?qū)隕S細(xì)胞。把轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞移入胚泡期的胚胎。然后將胚胎移植到代孕子宮內(nèi)，產(chǎn)出子代。子代的部分生殖細(xì)胞就是由轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞形成。子代轉(zhuǎn)基因鼠之間進(jìn)行雜交，子代再配對雜交，就獲得了純合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

目前二十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目前二十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目前二十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目前二十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)基因打靶與基因敲除基因打靶：指外源DNA片段上帶有受體細(xì)胞染色體相應(yīng)部位的同源序列，導(dǎo)入ES細(xì)胞后在同源部位發(fā)生定點(diǎn)整合，這種整合是通過同源重組的方式來實(shí)現(xiàn)的?；蚯贸喝绻庠碊NA含有突變失活的基因，定點(diǎn)整合后取代原來的同源序列，使ES細(xì)胞的該基因失活，即是基因敲除。將這樣的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)入小鼠胚胎，便可得到基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠。目前二十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)5核移植法1997年，克隆羊Dolly。此后，英國羅斯林研究所又與英國PPL公司合作誕生了世界上第一批轉(zhuǎn)基因綿羊Polly。人類凝血因子IX基因。以綿羊轉(zhuǎn)基因胎兒成纖維細(xì)胞作核供體，獲得了3只轉(zhuǎn)基因綿羊。此法的轉(zhuǎn)基因效率高于原核顯微注射法，而且在核移植前可以選擇后代的性別，有利于轉(zhuǎn)基因群體的建立，節(jié)約時(shí)間和費(fèi)用。

目前三十頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)目前三十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)6受體介導(dǎo)法早期胚胎細(xì)胞內(nèi)存在胰島素受體，使受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移成為可能。1999年，IvanvaM.M構(gòu)建了一個(gè)同時(shí)攜有胰島素-多聚賴氨酸基因DNA的構(gòu)建體。將胚胎與其共培養(yǎng)3小時(shí)，發(fā)現(xiàn)該重組體可穿過透明帶在卵裂球核旁區(qū)聚集。優(yōu)點(diǎn)：不需顯微操作，而且使用的運(yùn)載工具對胚胎無明顯毒害作用，為將來的基因治療提供了一條新途徑。

目前三十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎的培養(yǎng)與移植哺乳動(dòng)物：將處理完畢的轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎，經(jīng)過短期的體外培養(yǎng)，就可移植到假孕鼠的輸卵管中進(jìn)行發(fā)育。注射后的小鼠受精卵的卵周隙，應(yīng)清晰可辨。魚類和兩棲類：不需移植，體外發(fā)育。目前三十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源DNA的檢測外源基因的Southern印跡分析

檢測基因轉(zhuǎn)錄的Northern印跡分析PCR技術(shù)

表達(dá)產(chǎn)物檢測--蛋白質(zhì)分析檢測轉(zhuǎn)移外源DNA熒光蛋白基因目前三十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)轉(zhuǎn)GFP的小鼠目前三十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)TransgenicFishSalmon,troutCangrowupto6timesfasterthanwildtypefishMosthaveextracopiesofgrowthhormone(GH)gene目前三十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)GloFish,originallydevelopedinSingaporeasawaytomonitorwaterpollutionThenormallyblack-andsilverzebrafishwasturnedgreenorredbyinsertingvariousversionoftheGFPgene.目前三十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)UsesfortransgenicanimalsGenepharmingXenotransplantationIndustrialFood/FeedModelsystem第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用前景目前三十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在基礎(chǔ)性研究中的學(xué)術(shù)價(jià)值1、研究基因的結(jié)構(gòu)和功能啟動(dòng)子和增強(qiáng)子2、研究基因的組織特異性表達(dá)3、基因多級調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究有的目的基因必須在另一基因的表達(dá)產(chǎn)物激活后才能表達(dá)，從而對目的基因的功能和調(diào)節(jié)進(jìn)行研究，這種實(shí)驗(yàn)體系就稱為基因多級調(diào)節(jié)系統(tǒng)。4、細(xì)胞功能的研究毒素基因+細(xì)胞類型特異性的啟動(dòng)子目前三十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)轉(zhuǎn)neurogenin1啟動(dòng)子控制之下的β-半乳糖甘酶報(bào)告基因的小鼠Trangenicmouseembryoinwhichthepromoterforageneexpressedinneuronalprogenitors(neurogenin1)drivesexpressionofabeta-galactosidasereportergene.Neuralstructuresexpressingthereportertransgenearedarkblue-green.(Dr.AnneCalof)目前四十頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用1、生產(chǎn)藥用蛋白（動(dòng)物生物反應(yīng)器、乳腺生物反應(yīng)器）2、進(jìn)行基因治療3、在人類組織器官移植中的應(yīng)用4、病毒性疾病5、建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型目前四十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)1基因制藥Theuseoftransgenicanimals(andsometimesplants)toproducemedicine.

利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥品“Turningmilkintomedicine.”目前四十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)從理論上說，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥的成本遠(yuǎn)比傳統(tǒng)的生物制藥成本低。瓶頸在于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備。湯姆·紐伯里：“利用動(dòng)物生產(chǎn)藥物，只需向動(dòng)物、畜棚和擠奶裝置投資，而不是不銹鋼發(fā)酵槽。”利用轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)“α-1號”抗胰島素。2000頭轉(zhuǎn)基因羊的產(chǎn)量，足夠2萬到4萬人使用。目前四十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)乳腺生物反應(yīng)器也稱動(dòng)物個(gè)體乳腺表達(dá)系統(tǒng)，使外源基因在動(dòng)物的乳腺中高效表達(dá)并分泌到乳汁中，最終從乳汁中獲取目的基因產(chǎn)物。有人形象地將動(dòng)物生物反應(yīng)器稱為分子農(nóng)場，它是生產(chǎn)藥用蛋白的全新生產(chǎn)模式，已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展的重要方向。如何實(shí)現(xiàn)？利用哺乳動(dòng)物乳腺特異性表達(dá)的啟動(dòng)子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物目前四十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)載體特點(diǎn)：

啟動(dòng)子在物種間存在相容性，可以交叉使用。表達(dá)載體包含類固醇應(yīng)答元件、TATA盒、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號和polyA信號等元件。增加5端或3端調(diào)控序列的長度，或使用乳蛋白基因的內(nèi)含子，可提高表達(dá)水平。基因表達(dá)的位置效應(yīng)，目前還不能克服。目前四十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究現(xiàn)狀難度高、效率低、時(shí)間長和費(fèi)用高.根本原因在于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率低和基因表達(dá)受“位置效應(yīng)”影響。表達(dá)載體的核心生物元件是一種乳蛋白的基因調(diào)控序列。目前四十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)2基因治療基因治療是通過調(diào)控目的基因的表達(dá)，抑制、替代或補(bǔ)償缺陷基因，從而恢復(fù)受累細(xì)胞、組織或器官的生理功能。β-地中海貧血：將小鼠或人的β-珠蛋白基因注入純合突變體的小鼠受精卵中，使小鼠的貧血得到了糾正。存在問題：插入突變可能會導(dǎo)致其它疾病產(chǎn)生、外源基因是否表達(dá)、如何調(diào)控表達(dá)以及表達(dá)在傳代中是否穩(wěn)定等。目前四十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)NatureMedicine15,331-337(2009)

BDNF基因轉(zhuǎn)入有利于老年癡呆癥的治療

Inamyloid-transgenicmice,BDNFgenedelivery,whenadministeredafterdiseaseonset,reversessynapseloss,partiallynormalizesaberrantgeneexpression,improvescellsignalingandrestoreslearningandmemory.Theseoutcomesoccurindependentlyofeffectsonamyloidplaqueload.BDNFtherapeuticdeliverymeritsexplorationasapotentialtherapyforAlzheimer'sdisease.

目前四十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)3在人類組織器官移植中的應(yīng)用排異反應(yīng)的機(jī)理：人的器官組織中糖蛋白的決定簇與其他動(dòng)物不同。動(dòng)物的血管內(nèi)皮上的糖蛋白有一個(gè)α1,3-半乳糖，和一個(gè)α1,3-巖藻糖，而人體內(nèi)有天然的抗α1,3-半乳糖抗體。動(dòng)物和人之間器官移植時(shí)，人α1,3-半乳糖抗體與動(dòng)物抗原結(jié)合，形成抗原抗體免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，損壞器官內(nèi)皮和基底膜，使?jié)B透性增加、出血，導(dǎo)致器官組織壞死而排斥這種器官。目前四十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)解決異種移植中排斥反應(yīng)的兩條途徑：一是清除受體動(dòng)物血中的特定補(bǔ)體，使供體器官不受補(bǔ)體攻擊。二是采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過克隆受體的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因，將這種基因轉(zhuǎn)移到供體動(dòng)物的基因組中，使其在心血管內(nèi)皮表達(dá)，以避免受體的排斥反應(yīng)。目前五十頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)4病毒性疾病把病毒基因?qū)雱?dòng)物并制成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可研究這些病毒基因在宿主動(dòng)物引起的病理變化，從而探討其發(fā)病機(jī)理和治療路線。這是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)提供的又一條獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)體系。

目前五十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)5建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型理想的動(dòng)物模型，可以模擬人類疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，并為測試各種可能的治療方案提供一個(gè)統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。用于建立遺傳病動(dòng)物模型，研究單個(gè)基因在遺傳中的作用，研究藥物干預(yù)后動(dòng)物反應(yīng)機(jī)理等。目前五十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)基因激活表達(dá)生物發(fā)光研究者可通過觀察動(dòng)物模型的生物發(fā)光，判斷靶基因是否表達(dá)，即基因的“開”“關(guān)”現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型原理目前五十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（Vascularendothelialcellgrowthfactorreceptor2,VEGFR2）是VEGF的同源受體，VEGF在血管生成過程中分泌。Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用從小鼠VEGFR2基因啟動(dòng)子及內(nèi)皮細(xì)胞特異的增強(qiáng)子共4.5kb，以驅(qū)動(dòng)熒光素酶表達(dá)。

目前五十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)通過觀察發(fā)育過程中,VEGFR2-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠的VEGFR2表達(dá)逐漸降低,研究生物體發(fā)育過程信號強(qiáng)度目前五十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)已知，VEGFR2啟動(dòng)子活性在腫瘤壞死區(qū)域的血管內(nèi)皮細(xì)胞中可被上調(diào)。Vegfr2-luc報(bào)告基因的活性可在皮膚創(chuàng)傷治愈過程中被誘導(dǎo)及在腫瘤特異的新血管形成中有潛在功能。VEGFR-2在傷口愈合過程中的誘導(dǎo)表達(dá)生物發(fā)光強(qiáng)度目前五十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)科學(xué)家培育的小鼠“乙肝病毒攜帶者”聞?dòng)衩吩菏?，培育轉(zhuǎn)“中國特色”的乙肝B型病毒基因小鼠，已穩(wěn)定繁殖了7代，可持續(xù)表達(dá)乙肝病毒表面抗原。這一動(dòng)物模型的建立，對研究和治療我國為數(shù)巨大的乙肝病毒攜帶者具有重要意義?！巴剖蠹叭恕?，身價(jià)不菲的黑猩猩。乙肝病毒分為7種不同亞型，我國以B型、C型居多。目前五十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十九點(diǎn)三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在畜牧漁業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

(一)提高動(dòng)物的抗逆性

抗凍、耐低溶解氧、抗病毒等。(二)提高動(dòng)物的產(chǎn)量超級小鼠、超級魚等。目前五十八