帕金森動(dòng)物模型

帕金森動(dòng)物模型第一頁，共24頁。帕金森及動(dòng)物模型簡介帕金森動(dòng)物模型制備模型效果評(píng)價(jià)目錄第二頁，共24頁。帕金森及動(dòng)物模型簡介帕金森動(dòng)物模型制備模型效果評(píng)價(jià)目錄第一部分簡介總體概況第三頁，共24頁。

帕金森

簡介調(diào)研方法第一部分

帕金森是繼阿耳茨海默?。ɡ夏臧V呆癥）后第二大普遍的老化大腦的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病。1817年Jamesparkinson描述為震顫麻痹。引起該疾病運(yùn)動(dòng)癥狀主要是因?yàn)榧y狀體內(nèi)多巴胺減少從而導(dǎo)致黑質(zhì)密致部實(shí)質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元逐步衰退。第四頁，共24頁。

病理第一部分

PD的癥狀是黑質(zhì)密致部區(qū)域的染色多巴胺分泌細(xì)胞減少繼發(fā)分泌的黑色素減少產(chǎn)生的結(jié)果。PS：黑質(zhì):在大腦腳底與中腦被蓋之間有一大的灰質(zhì)團(tuán)塊是黑質(zhì)，見于中腦全長。黑質(zhì)細(xì)胞富含黑色素，是腦內(nèi)合成多巴胺的主要核團(tuán)。黑質(zhì)主要與端腦的新紋狀體(尾狀核和殼核)有往返纖維聯(lián)系。由于某些原因使黑質(zhì)細(xì)胞變性，多巴胺合成減少，是引起震顫麻痹(Parkinson病)的主要病因。在正常生理狀態(tài)下，黑質(zhì)是調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)的重要中樞。第五頁，共24頁。

黑質(zhì)

紋狀體調(diào)研方法第一部分紋狀體：殼核和尾狀核通過大量條紋狀細(xì)胞橋互相連接，所以得名紋狀體。根據(jù)發(fā)生的早晚可分為新、舊紋狀體，新紋狀體指豆?fàn)詈说臍ず臀矤詈?，舊紋狀體指蒼白球，紋狀體屬錐體外系的結(jié)構(gòu)，與骨骼肌的活動(dòng)有關(guān)。新紋狀體：

在發(fā)生學(xué)上比較年輕，包括尾狀核及殼核，它們起源于端腦。在這兩個(gè)神經(jīng)細(xì)胞團(tuán)中，含有大量的小細(xì)胞和較少的大細(xì)胞。小細(xì)胞接受來自大腦皮層各部以及來自丘腦的神經(jīng)，因此，新紋狀體直接受到大腦皮層的影響，而且還間接地受到通過丘腦傳來的小腦以及其它錐體外系的影響。大細(xì)胞發(fā)出的傳出纖維到達(dá)同側(cè)的蒼白球。目前已知，新紋狀體與維持機(jī)體的固定姿勢有關(guān)。大量的臨床病理資料證明，尾狀核頭部的變性、萎縮，可出現(xiàn)舞蹈樣動(dòng)作（如慢性進(jìn)行性舞蹈?。?；殼核的病變則與臨床所見的手足徐動(dòng)癥、肝豆?fàn)詈俗冃?、扭轉(zhuǎn)痙攣、舞蹈病等不自主運(yùn)動(dòng)有關(guān)。舊紋狀體：系指蒼白球。它起源于間腦，進(jìn)化上比較古老，內(nèi)含大細(xì)胞，除接受同側(cè)新紋狀體來的纖維以外，還接受來自丘腦和從大腦皮層來的纖維。由它發(fā)出的纖維主要是蒼白球丘－丘腦束，一部分纖維分別向下傳到丘腦底核、黑質(zhì)。舊紋狀體被視為錐體外系中的一個(gè)重要傳出中間站。已經(jīng)證明，蒼白球的功能與肢體的肌張力姿勢反射有關(guān)。帕金森病患者到了中晚期幾乎都有蒼白球的變性。第六頁，共24頁。

癥狀調(diào)研方法第一部分

PD可見兩種癥狀1、非運(yùn)動(dòng)癥狀情緒障礙認(rèn)識(shí)障礙睡眠障礙感覺障礙2、運(yùn)動(dòng)癥狀震顫僵直運(yùn)動(dòng)過慢/運(yùn)動(dòng)不能姿勢不穩(wěn)定其他癥狀包括步態(tài)和姿勢障礙拖著腳走慌張步態(tài)步態(tài)凍結(jié)（無法移動(dòng)）語言和吞咽障礙發(fā)聲過弱語言倉促流涎吞咽困難第七頁，共24頁。

帕金森

模型簡介調(diào)研方法第一部分

帕金森動(dòng)物模型分類①魚藤酮優(yōu)點(diǎn)：1、發(fā)病因素與流行病學(xué)相符2、復(fù)制了PD患者大多數(shù)LB的形成運(yùn)動(dòng)及病理特征

缺點(diǎn)：1、非特異性損傷及外周器官毒性2、存活率低

機(jī)制：氧化損傷

方法：大鼠顱內(nèi)注射12ug/只（黑質(zhì)）②MPTP

缺點(diǎn)：1、制劑依賴型可逆模型2、必須依賴左旋多巴存活

機(jī)制：MPTP在黒質(zhì)細(xì)胞內(nèi)脫氫生成MPP+離子，

這種離子抑制線粒體復(fù)合酶，使該細(xì)胞死亡③6-OHDA

機(jī)制：引起特異性幾茶酚胺能神經(jīng)元退行性變

方法：1、雙側(cè)注射：

優(yōu)點(diǎn)：成功率高缺點(diǎn)：往往因吞咽障礙、缺乏渴感、運(yùn)動(dòng)不能而死亡2、單側(cè)注射：成功率：16ug＞8ug&4ug組,注射速度1ug/min,留置5min

誘導(dǎo)劑：阿撲嗎啡0.2~0.5mg/kg

判斷依據(jù)：共記錄30min，若轉(zhuǎn)圈數(shù)＞7r/min或210r/30min則合格

第八頁，共24頁。第一部分簡介模型制備第二部分第九頁，共24頁。

模型制備

動(dòng)物選擇第二部分Wistar大鼠SD大鼠8周♂鼠290g第十頁，共24頁。

術(shù)前準(zhǔn)備第二部分1、儀器準(zhǔn)備大鼠腦立體定位儀微量注射器鉆孔器2、手術(shù)器材：15%雙氧水、戊巴比妥鈉、75%乙醇、碘伏手術(shù)剪刀、鑷子、手術(shù)縫合線、醫(yī)用棉球、抗生素第十一頁，共24頁。

開顱前第二部分1、↓麻醉：20mg/只（290g）

戊巴比妥鈉麻醉2、↓頭部剃毛3、固定頭顱：先將一側(cè)耳棒輕輕插入外耳道，碰到骨性外耳道底后固定耳棒，繼之同樣插入固定另一耳棒，檢查大鼠頭部固定是否穩(wěn)定，松斜，兩側(cè)耳棒刻度是否對(duì)稱，輕移耳棒使兩側(cè)刻度一致頭位完全居中，再次固定耳棒；固定上頜：將大鼠的上門牙塞進(jìn)上齒固定板的槽內(nèi)，旋緊螺絲。從各方向推壓動(dòng)物頭部，均不應(yīng)出現(xiàn)移動(dòng)。通過定位針的測量調(diào)節(jié)前后囟在同一矢狀線上，并使前囟(Bregma)和后囟(Lambda)盡量處于同一水平面上，檢查是否固定好的標(biāo)準(zhǔn)主要有三個(gè)：鼻對(duì)正中、頭部不動(dòng)、提尾不掉第十二頁，共24頁。

頭部切口第二部分3、頭部切口用手術(shù)刀片沿顱骨正中線切開，再以15%H2O2去除結(jié)締組織（H2O2還可以起到止血的作用），以清晰看到顱骨表面縫隙為宜。第十三頁，共24頁。第二部分

定位圖譜

確定注射位點(diǎn)冠狀切面第十四頁，共24頁。第二部分

定位圖譜

確定注射位點(diǎn)矢狀切面第十五頁，共24頁。第二部分

定位圖譜

確定注射位點(diǎn)水平切面第十六頁，共24頁。第二部分

核團(tuán)定位4、核團(tuán)定位首先，在腦定位儀上讀出Bregma坐標(biāo)（AP,ML,DV）,再根據(jù)文獻(xiàn)上尋找到的目標(biāo)靶核團(tuán)坐標(biāo)（這些坐標(biāo)都是基于Bregma坐標(biāo)為0,0,0），換算出此核團(tuán)在顱骨表面的實(shí)際坐標(biāo)。第十七頁，共24頁。

鉆孔第二部分5.鉆孔

1、利用定位儀，保證前囟(Bregma，X=0,Y=0,Z=0)和后囟(Lambda)處于同一水平面上(X、Z值相差皆小于0.1)；2、腦內(nèi)核團(tuán)定位，根據(jù)腦圖譜，確定待注射腦區(qū)的位置參數(shù)，包含離Bregma和Lambda點(diǎn)的距離以及核團(tuán)深度，例如（注：包新民圖譜）內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medialPrefrontalCortex,mPFC)的位置是：門齒線（imcisorbar）向下2.4mm傾斜;Bregma向后3.7mm和4.4mm,中線往右1.7mm和1.2mm，Bregma向下7.5mm；3、利用定位儀找到要注射6-OHDA的位置，用Marker筆或定位針在顱骨上做好標(biāo)記；4、小心地用顱骨鉆頭（或牙科鉆）在注射位點(diǎn)處輕磨顱骨，將顱骨慢慢打薄，當(dāng)顱骨出現(xiàn)裂縫的時(shí)候（至硬腦膜），用醫(yī)用注射器的針頭小心挑破，防止損傷，如果在此過程中有出血，可以用很小的醫(yī)藥棉球拉成長條形將血吸走，鉆孔時(shí)一定要控制好，否則很容易在鉆通顱骨后一不小心鉆頭進(jìn)入腦組織，造成嚴(yán)重?fù)p傷第十八頁，共24頁。

6-OHDA

注射第二部分6.6-OHDA注射1)用PBS沖洗微量注射器(5μl規(guī)格)3-5次；2)4ug/ul6-OHDA溶解于0.2%Vc（必須當(dāng)天配置），3)將微量注射泵，微量注射器組裝好，置于鉆好的孔上方，針尖與顱骨平行(Z=0)，微調(diào)注射器位置使之與之前鉆孔時(shí)位置相同；4)根據(jù)定好的深度將注射針緩慢下降以0.05μl/min的速度注射6-OHDA，每點(diǎn)注射3ul注射完畢后，將注射針停留在注射位置5min待6-OHDA擴(kuò)散，然后緩慢提針4mm，繼續(xù)留針5min后緩慢退針7)用PBS清洗微量注射器5次備用；8)注意注射過程中若有出血立刻用棉簽吸走，以免帶出6-OHDA第十九頁，共24頁。

縫合

抗感染第二部分7、縫合定位注射后縫合頭皮，即可完成腦立體定位注射。8、術(shù)后抗感染先鋒v50mg/kg肌肉注射或慶大霉素2ml，兌100ml鹽水中，每只大鼠0.5m第二十頁，共24頁。模型制作第二部分模型效果評(píng)價(jià)第三