HE染色方法與步驟吐血整理

HE染色試劑配置A：0.5~1%的伊紅酒精溶液：稱取伊紅Y0.5~1g，加少量蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工業(yè)酒精，如果不怕浪費(fèi)，用無水乙醇配制也可）100毫升溶解。B：蘇木素染液配方：(配制3000ml，可按比列減少)蘇木精6g無水乙醇100ml硫酸鋁鉀150g蒸餾水2000ml碘酸鈉1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：將蘇木素溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶解后將甘油傾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸鈉。C：1%鹽酸酒精分化液：將1毫升濃鹽酸加入99毫升70%酒精中即可。染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：無水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸餾水5min(8)蘇木精液染色5min(9)流水稍洗去蘇木精液1-3s(10)1%鹽酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸餾水過洗1-2s(13)0.5%伊紅液染色1-3min(14)蒸餾水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)無水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性樹膠封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步?jīng)_水時(shí)間需延長(zhǎng)至20-30min。②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用無水乙醇。*冷凍切片HE染色步驟：（1）冰凍切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）蘇木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去蘇木精液5～10s（5）1%鹽酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促藍(lán)液返藍(lán)5～10s（8）流水沖洗15～30s（9）0.5%曙紅液染色30～60s（10）蒸餾水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）無水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性樹膠封固。注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用無水乙醇。染色結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈深淺不一的紅色。4．12切片脫水透明切片經(jīng)HE染色后，要徹底脫水透明，才能用中性樹膠封蓋。如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下觀察模糊不清，且容易褪色。切片1-2級(jí)無水乙醇脫水，也可使用石碳酸二甲苯進(jìn)行脫水。石碳酸有較強(qiáng)脫水能力，但長(zhǎng)時(shí)間可使切片脫色，因此要經(jīng)過多次二甲苯以使石碳酸完全除去。5.H-E染色評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：（1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均勻，無皺褶無刀痕；（2）染色核漿分明，紅藍(lán)適度，透明潔凈，封裱美觀。4染色結(jié)果編輯細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。著色情況與組織或細(xì)胞的種類有關(guān)，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，很多細(xì)胞在新生時(shí)期胞漿對(duì)伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當(dāng)其衰老時(shí)或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時(shí)，伊紅著色由淺變深。8。梯度酒精脫水之后，封片，拍照。免疫組化SP法步驟：SP(streptavidin-perosidase)法,即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法.按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)；按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。一般的sp法步驟啊,具體如下：1.烤片，68℃，20分鐘,2.常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯I20min--二甲苯II20min--100%酒精I(xiàn)10min--100%II10min--95%5min--80%5min--70%5min3.阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS沖洗3X5min；4.抗原修復(fù):置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5min。5.正常羊血清工作液封閉，37℃10min，傾去勿洗.6.滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3X5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）；滴加生物素標(biāo)記二抗,37℃孵育30min,PBS沖洗3X5min;7.滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min,PBS沖洗3X5min;8.DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。免疫組化（Elivision二步法）：（1）石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。（2）取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。(注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定)（3）每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。（4）除去PBS液，每張切片加1滴相應(yīng)的第一抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)），室溫下孵育2小時(shí)。（5）PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。（6）除去PBS液，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物（試劑B），室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’（7）除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液，顯微鏡下觀察5分鐘。（8）蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。注：即用型第二代免疫組化Elivisionplus廣譜試劑盒，購(gòu)自福州脈新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。包括：生物素化抗兔二抗、親和素（ReagentA）、生物素－辣根過氧化物酶（ReagentB）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）脫鈣劑的配置10%EDTA的配置：1)

加熱水浴鍋到65℃2)

稱取NaOH11g