免疫組織化學(xué)技術(shù)講義

免組化的念免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑熒光素酶金離子同素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗多肽和蛋白)對進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。免組實(shí)所的織細(xì)標(biāo)有些實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類包括石蠟切理片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用基本的方法對于組織形態(tài)保存好且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察能期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。石切為么做原復(fù)有些法石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵甲而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露固時分子之間所形成的交聯(lián)破壞復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法壓加熱法酶化法水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01mol/L的檬鹽緩沖液。免組常的色法哪？根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法疫酶標(biāo)法親和組織化學(xué)法后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法種方法敏感性更高利微量抗原(抗體在胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物—抗物素染色法最常?？沟拇婵贵w儲存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成有聚丙烯酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低應(yīng)加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在℃℃條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)?？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于℃條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對避免用高溫快速解凍細(xì)菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果將染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入疊鈉?？菇?jīng)真空冷凍干燥后置-℃以下可保存年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷

凍保存，少數(shù)抗體可能會丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，可4下保存數(shù)月。多賴酸液Poly-L-Lysine）Cat.No.:SGP8920inwaterStorage:℃0.01%,多聚賴氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產(chǎn)生較強(qiáng)的黏合力。適用組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰切片，細(xì)胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實(shí)驗(yàn)操作過程中組織掉片。也可用于細(xì)胞培養(yǎng)，增加細(xì)胞貼壁能力。[使用說免學(xué)操作步驟（可直接在玻片上涂布）．滅的1:10釋該多聚賴氨酸溶液。．用前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-26℃．將片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液分。意增加時間不會提高包被效果。．在60℃烘箱1小時干燥，或室溫18-26過夜干燥待用。[注意．每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液包被的玻片張過張子將影響其黏合力。．用前的玻片必須保持清潔。必要時用含1%的70%醇溶液來清洗。．釋的多聚賴氨酸溶液要放在℃，至少在3月內(nèi)是穩(wěn)定的。．用的稀釋液要過濾，若出現(xiàn)渾濁或長菌要丟棄。[訂貨信息]￥100/免疫組操作規(guī)程（、器備1不鋼高壓鍋或爐或醫(yī)用微波爐；）水浴鍋

（、劑PBS緩沖（～7.44.3mmol/L，KH2PO4）檸酸鹽緩沖液CB，1000ml檬三，檸檬酸0.4gEDTA沖液pH8.0中溶解，10NaOH調(diào)pH8.0,加水至。）1mol/L的TBS緩液pH8.0水溶解121gTris堿用1N的HCl調(diào)至加水至1000ml酶化液：a胰蛋白酶液0.1%CaCl2(pH7.8)配制。胃白酶液：用0.1N的HCl配制。）3%甲醇H2O2溶：用和80%醇溶液配制。）封裱劑：、甘油和碳鹽緩沖液（～9.5）等量混合；b油和TBS(配制?！m用于熒光顯微鏡標(biāo)本～7.4適合于光學(xué)顯微鏡本。（、作程、蠟水脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放6分鐘或0恒溫箱中烘烤20分鐘。）組織芯片置于二甲苯中浸1分鐘，更換二甲苯后再浸1分鐘；）無水乙醇中浸5鐘；）95%醇中浸泡5鐘；）70%醇中浸泡5鐘；、原復(fù)用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。）抗原熱修復(fù)（1高壓熱修復(fù)在水中加EDTA（）枸櫞酸緩沖溶液上不銹鋼高壓鍋的蓋子但進(jìn)鎖定將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。（2）煮沸熱修復(fù)電爐或者水浴鍋加熱.01M枸櫞鈉緩沖溶液）95℃左右，放

入組織芯片加熱10~15分鐘（3微波熱修復(fù)在微爐里加.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間分，反1次。適用的抗原有AR，Bax，，C-fos，X-jun，C-kitE-cadherinChromograninCyclinERHeatproteinHPVKi-67，MDMZp53，p34，P-glycoproteinPKC，，Rb，Ⅱ等是以高溫壓常規(guī)固的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)或復(fù)原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術(shù)手段和白水解交聯(lián)過程中氨基酸側(cè)鏈上的某些基團(tuán)(抗原決定簇如咪唑、吲哚等基團(tuán)受到影響，通過20高溫或強(qiáng)堿處理后可使交聯(lián)打開。）酶消化方法常0胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱℃，切片也預(yù)熱至37消時間約為5~30鐘胃白酶消化3℃時間3分鐘適用于被固定遮避的抗原，其中有ComplementC-erB-2等、疫織學(xué)色法）脫蠟、水化；2洗～3各分鐘；3（甲醇）滴加TMA上，室溫靜0鐘；4洗～3各分鐘；5抗原修復(fù)；6洗～3各分鐘；7滴加正常山羊血清封閉液,室溫2分鐘。甩去多余液體。8滴加Ⅰμl，室溫靜小或4℃過夜或者3℃小時。94℃過夜后需在37復(fù)5分鐘。10PBS洗次各分鐘；11滴加Ⅱ～μl室溫靜置，或3℃1小時；12II抗中可加0.05%的。13PBS洗次各分鐘；14顯色5～分，在顯微鏡下掌握染色程；15PBS或來水沖10分鐘；16蘇木精復(fù)2分鐘，鹽酸酒精分化；

17自來水沖～分鐘；18脫水、透明、封片、鏡檢。SABC脫蠟、水化。洗兩次分鐘。用蒸餾水或BS置新鮮的%H2O2室溫封閉～10鐘，蒸餾水次抗原修復(fù)。洗5鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室2分鐘。甩去多余液體。滴加Ⅰ,室小時或者4℃夜或者3℃1時（℃過夜后在℃復(fù)溫5鐘洗三次每2分鐘。滴加生物素化二,20～℃分。10)PBC洗3次每次分鐘。11)滴加試ABC，20℃～3720分鐘。12)PBS4每次5分鐘。13)DAB顯：顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程蒸餾水洗。蘇木素復(fù)分鐘、鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。免組實(shí)驗(yàn)程的要和巧．固：最好用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。Bouin固液：飽和苦味酸750ml甲醛，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長期保存。液即高碘酸鈉賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。．組脫水，透明時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。．切時展片：有組織在切片后難以在水中展開，這時可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?/p>

．烤片：6030分或℃過夜溫太高或時間太長，抗原容易丟失。．蠟塊及切片的保存：最好在℃保存．片問題：Poly-L-Lysine(多賴氨酸)為前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的聚賴氨酸溶液可按1:10稀成的作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理APES和Poly-L-Lysine）切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放A：丙溶液中浸泡3分，晾干，即可進(jìn)行下一步．滅活內(nèi)源性酶系：雙氧水滅活A(yù)P系統(tǒng)：3%HAc滅。．露抗原：對于石蠟切片的免疫化實(shí)驗(yàn)時，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇增加疫組化染色的強(qiáng)不同抗體的最佳修復(fù)液請參閱體說明書)。對于不同的組織，不同的抗原，不同抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。．閉：在山羊血清封閉，非特異染色仍然較強(qiáng)時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉．抗體稀釋：應(yīng)遵現(xiàn)現(xiàn)”原則，對于PBS稀的抗體一定要當(dāng)天使用。11．背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1的洗特別是在顯色之前要多洗。．返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（）或Na2HPO4的和溶液返藍(lán)。．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。DAB法示氧物〔理過氧化物酶分解的過程中，下面反應(yīng)不直接發(fā)生AH2（供氫體→A供氫體的氧化物實(shí)可知，稱為復(fù)合物ⅠⅡ、Ⅲ、的—底物（受氫體復(fù)體生成在合體最分解為酶和水時，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團(tuán)的發(fā)色物質(zhì)，如奈酚和聯(lián)苯胺。免組染步（法為）溶液的配置：0.1MPBS2000ml：NaCL18g,NaHPO·2H0.8g,Na12H共份222.檸酸鹽緩沖液：貯存液：檸酸溶液A21.01g檬酸1L蒸餾水

0.1M檸酸三鈉溶液B檸酸三鈉+1L蒸水工作液：9mlA液41mlB液+蒸水0.01M檸檬酸鹽緩沖液3.0.03%HO-甲醇：30%HO+400ml純醇→充分混勻甘：80ml純油+320ml蒸水稀抗體1︰001︰00，1︰6（臨用前配）酒的配置染步：步載片箱中60′。二苯Ⅰ℃′水浴箱中，甲苯Ⅱ，室溫15。脫，100%→95%→→75%精，每級均為′。蒸水沖洗，PBS′﹡1微爐修復(fù)抗原：0.01M檸檬酸鹽緩沖液，℃肺′心腎′PBS′*30.03%HO-甲醇室溫′PBS沖洗PBS3*3，甩干或紙巾吸去多余液體（勿到組織劃線。blocksolution封閉抗原，室溫10。10.傾封閉液，不洗，滴加抗60ul℃夜37～2h。11.沖，′。12.除，滴加A增強(qiáng)劑，室溫25。13.洗，3′。14.除，滴加B劑室溫′。15.洗，3′。同時配置顯劑16.除，DAB顯10（在顯微鏡下觀察染色程度控制染色時間餾水洗。17.復(fù)：目素勻加，′′，蒸餾水沖℃溫水泡半分鐘。18.脫：酒精→→95%→100%3級′。19.透：甲苯Ⅰ′，二甲苯Ⅱ′。18.封：性樹脂，加蓋玻片（組織部位切勿殘留小氣泡℃烘。結(jié)：褐反產(chǎn)代抗X的定。拍

更樣品時，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動！所有的樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡，來回切換物鏡。數(shù)相機(jī)必須設(shè)置為手動曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機(jī)的自動白平衡功能給關(guān)掉免組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色量其灰度應(yīng)在左如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色一般是相機(jī)自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫