基因操作常規(guī)技術詳解演示文稿

基因操作常規(guī)技術詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點（優(yōu)選）基因操作常規(guī)技術目前二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.1核酸的分離與檢測gDNA的分離質(zhì)粒DNARNA的分離目前三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點細胞破碎去蛋白DNA沉淀4.1.1gDNA的提取SDS法酚抽提法CTAB法目前四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點CTAB法高鹽:溶解低鹽:沉淀蛋白、多糖分離NaAc-70%alc目前五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點如何保持CS-DNA的完整性?物理降解內(nèi)源DNase＞pH7目前六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.1.2質(zhì)粒DNA的分離純化拓撲學的差異gDNA大,易解旋質(zhì)粒小,ccc狀態(tài)目前七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs1.CsCl密度梯度超離心密度梯度沉降=擴散浮力密度差樣品+EB樣品BD=該位置上的CsCl密度位置分布:沉降速度、MW及離心時間目前八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點SolI;II;IIIcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA2.堿變性法pH12:變性程度pH7:復性速度離心:收集?目前九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點3.沸水浴法加酶破壁沸水浴40s離心Eth沉淀

目前十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.1.3RNA的提取原理酚-異硫氰酸胍目前十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點防止RNA降解的措施DEPC處理RNasin專用無菌臺器皿、手套、口罩低溫操作目前十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.1.4核酸質(zhì)量檢測紫外光譜法凝膠電泳法[ssDNA]=33(A260A310)

稀釋[dsDNA]=50(A260A310)

稀釋[ssRNA]=40(A260A310)

稀釋熒光分析法二苯胺顯色目前十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點分子篩;電荷效應UV→EB→熒光凝膠電泳技術目前十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點凝膠成像系統(tǒng)目前十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點Rf、分辨力的影響因素大小,構型gel濃度電壓、時間buffer凝膠濃度片段大小/kb0.35600.61100.70.8201.00.581.20.40.12目前十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點緩沖液及其pHTBE:緩沖力大?長:TAE﹥TBE?短:TAE分辨力低如何防止pH和離子強度改變?目前十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點RNA的檢測A260變性膠28S→4.5kb18S→2.1kb目前十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點PAGE尿素buffer:0.51TBE同位素或熒光標記測序、多態(tài)性分析目前二十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點＞40kb:Rf與分子大小無關交替改變的電場,線團→束狀脈沖場凝膠電泳改變形狀所需時間不同膠孔中摩擦力不同A-+AB-+B目前二十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖目前二十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前二十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng)旋轉膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+目前二十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點影響分辨率的因素脈沖時間(0.1s-1000s):長脈沖,大片段電壓:場強↑,最大片段范圍↑電場夾角:110–120溫度:4℃

目前二十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.2分子雜交技術SouthernblotNorthernblotWesternblotdotblotFISH菌落原位雜交目前二十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點

探針與探針標記寡核苷酸片段ssords足夠長度不含互補區(qū)目前二十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

Mg2+5dNTP5pppdA(-32P-dATP)5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

DNaseIDNApolI1.探針的標記目前二十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點隨機引物標記目前二十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點5末端標記5

HOOH3

OH5

T4-PNKMg2+

pppATP

(-32P-dATP)5pp5

3

HO3

HOOH3

目前三十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點2.

標記物及其檢測標記物及性質(zhì)標記方法雜交體檢測法地高辛:DIGRPL酶標抗體-底物顯色生物素:Bio-16-dUTPNT,TL,PCR酶標親合素顯色熒光素:羅丹明,FITC合成法熒光顯微鏡放射性標記非放射性目前三十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點地高辛系統(tǒng)標記dUTP-連接臂-甾醇半抗原DIG抗體-顯色酶交聯(lián)復合物目前三十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前三十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點生物素標記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin

Avidin

烷烴連接臂生色底物顏色產(chǎn)物目前三十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前三十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點熒光素標記GCTTGAGCAGTAACCTG熒光素Biotin

Avidin烷烴連接臂目前三十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前三十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點

Southern雜交質(zhì)粒鑒定、基因位置、分子診斷酶切和電泳法可以嗎?目前三十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前三十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.2.3Northern雜交樣品,電泳,探針?不宜堿變性?勿低鹽buffer洗膜?膠中無EB目前四十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.2.4Western雜交電泳,印跡,免疫學主要步驟SDS,blot雜交(AP或HRP)目前四十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點Semi-drytransfersystem目前四十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前四十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點斑點雜交目前四十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點Allele-specificoligonucleotide(ASO)dot-blothybridizationcanidentifyindividualswiththesicklecellmutation.Theschematicdot-blotattopshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthenormal-globinallele(A-ASO).Theresultsarepositive(filledcircle)fornormalindividualsandforheterozygotesbutnegativeforsicklecellhomozygotes(dashed,unfilledcircle).Thedot-blotatthebottomshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthesicklecell-globinallele(S-ASO),andinthiscasetheresultsarepositiveforthesicklecellhomozygotesandheterozygotesbutnegativefornormalindividuals.TheA-andS-ASOweredesignedtobe19nucleotideslonginthiscasechosenfromcodons3to9ofrespectivelythesenseAandSglobingenesequencessurroundingthesicklecellmutationsite.Thelatterisasinglenucleotidesubstitution(A→T)atcodon6inthe-globingene,resultinginaGAG(Glu)→GTG(Val)substitution(seemiddlesequences).目前四十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點制片探針制備雜交鏡檢、拍照

FISH雜交目前四十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點基因檢測新技術使膀胱癌確診提前“FISH技術在膀胱癌檢測中的臨床應用研究”,為期2年,對4809例患者開展了臨床檢測實驗.結果:比臨床常規(guī)檢查,膀胱癌確診提前36m雜交探針和檢測試劑已實現(xiàn)國產(chǎn)化,質(zhì)量穩(wěn)定可靠,價格比進口產(chǎn)品降低近七成目前四十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.2.7菌落(斑)原位雜交陽性重組子檢測菌落→?文庫菌斑→?文庫目前四十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.3PCR擴增技術鏈式反應動物單拷貝GSinceitsdiscoveryin1983thepolymerasechainreactionhasrevolutionizedmolecularbiology.Today,newformsofPCRandtherelatedtechniquesofcloningarefindingnewapplicationsatthecuttingedgeofbiomedicine.

目前四十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.3.1基本原理離體合成幾何級數(shù)平臺效應目前五十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.3.2反應體系模板引物Taq酶dNTPs緩沖液DNAormRNA模板純度數(shù)量目前五十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點引物的設計1630nt,GC含量連續(xù)互補堿基﹤3

3?正確配對5?可被修飾簡并引物目前五十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點耐熱的DNApolTaq酶Pfu酶?3→5校讀?高保真目前五十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點緩沖液pH、離子強度Mg2+↓,酶活↓Mg2+↑,非特異↑引物退火目前五十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.3.2基本過程變性退火延伸目前五十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點擴增精確性的影響因素引物:1mol/LdNTPs:20~200mol/LMg+2:0.5~2.5mmol/Lhotstart目前五十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.3.3PCR技術的改進nestedPCRinversePCRanchoredPCRRT-PCRinsituPCR實時定量PCR目前五十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點1.巢式PCR嵌套引物外引物內(nèi)引物目前五十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點2.

反向PCRX、Y未知序列酶R消化環(huán)化再酶切擴增目前五十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點反向PCR的特點難選適當?shù)南拗泼笖U增的長度有限自身環(huán)化效率低目前六十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點3.AnchoredPCR?錨定引物A?擴增?產(chǎn)物鑒定目前六十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點特點擴增未知序列無需酶切及連接操作簡單特異性高目前六十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.RT-PCR目前六十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點5.原位PCR原位擴增,雜交,定量?不需抽提模板?靈敏度高100?病毒檢測、腫瘤發(fā)生率目前六十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測,實現(xiàn)對起始模板定量分析的方法6.實時熒光定量PCR目前六十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點FRET技術;熒光標記探針擴增、雜交、光譜、實時檢測熒光信號積累,起始模板量熒光定量PCR的原理目前六十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點起點定量與終點定量起點天然重現(xiàn)性好終點加工誤差大目前六十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點熒光擴增曲線的三個階段背景信號階段指數(shù)擴增平臺期目前六十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點幾個參數(shù)的確定①臨界點②循環(huán)數(shù)(Ct)③標準曲線基線→閾值→Ct值→DNA0閾值缺省:3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍目前六十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點Log濃度與循環(huán)數(shù)的關系起始數(shù)越多,Ct值越小標準曲線→樣品Ct值→初始模板量目前七十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點DNA產(chǎn)物的熒光標記非特異性熒光標記SYBRGreenI特異性熒光標記TaqMan探針分子信標目前七十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點①SYBRGreen法只有和dsDNA結合后才發(fā)熒光變性時,DNA雙鏈分開,無熒光目前七十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點延伸結束階段采集熒光信號與非特異的dsDNA結合發(fā)光,必須在反應結束時做融解曲線分析目前七十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點SYBRGreen融解曲線分析目前七十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點PCR反應體系的建立及優(yōu)化染料:太高抑制Taq酶活性;太低,熒光信號太弱,不易檢測引物:擴增有雜帶,定量不準Mg2+:1.5mM,減少非特異性產(chǎn)物T&T:由酶和引物決定目前七十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點SYBRGreen法優(yōu)缺點對模板無選擇性使用方便,無需探針靈敏;便宜非特異性結合,產(chǎn)生假陽性對引物特異性要求較高目前七十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點5-R;3熒光淬滅基團(Q)探針完整,R發(fā)射的熒光能量被Q吸收,無熒光;R與Q分開,發(fā)熒光Taq酶:5→3外切酶活性②TaqMan法目前七十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點TaqMan水解型雜交探針原理當一個熒光分子(供體)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊時,供體熒光分子自身的熒光強度衰減,FRET目前七十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點熒光共振能量轉移目前七十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點擴增1條DNA→釋放1個熒光分子→熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物同步目前八十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點TaqMan法PCR反應的建立PP的設計:探針Tm為70℃,<30bp,5’非G;引物Tm為60℃反應參數(shù):

95℃3,94℃15s,60℃60s,40循環(huán)PP優(yōu)化:獲得最小Ct值,最大信號/背景比值primer:

50-900nM;probe:50-250nM目前八十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點TaqMan法優(yōu)缺點對目標序列的高特異性引物設計相對簡單重復性比較好只適合一個特定的目標委托公司標記,價格較高目前八十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點③分子信標與擴增產(chǎn)物結合產(chǎn)生熒光,信號的強弱→靶序列的多少目前八十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點發(fā)夾型熒光探針R與Q接近,產(chǎn)生FRET探針-模板配對,構象改變R與Q分離→熒光目前八十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點熒光定量PCR的特點實時檢測特異性強定量精確無需跑膠目前八十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.4DNA測序化學降解法末端終止法目前八十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點G反應:DMS使G、A甲基化G+A:哌啶使G斷裂T+C:肼使嘧啶環(huán)斷開,哌啶除去堿基C反應:高鹽下,僅C與肼反應,C末端

1.Maxam-Gilbert化學降解法目前八十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前八十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點距標記末端250nt非酶促合成測序,無需引物對合成的寡核苷酸測序蛋白質(zhì)與DNA的相互作用特點目前八十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點2.Sanger酶學法目前九十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點基本步驟模板純化測序反應模板,引物,Pol,

dNTPs(dd)4個反應→4組產(chǎn)物PAGE→自顯影→X光片上樣電泳放射自顯影目前九十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前九十二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點測序與PCR的比較測序PCR引物1條1對合成線性指數(shù)底物dNTP和dddNTP產(chǎn)物系列長度片段1條帶目前九十三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點CAGTtemplateprimerdATP,dNTPpolymeraseterminator3.DNA全自動測序同位素標記熒光標記?單色熒光?多色熒光目前九十四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點時間長序列短污染大操作難放射自顯影膠圖目前九十五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前九十六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點多色熒光標記templateprimerdNTPpolymeraseterminatorCGTA目前九十七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點ABIPrism3100-Avant目前九十八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點遺傳分析儀的多種應用目前九十九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點基本步驟模板的純化與定量測序反應—PCR儀產(chǎn)物的純化與變性上樣電泳—測序儀結果分析目前一百頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點AutomatedDNAsequencingwithfluorescentlylabeledddNTP.(A)Thechainterminationreactionsarecarriedoutinasingletube,witheachddNTPlabeledwithadifferentfluorophore.Intheautomatedsequencer,thebandsintheelectrophoresisgelmovepastafluorescencedetector,whichidentifieswhichddNTPispresentineachband.Theinformationispassedtotheimagingsystem.(B)Theprintoutfromanautomatedsequencer.Thesequenceisrepresentedbyaseriesofpeaks,oneforeachnucleotideposition.Inthisexample,agreenpeakisan'A',blueis'C',blackis'G',andredis'T'.目前一百零一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前一百零二頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.DNA測序技術進展目前一百零三頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點傳統(tǒng)測序技術的缺陷及新進展序列不可能太長費時費力準確度不高結構復雜序列雜交法質(zhì)譜法DNA芯片法單分子法目前一百零四頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前一百零五頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.5DNA的定點誘變盒式取代切除;合成;轉化olig介導PCR誘變目前一百零六頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點olig片段退火合成轉化olig介導的誘變目前一百零七頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule目前一百零八頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點P

C

R

誘變目前一百零九頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點目前一百一十頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點4.6

DNA與蛋白質(zhì)互作分析Y2HsystemY1HsystemgelretardationassaysDNaseIfootprinting目前一百一十一頁\總數(shù)一百一十九頁\編于三點1.酵母雙雜交(Y2H)GAL4proteinBD與UAS結合AD激活lac