色譜分離技術(shù)簡介

生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)教學(xué)資源庫4.1色譜分離技術(shù)簡介4.色譜分離技術(shù)色譜分離技術(shù)簡介發(fā)展歷程1色譜的概念2色譜分離技術(shù)的特點(diǎn)3色譜分離技術(shù)的分類4色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語5色譜分離方法的選擇61903年，俄國植物學(xué)家茨維持在填充碳酸鈣柱中用以石油醚沖洗植物色素萃取物，得到各色區(qū)帶。1906年，茨維特在德國植物學(xué)雜志上發(fā)表文章正式命名為“色譜”。1931年，德國的Kuhn和Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離了胡蘿卜素。1940年，Martin和Synge提出液液分配色譜法。1941年，Martin和Synge提出用氣體代替液體作流動相的可能性,提出塔板理論。1952年，Janes和Martin發(fā)表從理論到實(shí)踐比較完整的氣液色譜方法,獲諾貝爾獎。1956年，VanDeemter提出描述色譜過程的“速率理論”。1957年，Golay開創(chuàng)了開管柱氣相色譜法。1960年中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐發(fā)展，液相色譜又開始活躍。60年代末期，把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。1970年中期以后，進(jìn)一步提高了儀器的自動化水平和分析精度。1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國際和國內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，如人類基因組計(jì)劃，蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等。發(fā)展歷程色譜的概念色譜也稱色層法、層析法利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差異，各組分以不同程度分布在固定相和流動相中，使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離。色譜分離技術(shù)的特點(diǎn)1.分離效率高2.分析速度快3.靈敏度高4.樣品用量少5.應(yīng)用范圍廣6.分離和測試一次完成7.易于自動化，可在工業(yè)流程中使用色譜分離技術(shù)的分類1.按分離原理吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法色譜分離技術(shù)的分類2.按流動相的物態(tài)氣相色譜法—以氣體作流動相液相色譜法—以液體作流動相超臨界色譜法—流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體色譜分離技術(shù)的分類3.按固定相的附著方式柱色譜法—固定相裝在圓柱管中紙色譜法—液體固定相涂在紙上薄層色譜法—固定相涂敷在玻璃或金屬板上色譜分離技術(shù)的分類4.按操作壓力低壓色譜法—操作壓力<0.5MPa中壓色譜法—操作壓力0.5～4.0MPa高壓色譜法—操作壓力4.0～40MPa色譜分離技術(shù)的分類5.按分離規(guī)模分析色譜——小于10mg半制備色譜——10~50mg制備色譜——0.1~10g工業(yè)生產(chǎn)色譜——大于10g色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語1.色譜圖試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動相進(jìn)入檢測器，檢測器將各組分的濃度（或質(zhì)量）的變化轉(zhuǎn)換為電壓（或電流）信號，由記錄儀記錄下來，所得到的電信號強(qiáng)度-時間曲線即濃度（或質(zhì)量）-時間曲線，稱為流出曲線，即色譜圖。色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語2.基線在操作條件下，色譜柱出口處沒有組分流出，僅有純流動相流過檢測器，此時的流出曲線稱為基線。使基線發(fā)生細(xì)小波動的現(xiàn)象稱為噪音，如空氣峰。基線反映了操作條件下，檢測器系統(tǒng)噪聲隨時間變化的波動情況，穩(wěn)定的基線應(yīng)是一條平行于橫坐標(biāo)的直線。色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語3.色譜峰當(dāng)樣品中的組分隨流動相流入檢測器時，檢測器的響應(yīng)信號大小隨時間變化所形成的峰形曲線稱為色譜峰，峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)的連接直線稱為峰底。色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語4.峰形正常的色譜流出曲線為對稱于峰尖的正態(tài)分布曲線，如圖(a)所示。但實(shí)際上，流出曲線并非完全對稱，不正常的色譜峰有拖尾峰和前伸峰，如圖(b)、(c)所示。

(a)(b)(c)

色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語5.保留時間（tR）從開始進(jìn)樣至柱出口處被測組分出現(xiàn)濃度最大值時所需的時間，稱為保留時間（tR）。保留時間（min）響應(yīng)值色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語6.死時間（t0）不被固定相滯留的組分（氣相色譜中如空氣、甲烷等），從開始進(jìn)樣到柱出口處出現(xiàn)濃度最大值時所需的時間稱為死時間（t0），其值等于流動相流經(jīng)色譜柱的時間。色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語7.死時間（tR′）扣除死時間后的保留時間稱為調(diào)整保留時間（或校正保留時間）（tR′）。調(diào)整保留時間可理解為組分在固定相中實(shí)際滯留的時間。

其定義式為：tR′=tR-t0色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語8.峰高與峰面積色譜峰頂點(diǎn)與峰底之間的垂直距離稱為峰高，用h表示；峰與峰底之間的面積稱為峰面積，用A表示，可作為定量分析的參數(shù)。色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語9.區(qū)域?qū)挾葮?biāo)準(zhǔn)偏差σ半高峰寬W1/2

峰寬W色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語9.分離度（R）

相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰底寬度平均值之比值，即：

式中，tR1、tR2——分別為組分1和2的保留時間(也可采用其它保留值)；W1、W2——分別為組分1和2的色譜峰的峰底寬度，與保留值的單位相同。色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語9.分離度（R）一般用R=1.5作為相鄰兩峰完全分離的標(biāo)志。色譜分離技術(shù)的常用術(shù)語10.柱效柱效是表達(dá)色譜柱性能的一個重要參數(shù)，可用塔板數(shù)N和塔板高度H表示。色譜分離方法的選擇生物大分子：由于分子量大、易失活以及具有生物專一親和性等