氨基酸總量的測(cè)定1

《生物產(chǎn)品的分析與檢驗(yàn)技術(shù)》項(xiàng)目六氨基酸的分析與檢驗(yàn)任務(wù)一氨基酸總量的測(cè)定氨基酸是是一切生命活動(dòng)不可缺少的有機(jī)物質(zhì)。在自然界中，組成蛋白質(zhì)的氨基酸共有20種，除甘氨酸外，所有組成蛋白質(zhì)的天然氨基酸都是L-α-氨基酸，其中8種為必需氨基酸。氨基酸對(duì)生物化學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研究以及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、質(zhì)量控制和生產(chǎn)管理等具有重要意義。本項(xiàng)目主要學(xué)習(xí)氨基酸總量、谷氨酸和賴氨酸的測(cè)定方法。氨基酸是含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物的統(tǒng)稱，氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，有時(shí)多種氨基酸可以共存。所以不能以氨基酸百分率來(lái)表示氨基酸含量，而需要測(cè)定總的氨基酸量，以氨基酸中所含的氮(氨基酸態(tài)氮)的百分率表示。若樣品中只含有一種氨基酸，就可以從含氮量計(jì)算出氨基酸的含量。

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氨基酸總量測(cè)定方法主要有單指示劑甲醛滴定法、雙指示劑甲醛滴定法和茚三酮比色法。

任務(wù)一氨基酸總量的測(cè)定一、單指示劑甲醛滴定法

1.原理氨基酸既含有-COOH基又含有-NH2基所以氨基酸具有酸、堿兩重性質(zhì)。由于這二個(gè)基的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可用堿來(lái)滴定-COOH，測(cè)出氨基氮，從而間接的測(cè)定氨基酸的含量。反應(yīng)式以三種形式存在。

一、氨基酸總量的測(cè)定一、單指示劑甲醛滴定法

1.原理－NH3是弱酸，完全解離時(shí)PH為11～12或更高，若用堿滴定－NH3所釋放的H＋來(lái)測(cè)定氨基酸，一般指示劑變色域小于10，很難準(zhǔn)確指示滴定終點(diǎn)。

R-CH-COO-NH3+R-CH-COO-NH2+H+一、氨基酸總量的測(cè)定一、單指示劑甲醛滴定法

1.原理常溫下，甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合，生成羥甲基衍生物，使上述平衡右移，促使－NH3釋放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)（PH9.0左右）。因此可用酚酞作指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定放出H+，測(cè)出氨基氮，從而計(jì)算氨基酸的含量。

任務(wù)一氨基酸總量的測(cè)定一、單指示劑甲醛滴定法

HCOR-CH-COO-NH3+R-CH-COO-NH2+H+R-CH-COO-NHCH2OHHCOR-CH-COO-N(CH2OH)2NaOH中和一、單指示劑甲醛滴定法

2.試劑與儀器1.試劑

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40%中性甲醛溶液：以百里酚酞指示劑，將甲醛溶液用1mol/LNaOH溶液中和至淡藍(lán)色，臨用前中和。

■0.1%百里酚酞乙醇溶液：稱0.5g酚酞溶于100mL60%酒精中。

■標(biāo)準(zhǔn)0.100mol/L氫氧化鈉溶液。2.儀器錐形瓶堿式滴定管移液管洗耳球天平容量瓶試劑瓶量筒玻棒與燒杯等一、單指示劑甲醛滴定法3.操作步驟（1）樣品稱量：稱取一定量樣品(約含20mg的氨基酸)于燒杯中(如為固體加水50mL)；（2）滴加指示劑：加2-3滴0.1%百里酚酞乙醇溶液（3）NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定：用0.1mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色。（4）加入甲醛生成羥甲基衍生物：加入中性甲醛20mL，搖勻，靜置1分鐘，此時(shí)藍(lán)色應(yīng)消失。（5）NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液再次滴定：再用0.1mol/LNaOH溶液滴定至淡藍(lán)色。記錄兩次滴定所消耗的堿液體積mL。4.結(jié)果計(jì)算式中：X:氨基酸態(tài)氮(％)

c：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液當(dāng)量濃渡V：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的總量(mL)m：樣品溶液相當(dāng)樣品重量(g)

0.014：氮的毫克當(dāng)量,與1mLNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)囊院量吮硎镜牡馁|(zhì)量。單指示劑甲醛滴定法5.結(jié)果記錄測(cè)定次數(shù)測(cè)定內(nèi)容123百里酚酞作指示劑時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）樣品的質(zhì)量（g）樣品中氨基酸態(tài)氮含量（g/100mL）樣品中氨基酸態(tài)氮含量平均值（g/100mL）相對(duì)平均偏差（%）一、單指示劑甲醛滴定法6.注意事項(xiàng)

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單指示劑甲醛滴淀法用堿完全中和-COOH時(shí)的PH為8.5～9.5◆測(cè)定樣品的顏色較深時(shí)，應(yīng)加活性