疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)病原微生物核酸檢測(cè)質(zhì)量管理技術(shù)規(guī)范

前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由河北省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出。本文件由河北省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（HeB/TC25）歸口。本文件起草單位：河北省疾病預(yù)防控制中心河北省衛(wèi)生健康委,石家莊市疾病預(yù)防控制中心本文件主要起草人:李軍姜彩肖邢建宋紅梅曹江雪崔玉杰劉繼敏黃衛(wèi)華陳建李國(guó)風(fēng)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)病原微生物核酸檢測(cè)質(zhì)量管理技術(shù)規(guī)范

范圍本文件規(guī)定了疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)病原微生物核酸檢測(cè)質(zhì)量管理的基本要求、檢測(cè)過(guò)程質(zhì)量保證、污染控制、外部質(zhì)控等內(nèi)容。本文件適用于疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)病原微生物核酸檢測(cè)質(zhì)量管理。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27476.1-2014檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室安全第1部分：總則JJF1874-2020(自動(dòng))核酸提取儀校準(zhǔn)規(guī)范JJG646-2006移液器RB/T214-2017檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)通用要求TSG21-2016固定式壓力容器WS233-2017病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則YY0569-2011II級(jí)生物安全柜YY/T1173-2010聚合酶鏈反應(yīng)分析儀臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范消毒技術(shù)規(guī)范醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例術(shù)語(yǔ)和定義GB19489-2008、JJF1874-2020、JJG646-2006、RB/T214-2017、WS/233-2017、消毒技術(shù)規(guī)范界定的及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReaction，PCR一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。通過(guò)體外酶促合成特異核酸片段，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的片段得以迅速擴(kuò)增。3.2結(jié)果分析resultanalysis判定聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果是否有效，以及判斷檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度否能證實(shí)實(shí)驗(yàn)樣本包含目標(biāo)病原體遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。3.3設(shè)備equipment與檢測(cè)有直接關(guān)聯(lián)的任何機(jī)械、儀器儀表、器具、用具或工具，及其部件、配件或附件。3.4質(zhì)量保證qualityassurance,QA為滿足核酸檢測(cè)質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計(jì)劃的系統(tǒng)的措施。4基本要求4.1實(shí)驗(yàn)室環(huán)境4.1.1各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)設(shè)立獨(dú)立的核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。4.1.2核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合GB19489-2008中二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）要求或WS233-2017中加強(qiáng)型BSL-2實(shí)驗(yàn)室，并在所屬市級(jí)衛(wèi)生健康委實(shí)驗(yàn)室生物安全管理部門(mén)備案。4.1.3核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。這4個(gè)區(qū)域在物理空間上應(yīng)是完全相互獨(dú)立的，各區(qū)域無(wú)論是在空間上還是在使用中，應(yīng)始終處于完全分隔狀態(tài)，不得有空氣的直接相通。各區(qū)通風(fēng)換氣次數(shù)不少于10次/小時(shí)。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀時(shí)，擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。4.1.4各工作區(qū)應(yīng)設(shè)緩沖間，人員通過(guò)緩沖間進(jìn)出相應(yīng)的工作區(qū)。設(shè)計(jì)為負(fù)壓的工作區(qū)，氣壓由走廊向緩沖間、核心工作間方向遞減，形成定向氣流趨勢(shì)4.2設(shè)施設(shè)備4.2.1基本配置4.2.1.1試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)應(yīng)配備下列物品。a）2℃～8℃和-20℃以下冰箱。b）超凈工作臺(tái)或生物安全柜c）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。d）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。e）耗材：一次性手套、加樣器吸頭。f）專(zhuān)用工作服和工作鞋(套)。g）專(zhuān)用辦公用品。4.2.1.2樣本制備區(qū)應(yīng)配備下列物品。a）2℃～8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。b）離心機(jī)。c）混勻器。d）核酸提取儀e）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。f）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。g）II型生物安全柜。h）耗材：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。i）專(zhuān)用個(gè)人防護(hù)裝備（依操作的病原微生物分類(lèi)確定）j）專(zhuān)用辦公用品。k）水浴箱或加熱模塊。4.2.1.3擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)應(yīng)配備下列物品。a）熒光定量PCR儀。b）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。c）專(zhuān)用辦公用品。f）專(zhuān)用工作服和工作鞋(套)。注：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)時(shí),產(chǎn)物分析區(qū)與擴(kuò)增區(qū)合并，只保留擴(kuò)增區(qū)。4.2.2試劑與耗材使用部門(mén)應(yīng)根據(jù)核酸檢測(cè)需求，選擇國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)的試劑（試劑盒），提出試劑的申購(gòu)計(jì)劃，并負(fù)責(zé)在使用前進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)收。采購(gòu)部門(mén)負(fù)責(zé)試劑的采購(gòu)、管理以及形式驗(yàn)收，不合格品的退回或更換等。試劑保藏應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒保藏要求進(jìn)行，超出有效期的試劑與耗材應(yīng)與有效期內(nèi)的試劑耗材分開(kāi)暫存。暫存期限不應(yīng)超過(guò)本單位與醫(yī)療廢物處置機(jī)構(gòu)簽訂的處理周期。4.2.3標(biāo)準(zhǔn)品核酸檢測(cè)應(yīng)采購(gòu)有證標(biāo)準(zhǔn)品并嚴(yán)格驗(yàn)收、標(biāo)識(shí)、保存和使用。標(biāo)準(zhǔn)品的使用需遵守一下原則：嚴(yán)格按質(zhì)控品說(shuō)明書(shū)操作；凍干質(zhì)控品的復(fù)溶要確保所用溶劑的質(zhì)量；凍干質(zhì)控品復(fù)溶時(shí)所加的量要準(zhǔn)確，并盡量保持每次加入量的一致；凍干質(zhì)控品復(fù)溶時(shí)應(yīng)輕輕搖勻，使內(nèi)溶物完全溶解，切忌劇烈震搖；質(zhì)控品應(yīng)嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)定的方法保存，不使用超過(guò)保質(zhì)期的質(zhì)控品；質(zhì)控品要在與標(biāo)本同樣測(cè)定條件下進(jìn)行測(cè)定。4.2.4設(shè)備檢定/校準(zhǔn)核酸檢測(cè)涉及的檢測(cè)設(shè)備應(yīng)開(kāi)展周期檢定校準(zhǔn)，選擇具有以下CMA或CNAS資質(zhì)的檢校準(zhǔn)機(jī)構(gòu)：a）核酸提取儀校準(zhǔn)依據(jù)：JJF1874-2020。b）PCR儀校準(zhǔn)依據(jù)：YY/T1173-2010。c）移液器校準(zhǔn)依據(jù)：JJG646-2006。d）生物安全柜檢定依據(jù)：YY0569-2011。e）高壓蒸汽滅菌器檢定依據(jù)：TSG21-2016。校準(zhǔn)周期為校準(zhǔn)證書(shū)規(guī)定的有效時(shí)長(zhǎng)，并在使用前對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。4.2.5期間核查熒光定量PCR儀在兩次校準(zhǔn)之間，應(yīng)對(duì)其控溫系統(tǒng)和熒光系統(tǒng)進(jìn)行期間核查。期間核查方法可參照儀器設(shè)備技術(shù)資料提供的校準(zhǔn)方法或采用標(biāo)準(zhǔn)物品進(jìn)行。PCR儀期間核查時(shí)，應(yīng)考慮以下因素：a）檢測(cè)/校準(zhǔn)方法的要求；b）PCR儀的穩(wěn)定性；c）校準(zhǔn)周期；d）歷次校準(zhǔn)的的結(jié)果和變化趨勢(shì)；e）設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)情況。檢測(cè)人員應(yīng)按照期間核查規(guī)程進(jìn)行期間核查，并保留記錄。4.3人員4.3.1實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)指定專(zhuān)職或兼職負(fù)責(zé)人，應(yīng)具有中級(jí)以上專(zhuān)業(yè)技術(shù)職稱或同等能力。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人全面負(fù)責(zé)技術(shù)運(yùn)作和人員管理，并指定負(fù)責(zé)人的代理人。4.3.2檢測(cè)人員實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)具備實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)歷以及相關(guān)專(zhuān)業(yè)技術(shù)技能，接受過(guò)核酸檢測(cè)技能培訓(xùn)。上崗前應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人進(jìn)行能力確認(rèn)，并由熟悉檢測(cè)目的、程序、方法和結(jié)果評(píng)價(jià)的人員，對(duì)檢測(cè)人員進(jìn)行監(jiān)督。4.3.3特種作業(yè)人員從事壓力容器的操作人員應(yīng)當(dāng)按照國(guó)家有關(guān)規(guī)定經(jīng)特種設(shè)備安全監(jiān)督管理部門(mén)培訓(xùn)，取得國(guó)家特種作業(yè)人員證書(shū)，方可從事相應(yīng)的作業(yè)。4.3.3檔案管理員實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)立專(zhuān)職或兼職檔案管理員，保管全部核酸檢測(cè)人員的培訓(xùn)、考核、能力確認(rèn)和監(jiān)督記錄。4.4樣本樣本管理人員應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)檢測(cè)生物樣品特點(diǎn)，對(duì)樣品的接收、流轉(zhuǎn)、保管、處理及樣品的識(shí)別等各個(gè)環(huán)節(jié)制定有效的管理和控制程序。做好樣品處理記錄，記錄采樣時(shí)間、分裝時(shí)間、存儲(chǔ)設(shè)備溫度、存取信息等可能影響樣品性質(zhì)的信息。檢測(cè)樣本包含但不限于以下種類(lèi)。a）上呼吸道樣本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。b）下呼吸道樣本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。c）便樣本/肛拭子：如果不便于留取便樣本，可采集肛拭子。d）血清樣本：應(yīng)使用無(wú)抗凝劑的真空釆血管。e）物體表面樣本：包括貨物的內(nèi)外包裝表面，以及運(yùn)輸儲(chǔ)藏工具等可能被污染的部位進(jìn)行涂抹采集的樣本。f）環(huán)境樣本：按目標(biāo)病原微生物相關(guān)防控方案采集。g）其他體液樣本：需采集腦脊液或皰疹液進(jìn)行檢測(cè)的病原體（如：柯薩奇病毒、皰疹病毒等）。h）食品i）水用于核酸檢測(cè)的樣本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的樣本可置于4℃保存；24小時(shí)內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的樣本則應(yīng)置于-70℃或以下保存（如無(wú)-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。應(yīng)設(shè)立專(zhuān)庫(kù)或?qū)９駟为?dú)保存樣本。5檢測(cè)過(guò)程質(zhì)量保證5.1標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)嶒?yàn)室應(yīng)當(dāng)制定核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），并嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)室自接到樣本后，應(yīng)當(dāng)依據(jù)SOP在生物安全柜完成樣本清點(diǎn)核對(duì)、試劑準(zhǔn)備、樣本前處理、核酸提取、核酸擴(kuò)增、結(jié)果分析及報(bào)告。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立可疑樣本復(fù)檢的流程。5.2樣本處理使用含胍鹽等滅活型采樣液的樣本無(wú)需進(jìn)行滅活處理，可直接進(jìn)行核酸提取，而使用非滅活型采樣液的樣本，按照核酸提取試劑盒的說(shuō)明，取樣本加至核酸提取裂解液中充分混勻作用一定的時(shí)間有效滅活病毒。5.3核酸提取選擇磁珠法、膜吸附法等進(jìn)行核酸提取，可根據(jù)核酸提取試劑及擴(kuò)增體系的要求選擇配套的樣本采樣管，將滅活后的樣本取出，在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)樣本采集管加樣。按照核酸提取試劑盒的說(shuō)明，繼續(xù)核酸提取步驟，核酸提取完成后立即封蓋。5.4聚合酶鏈反應(yīng)在生物安全柜內(nèi)取適量核酸加至PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中。將擴(kuò)增體系放入熒光定量PCR儀，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置擴(kuò)增程序，啟動(dòng)擴(kuò)增程序。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)控。每批檢測(cè)至少有1份弱陽(yáng)性對(duì)照（不高于檢出限的3倍），1-3份陰性對(duì)照，分別是陰性標(biāo)本對(duì)照、水與反應(yīng)液對(duì)照和僅反應(yīng)液對(duì)照。（是否改成按試劑盒說(shuō)明書(shū)或按其它有明確要求的方案、指南、標(biāo)準(zhǔn)等執(zhí)行）陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照隨機(jī)放入檢測(cè)樣品中，參與擴(kuò)增的全過(guò)程。5.5結(jié)果分析結(jié)果判斷如下。a）陰性:無(wú)Ct值、無(wú)S形擴(kuò)增曲線。c）Ct值小于等于檢出限，且有S形擴(kuò)增曲線，可報(bào)告為陽(yáng)性。b）Ct值位于灰區(qū)，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若重做Ct值仍處于灰區(qū)，但出現(xiàn)明顯的S形擴(kuò)增曲線，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。注：如使用商品化試劑盒，則以廠家提供的說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。6污染控制6.1實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行消毒，可用75%酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行擦拭或噴灑消毒；紫外線輻射消毒；采用去除DNA污染的試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行消毒清潔，實(shí)驗(yàn)室地面用含有有效氯1000-2000mg/L的含氯消毒劑擦拭或噴灑消毒，然后用拖布蘸清水擦拭殘余消毒劑，加強(qiáng)通風(fēng)。6.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，生物安全柜應(yīng)以含有有效氯1000mg/L含氯消毒劑擦拭消毒作用30分鐘，然后，用濕巾擦拭殘余消毒劑?；蛴?5%酒精（75%酒精濕巾）擦拭消毒，繼續(xù)通風(fēng)10分鐘后，開(kāi)啟紫外線消毒30分鐘。實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)備、物品應(yīng)使用去除DNA污染的試劑噴灑一定時(shí)間后，再用紙巾進(jìn)行擦拭，隨后用75%酒精噴灑并用紙巾擦拭干凈。6.3醫(yī)療廢物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢物應(yīng)裝進(jìn)專(zhuān)用醫(yī)療廢物垃圾袋，扎緊后用含有效氯1000-mg/L的含氯消毒劑或75%酒精噴灑表面，經(jīng)高壓蒸汽滅菌器121℃30分鐘高壓。擴(kuò)增完成后反應(yīng)管不可開(kāi)蓋，直接放于垃圾袋中，封好袋口，經(jīng)高壓蒸汽滅菌器121℃30分鐘高壓后，按一般醫(yī)療廢物轉(zhuǎn)移出實(shí)驗(yàn)室處理。6.4個(gè)人防護(hù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)個(gè)人防護(hù)用品的選擇、使用、維護(hù)應(yīng)有明確的程序和使用指導(dǎo)，同時(shí)要求檢測(cè)人員充分了解其實(shí)驗(yàn)工作的性質(zhì)和特點(diǎn)，接受防護(hù)裝備的使用培訓(xùn)，并正確使用個(gè)體防護(hù)裝備。核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員應(yīng)采用二級(jí)防護(hù)，有特殊規(guī)定的從其規(guī)定。6.5實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)符合GB19489-2008附錄B《生物安全實(shí)驗(yàn)室良好工作行為指南》和《附錄C實(shí)驗(yàn)室生物危險(xiǎn)物質(zhì)灑溢處理指南》的要求，應(yīng)避免發(fā)生污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境、危及自身和他人安全、破壞樣本以及不必要的操作。6.6清潔用具不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具，以防止交叉污染。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。基本原則是，由清潔區(qū)向污染區(qū)進(jìn)行,潔具不可交叉。清潔消毒方向通常為準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)。7外部質(zhì)控7.1外部質(zhì)控要求實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)參加外部能力驗(yàn)證或室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差，提高檢測(cè)質(zhì)量。7.2組織實(shí)施省級(jí)疾控中心對(duì)市級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)每年開(kāi)展1～2次質(zhì)控考核，保留考核記錄。市級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)對(duì)縣級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)開(kāi)展每年不少于1次質(zhì)控考核?？己私Y(jié)果不合格的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在10個(gè)工作日內(nèi)，接受重新考核。重新考核不合格的，應(yīng)暫停核酸檢測(cè)工作。參?考?文?獻(xiàn)［1］中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院.《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》［國(guó)務(wù)院令第424號(hào)］，北京：中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院