水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)常用技術(shù)

水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)常用技術(shù)水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)常用技術(shù)顯微技術(shù)---------------觀察形體形態(tài)分離培養(yǎng)技術(shù)---------培養(yǎng)活細(xì)菌或病毒生化鑒定技術(shù)------檢測酶的活性核酸檢測技術(shù)------檢測核酸免疫學(xué)技術(shù)------------檢測蛋白綜合檢測技術(shù)顯微技術(shù)1、觀察寄生蟲、真菌等2、細(xì)菌、細(xì)胞形態(tài)觀察3、電子顯微觀察革蘭氏染色G+G-正常的CO細(xì)胞感染SVC病毒的細(xì)胞感染SVC病毒的細(xì)胞電子顯微鏡分離培養(yǎng)技術(shù)1、魚類病毒的分離培養(yǎng)樣品洗滌后勻漿，用10倍體積的細(xì)胞培養(yǎng)液充分懸浮，靜置。離心收集上清，倍比稀釋后接種單層細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)2、細(xì)菌分離培養(yǎng)稀釋法注意事項(xiàng)：每畫一組線，接種環(huán)需滅菌一次（即每個(gè)培養(yǎng)皿只取材料一次）平板劃線分離法選擇適宜的培養(yǎng)基生化鑒定技術(shù)1、病毒生化鑒定1.1氯仿敏感試驗(yàn)1.2吖啶橙試驗(yàn)1.3DNA抑制劑抑制試驗(yàn)1.4免疫熒光試驗(yàn)生化鑒定技術(shù)2、細(xì)菌生化鑒定各種細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力不同，其代謝產(chǎn)物也不同。用生物化學(xué)方法測定這些代謝產(chǎn)物，可用來區(qū)別和鑒定細(xì)菌的種類。利用生物化學(xué)方法來鑒別不同細(xì)菌，稱為細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)或稱生理生化反應(yīng)。生理生化檢測技術(shù)吲哚試驗(yàn)有動(dòng)力現(xiàn)象無動(dòng)力現(xiàn)象陰性陽性陽性陰性核酸檢測技術(shù)1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測2、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測3、熒光定量PCR檢測RNA抽提將450μl細(xì)胞病變懸液加入450μlCTAB溶液。25℃作用2-2.5小時(shí)。加600μl酚/氯仿/異戊醇（24:24:1）,用力混合至少30秒。12,000rpm離心5分鐘，取上層水相（約750μl）。加650μl氯仿/異戊醇（24:1）,用力混合至少30秒12,000rpm離心5min，取上層水相（約600μl）。加1.5倍體積的無水乙醇，混勻后-20℃過夜，12,000rpm離心30分鐘，小心棄上清，倒置在濾紙上吸干，37℃干燥30min，加11μl水溶解，吹打20下，-80℃凍融一次，做PCR模板。不同的抽提方法蛋白酶K或SDS消化后用酚抽提CTAB處理后酚/氯仿抽提TRIZOL處理后氯仿抽提QIAGEN法抽提從效果、方便、價(jià)格綜合考慮變性和退火在0.2mlPCR管內(nèi)分別加入各反應(yīng)成分模板10μl引物2.5μlDEPE水2.5μl混勻，70℃反應(yīng)5分鐘，立即冰浴，低速離心5ScDNA合成在上述0.2mlPCR管內(nèi)分別加入各反應(yīng)成分5*AMVbuffer

10μldNTP

2μlRnase抑制劑0.5μlAMV反轉(zhuǎn)錄酶1μlDEPE水1.5μl至總體積為25μl,42℃反應(yīng)60min。PCR擴(kuò)增1）在0.5mlPCR管內(nèi)分別加入各反應(yīng)成分10*PCRBuffer

8μldNTP10μl上下游引物各2μlTaq酶1μlMgcl28μlDEPE水52μl反應(yīng)總體積100μl2）94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8min，4℃保溫。套式PCR擴(kuò)增1）另取一0.2mlPCR管內(nèi)分別加入各反應(yīng)成分模板5μl10*PCRBuffer

10μldNTP8μl上下游引物各2.5μlTaq酶1μlMgcl210μlDEPE水61μl反應(yīng)總體積100μl2）94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8min，4℃保溫。免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)檢測技術(shù)利用抗原抗體間能發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的原理來檢測病原，是運(yùn)用較為廣泛、成熟的檢測技術(shù)。常用的有免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、Western印跡法等。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是目前應(yīng)用最廣泛的固相免疫酶測定技術(shù)，是利用了抗原一抗體反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性，通過肉眼或顯微鏡觀察及分光光度計(jì)測定，達(dá)到在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的部位，以及對(duì)其進(jìn)行定量的目的。陽性弱陽性陰性空白

綜合檢驗(yàn)技術(shù)免疫PCRPCR-ELISA免疫病理學(xué)技術(shù)分子病理技術(shù)可以看出，病原的檢測方法多種多樣，各種方法都有