微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識

微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第1頁目錄一、微生物基礎(chǔ)介紹二、培養(yǎng)基三、菌種四、微生物程度檢驗法微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第2頁一、微生物基礎(chǔ)介紹1、微生物定義微生物是一些形體微小，以單細(xì)胞或簡單多細(xì)胞、甚至是沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)形式存在低等生物統(tǒng)稱。2、微生物分類微生物主要分類單位：域、界、門、綱、目、科、屬、種、變種、亞種（小種）、型、菌株（品系）“種”是最本分類單位，例：大腸埃希菌微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第3頁一、微生物基礎(chǔ)介紹3、微生物特點體形微小；結(jié)構(gòu)簡單；生長繁殖快；種類繁多，分布廣，適應(yīng)性強。包含：細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌、立克次氏體、支原體和病毒等。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第4頁一、微生物基礎(chǔ)介紹4、微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)4.1細(xì)菌4.2真菌（包含酵母菌和霉菌）微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第5頁一、微生物基礎(chǔ)介紹5、微生物與咱們每張人民幣帶細(xì)菌：900萬個；人體體表及體內(nèi)存在大量微生物；皮膚表面：平均10萬個細(xì)菌/平方厘米；口腔“細(xì)菌種類超出500種；腸道：微生物總量達100萬億；微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第6頁一、微生物基礎(chǔ)介紹

（未清洗手）

（涼水洗手）

（洗潔精洗后手）

（洗潔精洗后，消毒劑消毒手）微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第7頁二、培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基配制：

按處方配制，使用按處方生產(chǎn)符合要求脫水培養(yǎng)基微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第8頁二、培養(yǎng)基配制時注意：不得使用結(jié)塊或顏色發(fā)生改變脫水培養(yǎng)基；常見溶劑是純化水、蒸餾水，防止使用自來水，因其中含有氯等抗菌物質(zhì)；脫水型培養(yǎng)基應(yīng)完全溶解于水中，再分裝滅菌；加熱助溶，注意不要過分加熱；如需要添加其它組分，加入后應(yīng)充分混勻；配制用容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器；配制培養(yǎng)基普通要在1小時內(nèi)完成，假如室溫高，配制時間過長，易使培養(yǎng)基受污染；微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第9頁二、培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基滅菌已配制好培養(yǎng)基最好盡快滅菌；普通培養(yǎng)基采取濕熱滅菌，即高壓蒸汽菌，通常是121℃15分鐘；濕熱滅菌必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時間，不可重復(fù)高溫滅菌；高壓蒸汽滅菌鍋在使用時，內(nèi)置物品不能太多，不要堆積形成死角。要定時對壓力表等進行檢定，檢定周期普通為六個月；定時對滅菌效果進行檢驗，可采取生物指示菌法、化學(xué)變色紙片（如濕熱滅菌指示條）等進行驗證。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第10頁二、培養(yǎng)基3、培養(yǎng)基貯藏貯藏注意：滅菌后培養(yǎng)基應(yīng)快速取出，防止長時間保留在滅菌鍋內(nèi)，造成過分滅菌；培養(yǎng)基保留前應(yīng)標(biāo)上名稱和制備日期（或到期日期）；瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放；瓊脂平板最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如置冰箱保留，不超出一周；微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第11頁二、培養(yǎng)基4、培養(yǎng)再融化方式水浴加熱微波爐注意：固體培養(yǎng)基滅菌后再融化只允許一次融化培養(yǎng)基應(yīng)置于45℃～50℃水浴中，不得超出8小時微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第12頁二、培養(yǎng)基5、培養(yǎng)基性能評定全部購回、配制好培養(yǎng)基均應(yīng)進行質(zhì)量控制試驗（培養(yǎng)基適應(yīng)性檢驗）理化指標(biāo)（P55）微生物學(xué)指標(biāo)（P55）微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第13頁三、菌種1、分類（概念）：標(biāo)

準(zhǔn)

菌

株由我國或國際菌種保藏機構(gòu)保藏標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到培養(yǎng)物商業(yè)派生菌株由供給商提供全部特征與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效菌株工

作

菌

株由標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株以傳代得到培養(yǎng)物微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第14頁三、菌種注意：標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株、工作菌株都應(yīng)進行純度和特征確認(rèn)工作菌株傳代次數(shù)不得超出5代（從菌種收藏機構(gòu)取得標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代）“1代”是指將活培養(yǎng)物接種到微生物生長新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。試驗室必須建立和保留其全部菌種進出、搜集、貯藏、保留、確認(rèn)試驗及銷毀統(tǒng)計。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第15頁三、菌種標(biāo)準(zhǔn)菌株：①凍干粉（圖P63）②甘油凍存管（圖P64）微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第16頁三、菌種菌種保藏機構(gòu)：CMCC中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心GIMCC廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心ATCC美國經(jīng)典菌種保藏中心例：

CMCC

（B）

26003菌種保藏機構(gòu)

細(xì)菌

菌種編號（金黃葡萄球菌）微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第17頁三、菌種2、菌種判定

金黃色葡萄菌CMCC(B)26003甘露醇平板上劃線分純，經(jīng)典菌落

為黃色圓形突起，表面濕潤光滑；革蘭氏染色：陽性，球菌。血漿凝固霉酶試驗：陽性微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第18頁三、菌種銅綠假單胞菌CMCC(B)10104溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上劃線分純，經(jīng)典菌落呈扁平，無定形、周圍擴散，表面濕——灰白色，周圍有藍(lán)綠色素擴散。氧化酶試驗：陽性綠膿菌素：陽性革蘭氏染色：陰性，桿菌；微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第19頁三、菌種白色念珠菌CMCC(B)98001沙氏葡萄糖瓊脂平板上劃線分純，經(jīng)典菌落乳白色，表面光滑有濃酵母氣味。革蘭氏染色：陽性，菌體大，球菌。芽管試驗：陽性微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第20頁三、菌種3、菌種保藏A：甘油冷凍管保藏法保藏溫度：－30℃～80℃；保藏菌種使用期：1～2年優(yōu)點：保留期較長，重復(fù)傳代造成菌種變異風(fēng)險較??；缺點：操作相對復(fù)雜，成本較高。B：斜面低溫保藏法保藏溫度4℃左右，保藏時間1～3個月，但銅綠假單胞菌不宜用本法保留。優(yōu)點：操作簡便，成本低，比較輕易掌握；缺點：保留期比較短，重復(fù)傳代有引發(fā)變異可能。。

保藏溫度保藏使用期優(yōu)點缺點甘油冷凍管保藏法-30℃～80℃1～2年·保留期較長，·重復(fù)傳代造成菌種變異風(fēng)險較小·操作相對復(fù)雜，·成本較高斜面低溫保藏法4℃左右1～3個月·操作簡便，·成本低，·比較輕易掌握·保留期比較短，·重復(fù)傳代有引起變異可能；·銅綠假單胞菌不宜用本法保留。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第21頁三、菌種4、菌種使用和銷毀過期菌種應(yīng)及時銷毀，銷毀時應(yīng)經(jīng)121℃30分鐘生物滅活處理。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第22頁四、微生物程度檢驗法1、定義微生物程度檢驗法—系檢驗非要求滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度方法。2、檢驗項目定量檢驗—細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)定性檢驗—控制菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌）檢驗環(huán)境：與無菌檢驗相同微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第23頁四、微生物程度檢驗法3、檢驗量指一次檢驗用量；10g或10ml，膜劑為100cm2，珍貴藥品、微量包裝藥品檢驗量能夠酌減。4、供試液制備依據(jù)供試品理化特征與生物特征，采取適宜方法制備供試液；供試液制備若需加溫時，應(yīng)均勻加熱，且溫度不超出45℃。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第24頁四、微生物程度檢驗法制備標(biāo)準(zhǔn)：簡便、快速！供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超出1小時。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第25頁四、微生物程度檢驗法供試品分類液體供試品固體、半固體或黏稠性供試品需用特殊供試液制備方法供試品非水溶性供試品膜劑供試品腸溶及結(jié)腸制劑供試品氣霧劑、噴霧劑供試品貼膏劑供試品具抑菌活性供試品：培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法

微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第26頁四、微生物程度檢驗法5、方法驗證5.1驗證菌株大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉5.2計數(shù)方法驗證當(dāng)建立產(chǎn)品微生物程度檢驗法時，應(yīng)進行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證，以確認(rèn)所采取方法適合于該產(chǎn)品細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)測定。若產(chǎn)品組分或原檢驗條件發(fā)生改變可影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第27頁四、微生物程度檢驗法⑴試驗組薄膜過濾法計數(shù)時：取要求量供試液，過濾，沖洗，在最終一次沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。⑵菌液組測定所加試驗菌數(shù)（50～100cfu）⑶供試品對照組取要求量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)⑷稀釋對照組用對應(yīng)稀釋液替換供試品，加入50～100cfu試驗菌，按試驗組供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第28頁四、微生物程度檢驗法驗證方法：驗證試驗最少應(yīng)進行3次獨立平行試驗，并分別計算試驗菌每次試驗回收率不低于70%，若任一次試驗中試驗組菌回收低于70%，應(yīng)采取適宜方法消除供試品抑菌活性，并重新進行進行方法驗證。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第29頁四、微生物程度檢驗法5.3控制菌檢驗法驗證當(dāng)建立藥品微生物程度檢驗法時，應(yīng)進行控制菌檢驗方法驗證，以確認(rèn)所采取方法適合于該藥品控制菌檢驗。采取薄膜過濾法時，取要求量供試液，過濾，沖洗，試驗菌（10～100cfu）應(yīng)加在最終一次沖洗液中，依法操作。若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢驗法進行供試品該控制菌檢驗；若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采取對應(yīng)方法消除供試品抑菌活性，并重新進行方法驗證。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第30頁四、微生物程度檢驗法5.4細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢驗檢驗方法：平皿法和薄膜過濾法按已驗證計數(shù)方法進行供試品細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)檢驗微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第31頁四、微生物程度檢驗法菌落匯報規(guī)則：細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu；霉菌宜選取平均菌落小于100cfu稀釋級，作為菌數(shù)匯報（即兩位有效數(shù)字）依據(jù)。如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平板有菌落，但平均菌落數(shù)小于1時，以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)值匯報菌數(shù)。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第32頁四、微生物程度檢驗法菌落匯報規(guī)則示例各稀釋級（供試液1ml/皿）平均菌落計數(shù)（cfu）菌數(shù)匯報數(shù)（cfu/ml.g）原液1：10（-1）1：102（-2）1：103（-3）1—64826402—42064864003—不可計42064640004—00.50＜1005——00＜1006—000＜107000—＜1例：菌數(shù)匯報規(guī)則表1微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第33頁四、微生物程度檢驗法5.4.2薄膜過濾法濾膜孔徑小于0.45μm，直徑普通為50mm，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量不超出100ml，總沖洗量不得超出1000ml。貼膜

菌面朝上于對應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基最少制備一張濾膜。陰性對照試驗（不得有菌生長）菌落匯報規(guī)則每張濾膜上菌落數(shù)應(yīng)不超出100cfu，若濾膜上無菌生長，以＜1乘以稀釋倍數(shù)值匯報菌數(shù)。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第34頁四、微生物程度檢驗法5.5控制菌檢驗供試品控制菌檢驗應(yīng)按已驗證方法進行，增菌培養(yǎng)基實際用量同控制菌檢驗方法驗證。陽性對照試驗：加菌量為10～100cfu，陽性對照試驗應(yīng)檢出對應(yīng)控制菌。陰性對照試驗：取稀釋液10ml代替供試液，陰性對照應(yīng)無菌生長。按照不一樣給藥路徑，必檢控制菌不一樣。微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第35頁四、微生物程度檢驗法不一樣給藥路徑制劑應(yīng)檢控制菌匯總藥品給藥路徑應(yīng)檢控制菌說明局部給藥制劑金黃色葡萄球菌全部制劑銅綠假單胞菌白色念珠菌陰道給藥口服制劑大腸埃希菌全部品種大腸菌群