版三黃雞NLRP3基因組織表達和分布研究

（AMPsNLRP3了炎癥的發(fā)生和發(fā)展NLRP3炎性復合體主要由NLRP3pro-caspase-1和ASC3部分構成，其中NLRP3作為該炎癥小體的分子和傳感器，對調(diào)控炎癥小體NLRP3組織特異性表達和分布的數(shù)據(jù)，這嚴重妨礙了三黃雞炎癥性疾病發(fā)生機制的研究。本研究對三黃雞NLRP3進行了克隆和序列分析，通過重組原核表達純化蛋白免疫家兔了多克隆抗體，分別通過實時熒光定量PCR和免疫NLRP3mRNANLRP3NLRP3在雞炎癥性疾NLRP3在不同物種的功能和進化提供了基礎數(shù)據(jù)。4部分內(nèi)容：1、三黃雞NLRP3克隆及序列分GenBank不同物種的NLRP3序列和氨基酸序列進行同源性分析，三黃雞NLRP3基54.2%、53.9%、53.7%、55.4%、54.3%、54.5%、53.5%、53.7%，該哺乳類動物間的同源性52%。2、實時熒光定量分析三黃雞NLRP3的表PT-PCRNLRP3和β-actin片段引物的特異性。擴增的目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測分別在253bp和167bp處有一條相應的特異性條帶，其大小與理論推測相符。NLRP3在三黃雞所檢測的所有組織中均有表達。NLRP3在三黃雞的肺臟和氣管中的表達量大大高于其它3、三黃雞NLRP3原核表達與多抗通過雙酶切和序列測定證明成功構建了pET32a(+)-NLRP3表達質粒。NLRP3His重組融合蛋白得到有效表達通過SDS蛋白凝膠電泳檢測純化蛋的純化IgG抗體分別進行Westernblot檢測，結果表明表達的融合蛋白均為NLRP3His重組融合蛋白。4NLRP3NLRP3蛋白在三黃雞各個組織的分布進行研究。NLRP3蛋白在細胞質中表達。NLRP3蛋白在心臟和脾臟呈現(xiàn)狀軟骨細胞呈。肺泡上皮細胞呈現(xiàn)強陽性反應。心肌細胞呈弱陽性至中強陽性，心肌間結締組織呈。大腦皮層部分基質呈弱陽性，神經(jīng)元細胞呈中至強陽性。脾臟內(nèi)皮網(wǎng)狀細胞呈弱陽性至中強陽性，淋巴細胞呈。法氏囊髓質淋和腎小球囊細胞呈。：三黃雞；NLRP3；表達；組織分theStudyofTissue-specificExpressionPatternandDistributionofNLRP3in YellowChicken(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthernAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,):Asimportantpathogen-associatedmolecularpatterns(PAMPs),NOD-likereceptorprotein3(NLRP3)infl someisinvolvedintheonsetanddevelopmentofinfl tion,whichismainlycomposedofNLRP3,ASCandpro-caspase-1protein.NLRP3,asoneofthemostimportantinflsomesensors,hassignificanteffectontheregulationofinfl someactivationanddownstreamsignaltransduction.yellowchickenisthemostimportantqualitybroilerbreedinSouth,theharmofinfl torydiseaseofwhichis ingmoreandmoreseriousintheprocessoflarge-scalebreeding.Uptodate,therearenodetailedtissuespecificexpressionanddistributiondataaboutNLPR3inchicken,whichisthenegativefactorforfurtherresearchonthetheroleofNLRP3ofdifferenttissuesinavian torydiseases.Here,NLRP3ofyellowchickenwasclonedandsequenceyzed,thepolyclonalantibodywasproducedbypurifiedproteinofbinantprokaryoticexpression.RelativeexpressionlevelsandtissuedistributionofNLRP3wereinvestigatedbyreal-timetativePCRandimmunohistochemicalysis,respectively.TheresultswillhelptoelucidatetheroleofNLRP3ofdifferenttissuesininfl torydiseasesofchickenandprovideabasisdataforfurtherinvestigationsinthefunctionandevolutionofNLRP3indifferentspecies.TherefourpartsofthisAmplificationofyellowchickenNLRP3geneandsequenceysisyellowchickenNLRP3genewasamplifiedbyRT-PCRandthesequencewasdepositedinGenBank(accessionno.:KF318520),whichyzedwithbioinformaticssoftwares.Theresultsshowedthatthededucedproteinisconsistsof734aminoacidsanditsdeducedmolecularweightis82.7KDa.ThenucleotidesequencesofNLRP3werealignedusingthesoftwareMegAlign(DNAstar,Madison,WI).ThenucleotidehomologyofNLRP3amongyellowchickenandBostaurus,Hainanblackgoat,Susscrofa,Callithrixjacchus,Homosapiens,Macacamulatta,MusmusculusandRattusnorvegicuswere54.2%,53.9%,53.7%,55.4%,54.3%,54.5%,53.7%.TheNLRP3geneisconservativeinmlianbutsignificantlydifferentbetweenmlianandchicken,withonly52%homology.Real-TimetativePCRysisofyellowchickenNLRP3Melting-curveprofileysisconfirmedthespecificityofprimersforamplificationofNLRP3andβ-actinfragments.Theamplifiedtargetgenefragmentsof253and167bp,respectively,wereevaluatedbyagarosegelelectrophoresisandwereinaccordancewithexpectations.Thesequencesofthesetwotargetgenefragmentsshowed100%homologywiththeoriginalsequences.NLRP3expressedinallchickentissuesexamined.TherelativeexpressionlevelofNLRP3inthetracheaandlungwereverysignificantlyhigherthanthatinothertissuesexamined(P<0.01).TherewasnosignificantdifferenceofNLRP3expressionlevelsbetweentheheart,liver,spleen,kidneyandbursaofFabricius.ProkaryoticexpressionofyellowchickenNLRP3andthepreparationofthepolyclonalantibodyDoubleenzymedigestionandnucleotidesequenceysisshowedthatexpressionsmidpET32a(+)-NLRP3wassuccessfullyconstructed.The His-taggedNLRP3wasefficientlyexpressedandSDSshowedthatthepurifiedproteinbandwasconsistentwiththepredictedsize,whichisapproximay100KDa.WesternblotdetectionusingHis-tagantibodyandourpreparedIgGshowedthatthefusionproteinwastheHis-taggedNLPR3.ImmunohistochemicalysisofyellowchickenThemethodofimmunohistochemistrywasestablishedtodetecttissuespecificdistributionofyellowchickenNLRP3.ImmunohistochemicaldetectionshowedthatchickenNLRP3wastissuespecificdistributionandlocatesincytosmofthepositivestainingcells.Thecytosmexhibitedweaktomediumpositivestainingintheheartandspleen,butstronginthetrachea,lung,brain,liver,bursaofFabricius,andkidney.Ciliatedepithelialcells,basalcellsandcellsinlaminapropriaandsubmucosaoftracheastainedstrongpositive,whilecellsincricoidcartilageshowednegative.ThealveolarepithelialcellsofthepulmonaryalveoliwerestronglypositiveforNLRP3proteinexpressioninthelung.Cardiacmuscleexhibitedweaktomoderatestaining,whilethatoftheconnectivetissueswasnegative.Inthecerebralcortexofthebrain,someareasofthematrixexhibitedweakpositiveandneuronsshowedtostrongpositivestaining.Inspleen,theendothelialreticularcellsexhibitedweaktomediumpositivestainingwhilelymphocyteshowednegative.InbursaofFabricius,lymphocytesofmedullainstannousfollicleshowedstrongpositivewhilecortexcellsshowedfocalstrongpositive.Interestingly,mucosalepithelialcellsofbursaofFabriciusshowedmediumtostrongpositive.Inliver,partoflivercellsexhibitedmediumtostrongpositivestaining.Inkidney,mostoftherenaltubularepithelialcellsexhibitedmediumtostronglypositivestainingwhilethecellsintheglomerulusandBowman’scapsuleswerenegative. 前 1.1性炎癥的發(fā)生及其機 NLRP蛋白及其在炎癥反應中的作 NLRP蛋白NLRP3炎性復合體的組成及其在炎癥反應中作 NLRP3的分子結構及其分布情 NLRP3炎性復合體參與機體炎癥的途徑及其機 NLRP3炎性復合體參與流感炎癥的途徑及其作 本研究的目的和意 材料與方 材 實驗動 抗 主要試劑盒及試 主要溶液的配 主要儀器設 分析工具軟 方 三黃雞NLRP3的克隆與鑒 三黃雞NLRP3熒光定量實 三黃雞ST3GalIII的原核表達與多抗的三黃雞NLRP3的組織學分 結果與分 三黃雞NLRP3的克隆與序列分 三黃雞NLRP3的克隆與質粒的鑒 三黃雞NLRP3的序列分 三黃雞NLRP3熒光定量結果與分 三黃雞熒光定量實驗NLRP3和β-actin的鑒 熒光定量實驗溶解曲 熒光定量PCR擴增曲 標準曲 NLRP3在各個組織的相對表達水 三黃雞NLRP3的原核表達與多抗原核表達載體構建結 三黃雞NLRP3蛋白的誘導表達及純 重組蛋白的純 三黃雞NLRP3蛋白多克隆抗體的三黃雞NLRP3的組織學分 討論與結 參考文 附 1.1性炎癥的發(fā)生及其機免疫系統(tǒng)為阻擋清除病原體或者消除有害刺激，促進損傷修復的重要，然而度適度的發(fā)揮其有利作用而減輕炎癥反應的具有重要的意義近年來發(fā)現(xiàn)，子的釋放，最終發(fā)生炎癥反應。炎性復合體在免疫反應中發(fā)揮作用，既能感受各種病原或相關相關分子模式，又能夠產(chǎn)生相應的反應，發(fā)揮適當?shù)膽胧┨幚頇C體的病原微生物免疫系統(tǒng)分為天然免疫系統(tǒng)和后天性免疫系模式識別受體(patternrecognitionreceptors,PRRs)廣泛識別和結合存在于病原體上的病原相關分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)和宿主有免疫,通過對外來理化刺激和病原微生物做出一系列復雜的應答反應,以達到NLRP3IL-1β和IL-18前體的成熟和IL-1β18的分泌。IL-1β、IL-18在加強固有免疫、促進炎癥反應、對抗病原菌等方達則會過度的炎癥反應還可以通過NF-kB誘導多種促損傷的酶類合成，增加細胞的細胞毒作用（Bonaetal.1999；Hagbergetal.1996；Lebel-Binayetal.,系統(tǒng)，其作為機體天然存在的免疫反應，針對一切的外源性刺激。在入侵和初期其部位的屏障作用吞噬細胞的吞噬作用體液中的如補體、到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種可以激活NLRP3炎性復合體，引起機體的免疫炎性反應。NLRP3炎性復合體可感應識別RNA，如流感（Kannegantietal.,2006）、腦心肌炎（EMCV）（Rajanetal.,2011）、西尼1998）、丙肝（HCV）（Burdetteetal.,2012）、麻疹（Measles20112009HSV（Sergerie（（nigoldtal2003A還是有包膜的大分子A都可調(diào)節(jié)炎性復合體的活化。炎性復合體的激活可使p-1活化進而對I-1β或I-18前體進行剪切，促進I-1β或I-18的成熟和釋放引起炎癥反應多種和不同的成分可激活ps-1而IL-1β和IL-18又在對的免疫應答中起了重的作用（thinmtal.,2010）LP3炎性復合體介導的機體免疫應答機制很可能是機體抗的一種共同存在的形式。LP3炎性復合體抑制的機制主要有以下幾種：直接阻斷IL-1β信號通路；通過抑制F-kB活性的途徑來阻斷IL-1β；通過干擾的功能和抑制pa-1（Dorfleutnrtal200Txmanta.,2010；Xingtal,1999）。NLRP蛋白及其在炎癥反應中的作NLRP蛋白作為宿主抵抗病原體的第一道防線，固有免疫通過模式識別受體pattern-recognitionreceptors，PRRsPAMPs，激活下游信號通路，機體的免疫應答和炎癥反應。PRRs從信號轉導受體方面可分為以下三類:視黃酸誘導I樣的受體(RIG-I-likereceptors，RLRs)、Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)nucleotidebindingoligomerization，NODNOD-likereceptors，NLRs)，這些受體可被細菌和NF-κB、IFN調(diào)節(jié)因子、絲氨酸激活蛋白酶等信號通路激活從而活化炎癥因子（Andersetal.,2011；Kawaietal.,2009）。，NLRs是一個近年在炎癥反應中發(fā)現(xiàn)的胞漿蛋白，是免疫系統(tǒng)對病原體的一類重要感受器，不僅可以感受PAMPs，也能夠感知DAMPs，并且與其它蛋白共同組裝成多分子信號復合物炎癥小體(inflsome，活化半朧氨酸蛋白酶(caspase)導致炎癥因子的表達和釋放炎癥反（Akiraetal.,2006；Takeuchietal.,2010）。NLRs包括5個NOD成員，14個NLRP（NLRfamily,pyrincontaining）成員(以前也稱為NACHT-LRR-PYD-containingproteins，NALP，以及IPAF(theIL-1β-convertingenzyme(ICE)-tranactivaterInhibitorProtein（Petrillietal.,2007）NLR成員包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和NLRP6。作為NLRs中最大的一個亞族，NLRP蛋白絕大部分于樹突狀細胞、T細胞和B細胞、巨噬細胞、粒細胞、單核細胞等組織細胞中，其位置形式多種多樣（Vialaetal.,2004）。，NLRP32002年Martinon等（Martinonetal.,2002）提出由核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide—bindingandoligomerization．NBD／NACHT)、熱蛋白結構域(PYD)和富含亮氨酸重復(leucine-richrepeat，LRR結構域的蛋白與凋亡相關斑點炎性小體（亦稱炎性復合體）節(jié)器”（Morietal.2011；Schertzeretal.2011）。第一個被發(fā)現(xiàn)的炎性復合體是NLRP1炎性復合體。隨著研究的深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的炎性復合體體有NLRP3、NLRC4、AIM2、RIG-1炎性復合體等（Schroderetal.2010）NLRP3（nucleotide-bindingoligomerization-leucine-richrepeatscontainingpyrin3）炎性復合體是一種細胞質內(nèi)多蛋白復合物，是目前研結構域受體（NLRP3、pro-caspase-1蛋白、由胱天蛋白酶募集域(caspaserecruitment，CARD)和PYD構成的酸溶性膠原蛋白(ASC)等3部分組切成為成20Kd及10Kd的活性形式結構?；钚詂aspase-1剪切白細胞介素-al.2011）IL-1βIL-1β以分子量31Kd的無活性前體形式結構于細胞漿中，通過caspase-1的剪切成為成分子量為17Kd的成熟形式來發(fā)揮作用（Turneretal.,2014）。IL-1β（Naiketal.,2010）NLRP3炎性復合體可以感受和識別外源性和內(nèi)源性刺激。通過LRR，NLRP3與其配體MDPNLRP3，產(chǎn)生構象改變，其NACHT結構域來，然后序列齊整的NLRP3蛋白寡聚體通過三磷酸腺苷（ATP）的聚合的方式而形成，最后再通過ASC及半胱天冬酶(caspase)的途徑形成特殊的蛋白復合物—炎性復合體（Bouchier-Hayesetal.,2001），該炎性復合體激活后，可使pro-caspase-1變?yōu)橛写呋钚缘腸aspase-1，催化IL-1β的前體pro-IL-1β變?yōu)槌蒊L-1β，IL-1β，從而促進炎癥1β18PYD結構域則了NLRP3中的PYD結構域（Bouchier-Hayesetal.,2001；Tingal.2005）。到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥復合體主要存在于巨噬細胞、中NLRP3的分子結構及其分布情 PYDs-containingprotein3)，又名險信號的細胞質識別受體（Satohetal.2013）。其C端是一個約20個氨基酸殘基微生物之間的相互作用，在識別和感應PAMP上發(fā)揮重要作用。中間部分是白銜接起來的作用（Bryantetal.2009；Takahashi,2011），ASC的PYDcaspase-1（Agostinietal.2004）NLRP32014NLRP3炎性復合體參與機體炎癥的途徑及其機能夠感應和識別包括細菌真菌及其毒素和抗體如細胞壁成分、微生物的DNA、RNA等多種病原體（Dostertetal.,2009；Hafner-Bratkovicetal.,小顆粒等非病原體來源刺激物（Dostertetal.,2008；Halleetal.,2008），與此同萄糖等信號也會刺激其活化，參與免疫炎性反應（Baueretal.,2012；Brozetal.,2010）。性的pro-IL-1β前體和激活信號路徑即控制著無活性的pro-IL-1β向有生物學IL-1β2個信號路徑（Grossetal.,2011）。免疫細胞天然表達的內(nèi)源性NLRP3水平還不能夠到達炎性復合體的激活水平從而產(chǎn)生是NLRP3NLRP3成為活化多聚體。而活IL-1βIL-18的生成，這些相關研究也從另外一個角度闡述了該機制（Cruzetal.,2007；Sekiyamaetal.,2005）。二是溶酶體裂解蛋白水解酶的釋放，繼而使NLRP3炎性復合體得到激活（Halleetal.2008；Hornungetal.,2008）。NLRP3NLRP3性復合體的激活主要有3種機制，即ATP依賴的鉀離子外流，溶酶體的溶解以及ATP進到細胞質中，從而使NLRP3炎性復合體得到激活（Kahlenbergetal.,2004；Kannegantietal.,2007）。第二個機制是溶酶體的溶解。許多晶體或顆粒配體如蛋白酶類(B)至胞質后，繼而激活NLRP3炎性復合體（Gasseetal.,法溶酶體蛋白酶類的激活（Hornungetal.,2008）。第三個機制是活性氧ATP等炎性復合體活性劑的作用下產(chǎn)生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，硫氧還結合蛋白（thioredoxin-inctingprotein，TXNIP）與硫（thioredoxin，TRX）TXNIP與NLRP3相結合，達到激活炎性復合體的效果（Lee,2011；Zhouetal.,2010）清除ROS的方法也是防止炎性復合體活化的一條高效途徑之一（Casseletal.,2008；Dostertetal.,2008；Fukumotoetal.,2013）。NLRP3炎性復合體參與流感炎癥的途徑及其作到目前為止研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)流感能通過激活NLRP3炎性復合體引起免疫炎性反應，NLRP3炎性復合體在發(fā)生過程中具有非常重要的作用。早在2009年，Thomas等（Thomasetal.,2009）就發(fā)現(xiàn)流感RNA組可激活NLRP3炎性復合體而在流感過程中，NLRP3炎性復合體就參與到了免疫應答（Ichinoheetal.,2009）。有研究表明，流感質子會經(jīng)由細胞內(nèi)M2失衡狀態(tài)的（Ichinoheetal.,2010）。而另一個研究顯示，流感PB1-F2可促進NLRP3炎性復合體的活化，從而細胞因子IL-1β的分泌，最終導致免疫炎性反應（McAuleyetal.,2013）。有研究，構成NLRP3炎性復合體主要結構的NLRP3、ASC和Caspase-1中一個或者多個結構缺陷或者被敲除的小鼠在流感時支氣管肺泡液和中IL-1β和IL-18水平明顯下降肺部的清除能力受到一定程度的損害呼吸道炎癥明顯減輕而率顯著提（Allenetal.,2009；Ichinoheetal.,2009；Kannegantietal.,2006；Thomasetal.,2009）。本研究的目的和意NLRP3的研究主要集中在哺乳類動物，如人和小鼠（Huangetal.,2014。三黃雞是華南地區(qū)最重要的優(yōu)質肉雞品種，也是等重大疾病綜合防控壓力極大雞品種之一。但是，到目前為止，還沒有NLRP3在雞的組織本研究對三黃雞NLRP3進行了克隆和序列分析，通過重組原核表達純化蛋白出多克隆抗體，分別通過實時熒光定量PCR和免疫組化分析研究三黃雞NLRP3mRNANLRP3蛋白的組織分布。研究結NLRP3NLRP3在材試驗所用三黃雞為60日齡，購自華南實驗動物中心辣根酶標記抗兔IgG，購自中杉金橋生物技術HIS單克隆抗體，購自鼎國生物技術TotalRNA提取試劑購自寶生物工程（大連）Code:D312RNAisoReagent PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit購自寶生物工程（大連）有限公司Code:D6110APrimeScript5×PrimeScriptRnasedNTPMixture（10mMOligodTRandom6 TaKaRaExTaq購自寶生物工程（大連）Code:DRR001ATaKaRaExTaq(5U/uL) 10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus) dNTPMixtrue(各 6×Loading TaKaRaLATaq購自寶生物工程（大連）CodeNo.:RR02MATaKaRaLATaq(5U/μl) 25μL10×LAPCRBufferII(Mg2+ 1dNTPMixture(各2.5 400pMD18-TVector購自寶生物工程（大連）Code:D101ApMD18-TVector(50ng/uL) Control Ligation 30μL×5DNA凝膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）Code:DR-IDR-II28Rinse80ElutionSpin50Collection50質粒DNA小量純化試劑盒購自寶生物工程（大連）CodeSolution15Solution15Solution2428Rinse80ElutionSpin50Collection50SYBR?PremixExTaqTMPerfectReal 200（大連）DNAMarker100購自寶生物工程（大連）DNAMarker15000購自寶生物工程（大連）DAB試劑盒購自中杉金橋生物技術Code：ZLI-9017(12)中性樹膠(顯微光學用)購自標本模型廠產(chǎn)品蘇木素購自Fisherbrand公司產(chǎn)IPTG購自寶生物工程（大連）（EB自鼎國生物技術。RNA20min。⑵75%無水乙 0.1%DEPC ⑴10mg/mL溴化乙錠（EB）100mgEB10mL 冰乙 0.5MEDTA（pH 100mL50大腸桿菌感受態(tài)的及轉化用溶液的配⑴氨芐青霉素(AMP)液：將1g氨芐青霉素溶于10mL去離子水中，終濃度100mg/mL，用0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝成1mL，-20℃?zhèn)溆肵-gal：20mgX-gal溶于1mL二甲基甲酰胺，終濃度20mg/mL，分裝，-LB胰蛋白 酵母提取 950mL10MNaOH調(diào)pH7.41L，12120minLB15g12150℃以下時，倒制平板。如要加入抗生素如氨芐青霉素（Amp)卡那霉Amp/LB/X-gal/IPTG在澆制好的Amp/LB平板上加入40uLX-gal(20mg/mL以及20uLIPTG(200mg/mL)，用滅菌涂棒均勻的涂布于平板表面，倒置37℃溫育至液體完全吸⑴10%福爾固定市售100mL，稱量Na2HPO4·12H2O39.5g，NaH2PO4·2H2O10.95g，加蒸1000mL。⑵0.02MPBS(pH1000mL水中加NaCl8.5g，Na2HPO42.8g，NaH2PO40.4g⑶0.01M檸檬酸緩沖液(pH1000mL水中加檸檬酸三鈉3g，檸檬酸0.4g液氮生物容器：YDS-20，亞西橡塑機器超速離心機：TGL-16H，醫(yī)學儀器；冷凍臺式離心機：TGL-16R，醫(yī)學儀器PCR擴增儀：PTC1148，BIO-RAD公司熒光定量PCR儀：Bio-RadiQ5opticlesystem，BIO-RAD公司；可調(diào)式微量移液器：法國Gilson公司、芬蘭大龍公司；水平電泳槽：DYY-6C型，市六一儀器廠凝膠透射分析儀：UV-3B，醫(yī)學儀器；超低溫冰箱：925，ThermoForma，；電熱恒溫鼓風干燥箱：101-1-BS，躍進醫(yī)療器械廠單人單面凈化工作臺：SW-CJ-IFD，蘇州凈化設備，中國蘇州；電子天平：JM2102，余姚紀銘稱重校驗設備；便攜式pH計：PHB-3，三信儀表廠，中國數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-1，常州澳華儀器。研缽，缽棒，藥匙，錫箔紙，各種玻璃耗材均購自廣州叢源儀器。全自動脫水機：TP1020Leica，德國；烘片機：HI1220Leica輪轉式切片機：RM2145Leica光學顯微鏡：XSP-2C光學儀器五廠，中國；生物組織包埋機：BM-V孝感市電子儀器廠，中國孝感；電熱恒溫水浴鍋：KWS寧波自動化儀表廠，中國浙江；電熱恒溫鼓風干燥箱：101-1-BS躍進醫(yī)療器械廠，中國；顯微照相設備：Axioskop2plusZEISS，德國；PCR引物設計軟件：Primer5.0DNA序列數(shù)據(jù)庫：NCBI/Genbank/nucleotide保守結構域分析：NCBI/Conserveds方三黃雞NLRP3的克隆與鑒三黃雞總RNA6小時；塑料制品用0.1%的DEPC水溶液浸泡過夜后牛皮紙包裹，高溫提取步驟參照TrizolReagent⑴將已速凍的三黃雞組織迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用缽棒快速研100mg1mLRNAisoReagent5min⑵加入200μl氯仿蓋緊離心管蓋用力震蕩待充分溶液呈乳白狀后，5min后，4℃12,000×g15min。10min。4℃，12000g10min⑸棄去上清，緩慢沿離心管壁加入75%的乙醇1mL洗滌RNA沉淀4℃12,000g離心5min；棄去乙醇2-5分鐘，加適量的DEPC水溶解RNA1μL測定濃度和純度，其余RNA保存于-80℃。參照GenBank登錄的原雞NLRP3設計特異性引物，用以擴增NLRP3引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成，上游引物為5'-AGCACGCCATGGCGATGGCAGGAGAAGAAA-3'5'-ATATAGCTCGAGTCACCGCAGGACACGCAG-3'，Tm60℃。cDNA⑴據(jù)PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit0.2mLPCR管中配制下列混合液：TotalOlidodT10mMdNTPDEPC⑵在PCR65℃⑶在上述PCR上述變性，退火后反應 RNase PrimeScript DEPC ⑷在PCR 1uLcDNA進行濃度測定，取適量cDNA進行PCR擴增，其余小量分PCR擴增三黃雞NLRP3依據(jù)TaKaRa提供的引物合成說明書，用超純水稀釋引物至終濃度20pmol/uL。稀釋之前用低速離心機離心數(shù)秒，稀釋操作過程中要操作，避TaKaRaLATaq說明書確定PCRPCRPCRdNTPTaKaRaLA10×LATaqPCR 35cycles 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCRPCRDNADNA1.5mLEp管中，稱量凝膠重量并計算凝膠體積（1mg=1μL的比例進行計算）。4DR-IBuffer，65℃6～10min，并于其間輕搖幾次EPDR-IBuffer1/2DR-IIBuffer，顛倒幾次使⑷將SpinColumn安置于CollectionTube上，將溶液倒入SpinColumn內(nèi)，12000rpm1min，棄濾液。500μLRinseASpinColumn12000rpm30s700μL的RinseB加入SpinColumn12000rpm30s⑻將SpinColumn置于新的EP30μLDNA12000rpm1min1μL感受態(tài)細胞（JM109）的（氯化鈣法-80℃40μl在瓊脂平板上復蘇，37℃37℃2-3mL滅菌的LB培養(yǎng)基，用滅菌的牙簽挑取平板上的單菌落，接種到LB37℃搖床培養(yǎng)過夜。⑷取前一天搖的菌液100μl于新的滅菌10mLLB中，放到37℃搖，2h100mL250mL3min，4℃7000prm10min，棄上清。3mL0.1mol/LCaCl2輕輕吸打懸浮菌體，然后兩管并為一管，4℃7000rpm離心，10min，棄上清。1mL預冷的CaCl215%100μl1.5mLEp-80℃0.2mLPCR(載體和回收產(chǎn)物的摩爾質量pMD18-TVector（50ng/μL）PCR回收產(chǎn)物

ab滅菌雙蒸 cLigation 50-100μL5-10μLPCR連接產(chǎn)物，30min。37℃250rpmAmp/LB/X-gal/IPTG平板上，待菌液被平板吸收后，將37℃溫箱中倒置培養(yǎng)過夜。陽性質粒菌落和質粒PCR鑒定菌落PCR鑒定:10×LATaqBufferdNTPMixture

上游引 下游引 TaKaRaLA 滅菌雙蒸 PCR管蓋，短暫離心后放入PCR儀。PCR 30more 取上述PCR產(chǎn)物進行電泳，選出陽性菌落。3mL(100μg/mL)LB培養(yǎng)基中，37℃250μL的SolutionI(含RNaseA1)，充分懸浮細菌沉淀。250μLSolutionII5～6次使其混勻，讓菌體充400μL4℃預冷的SolutionIII5～6次使其混勻，直2min，12000rpm10min，取上清。SpinColumnCollectionTubeSpinColumn12000rpm1min，棄濾液。500μLRinseASpinColumn12000rpm30s，700μL的RinseB加入以上SpinColumn12000rpm30s，棄⑼將SpinColumn40μLDNA1min，12000rpm1min，回收⑾取1μL質粒DNApMD18-T-C-NLRP3質粒PCR1：50PCR擴增，反25uL如下：10×LATaqBufferdNTPMixture

上游引 下游引 TaKaRaLA 稀釋質 滅菌雙蒸 PCR 30more 1μLPCRPCRpMD18-T-C-NLRP3NcoⅠXhoⅠ雙酶20μL體系中進行，包括：10×K37°C16～20h1%將提取的重組質粒送至寶生物工程(大連)公司，序列正確的三黃雞質粒命名為pMD18-T-C-NLRP3。用DNAMAN6.0、DNAStar7.0軟件對不同物種的NLRP3序列和氨基酸序列進行同源性分析；用DNAMAN6.0構建NLRP3系統(tǒng)進化樹；用ProtParamTool()分析氨基酸組成、等電點等理化性質；用SignalP4.1Server()分析蛋白質信號肽；用ProtScale()分析蛋白質的疏水性；用Conserveds工具，分析三黃雞NLRP3保守區(qū)結構域；用TMpred()分析預測蛋白質的跨膜三黃雞NLRP3熒光定量實根據(jù)Genbank中三黃雞NLRP3(登錄號為KF318520)設計1對特異性R1,253bp中原雞β-actin(登錄號為NM_205518)設計1對特異性引（F2和R2用以擴增三黃雞β-actin，預期擴增大小約為167bp。所用引物寶是生物工程(大連)合成。:--–-PCR擴增三黃雞8個組織的NLRP3熒光片取三黃雞的心、肝、脾、肺、腎、腦、氣管、法氏囊提取A-2..1.3。依據(jù)a20pmol/uL中要操作避免引物粉末飛出影響終濃度按照aaExq說明書確定PR反應體系。分別以三黃雞各個組織cDNA為模板，NLRP3熒光片段PCR反應體系NLRP3熒光片段PCR反應體 dNTP Forward Reverse TaKaRaEx NLRP3熒光片段的PCR反應條件 35 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCRPCR擴增三黃雞8個組織的β-actin熒光片分別以三黃雞各個組織cDNA為模板，β-actin熒光片段的PCR反應體β-actin熒光片段的PCR反應體10×ExTaq dNTP Forward Reverse TaKaRaEx β-actin的PCR反應條件 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCRPCR感受態(tài)細胞（JM109）的（氯化鈣法，具體方法參照pMD18-T、0熒光定量PCR實驗程重組質粒正確后利用1ug/ul的重組質粒模板作為標準曲線的最高106個梯度。采用SYBRGreenI嵌合熒光法，用優(yōu)化好的條件進行實時熒光定量PCR擴增。SYBR?PremixEx Forward Reverse ROXReferenceDye 重組質 樣品進行實時熒光定量PCRSYBR?PremixEx Forward Reverse ROXReferenceDye 熒光定量與β-actin實驗程序均為Stage30StageStage運用ABIreal-timeRT-PCR7500systemsoftware軟件對結果進行統(tǒng)計計算，SPSS20.0P值檢三黃雞ST3GalIII的原核表達與多抗的（1）PCRNLRP3ORF以前面的重組質粒pMD18-T-C-NLRP3為模板，設計引物上游引物（F3）：5'-AGCACGCCATGGCGATGGCAGGAGAAGAAA-3'，NcoⅠ位點下游引物（R3）：5'-ATATAGCTCGAGTCACCGCAGGACACGCAG-3'，有XhoⅠ位點50倍的pMD18-TC-NLRP3質粒為模板進行PCR擴增，反應體系組10×ExTaqdNTPP2-P2-TaKaRaExPCR 35moretimes 2min30s 將所得的PCR產(chǎn)物命名為PCR、。PET32α（+）-NLRP3質粒PCR、0。質粒PET32α（+）-NLRP3的雙酶切鑒定10×K重組質粒及分選取質粒PCR（大連有限公司，命名為PET32α（+）-NLRP3。三黃雞NLRP3將鑒定后的陽性重組質粒PET32α（+）-NLRP3重新轉化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)中,并均勻涂布于含Amp的LB平板上，溫箱培養(yǎng)過夜。同時設置4~6OD600達到0.8~1.0時，留取部分菌液保種。1mM的IPTG37°C5hSDS-制膠按照垂直板電泳槽的使用說明組裝電泳槽使用12%的分離膠和5%的1mL10min，4°C12000rpm離心10min，棄上清，并用50μL0.2MTris-Cl（pH8.0）重懸沉淀，加入50μL的10uL上樣，同時設立蛋白標準分子量對照。電泳80V120V，染色當電泳結束后取下凝膠，用不低于5倍體積的考馬斯亮蘭，4hWesternBlottingSDS結束后，取出凝膠，并在電轉緩沖液中平衡，把裁剪好的PVDF5min后再墊-濾紙-PVDF膜-濾紙-纖維墊的順序，裝入轉印夾中。PVDF膜側接正極，4°C200mA2h。PVDFS5～10min。用鉛筆標出作為分子量的用TBST對PVDF膜進行脫色，直至紅色條件下孵育過夜）加入HIS單克隆抗體（1:1000），搖室溫孵育1h（或2～8°C條件TBST35min加入稀釋的辣根酶標記抗兔IgG（1:5000），搖室溫孵育30min。TBST35min。檢測將PVDF膜置于TanonFineDoX6全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)的暗箱中，將稀釋好的HPR化學發(fā)光試劑加至PVDF膜上，經(jīng)一定時間，在電腦屏幕三黃雞NLRP3重組蛋白的純表達NLRP31L4h的細菌培養(yǎng)物置于預先稱重的離心管中，4℃5000g棄上清，稱沉淀的重量，每克(濕重)5mLPBS緩沖液，輕輕懸動，12000g10PBS2×SDS凝5min，12000rpm3min，進行SDS電泳。電泳后，用蒸餾水反復凝膠3遍，再用PBS3遍。用4℃預冷0.25mol/LKCl30s后，準確切下顯有白色的含有目的蛋白的凝膠條帶用適量PBS徹底溶研磨至碎并于液氮快速凍融3次，4℃靜置過夜。4000g離心，201mg/mL。三黃雞NLRP3蛋白多克隆抗體的。動物免疫將上述純化的蛋白(濃度約1mg/mL)與弗氏完全佐劑混合后的用量為500μg/只，取500μL純化的重組蛋白，加入等量的弗氏完全佐劑，并用兩個注射器和膠管成乳白色乳劑后免疫新西蘭兔劑的鑒定：將。47d耳靜脈少量采血，經(jīng)ELISA和瓊擴檢測抗體效價，合格后即可采血。50mL滅菌離心管收集的分離及保存采到的血液先放入37℃溫箱中1h，然后將其轉入4℃冰5630min滅補體，加入NaN30.02%，分裝后-80℃保存。（8三黃雞NLRP3的組織學分1cm，放入10％中爾固定48h以上。10h⑶梯度(70%：5h；80%：4h；90%：3h；95%：2h；100%I：20min；100%II：20min)脫水。二甲苯(二甲苯I：25min；二甲苯II：25min)透明。561.5h4μm42°C12h90%、80%、70%各3min，蒸餾水2min)。3%H2O2(甲醇:H2O2=9:1)10min0.02MPBS5min×30.02MPBS5min×31:200稀釋的一抗，用PBS替代一抗作為空白對照，37℃1.5h0.02MPBS5min×31:4000稀釋的二抗的兔抗羊IgG，37℃1h0.02MPBS5min×3DAB顯色：DAB5min0.02MPBS5min×4⒄1:101min10min⒅梯度脫水(70%、80%、90%、95%各3min，無水乙醇I5min，無水乙醇II5min，二甲苯I10min，二甲苯II10min)。無棕黃色顆粒的判為5%的判為弱陽性；5%~50%的判為陽性；明亮的棕黃色顆粒在組織中零星分布且比例大于50%或片狀染色的的判為三黃雞NLRP3的克隆與序列分三黃雞NLRP3的克隆與質粒的鑒的NLRP3的理論大小相符。將目的片段克隆到pMD18-T載體，轉化E.coli三黃雞NLRP3的PCR鑒定和雙酶切鑒定結果（圖3.1。重組質粒pMD18-T-C-NLRP3經(jīng)分析結果正確并將序列上傳到NCBI上序列號為KF318520圖3.1三黃雞NLRP3的PCR鑒定、雙酶切鑒定結（M：DL5000DNAMarker；1：三黃雞NLRP3的PCR產(chǎn)物；2：三黃雞NLRP3基三黃雞NLRP3的序列分將三黃雞NLRP3與牛（ ）、羊（KM236558）、 進行序列比對發(fā)現(xiàn)三黃雞NLRP352%（3.3）。ProParamNLRP3蛋白的理化性質分析表明，三黃雞NLRP3編碼734個氨基酸蛋白分子量為82720.8u等電點為5.62。ProtScale對其的疏水性進行分析發(fā)現(xiàn)該蛋白最大的疏水指數(shù)位于第479位，值為2.400，最小疏水指數(shù)位于第637位，值為-3.300（圖3.4）。SignalP4.1Server對其信號肽預測分析表明該蛋白不存在信號肽（圖3.5）。Conserveds工PYD結構域、NACHT結構域、LRR結構域，是結構保3.7）圖3.2NLRP3的同源性比圖3.3NLRP3的系統(tǒng)進化3.4NLRP33.5NLRP33.6NLRP33.7NLRP3三黃雞NLRP3熒光定量結果與分三黃雞熒光定量實驗NLRP3和β-actin的鑒經(jīng)RT-PCR反應后，得到三黃雞NLRP3和β-actin的片段，用于熒光定量PCR分析2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在253bp167bp處有一條相應的特異性條帶，其大小與理論推測值相符（3.8圖3.8用于熒光定量三黃雞NLRP3和β-actinPCR結果（M：DL100DNAMarker；1：肝臟熒光定量NLRP3的PCR產(chǎn)物；2：肝臟熒光定量β-actinPCR產(chǎn)物）溶解曲線是采用SyberGreenI方法進行real-timePCR時，判斷產(chǎn)物反應特度漸漸增加下，原來和SyberGreenI分子結合的PCR產(chǎn)物由雙鏈變性分解成單鏈形式，分解后的PCR產(chǎn)物不能再和SyberGreenI結合。大多數(shù)的實時熒光定量儀器的程序設置為每升高1度溫度，信號就會被儀器一次。曲線的橫坐標驗的溶解曲線如圖3.9和圖3.10所示：三黃雞NLRP3和β-actin的溶解86℃82.5℃，峰平滑、單一，說明該反應的特異性好。圖3.10三黃雞β-actin的熒光定量實驗的溶解曲熒光定量PCRSyberGreenPCRPCR反應的進行過程中不為每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，儀器便一次熒光強度信號，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，PCR反應和熒光信號NLRP3和β-actin的熒光定量PCR擴增曲線分別如圖3.11和圖3.12期（熒光信號指數(shù)擴增期）PCR擴增過程PCR擴增過程中的PCR產(chǎn)物PCR擴增PCR產(chǎn)物量變化和熒光信號強度的變化情況。在平臺期，PCRPCR擴圖3.11三黃雞NLRP3的熒光定量PCR擴增曲圖3.12三黃雞β-actin的熒光定量PCR擴增曲將NLRP3和β-actin的重組質粒作為模板，模板進行梯度稀釋PCR絕對定量標準曲線的標準樣品。把標準樣品和未知的待測樣PCRPCRCt值作為縱坐標構建標準曲線從而出NLRP3和β-actin的標準曲線分別如圖3.13和3.14所示。NLRP3的標準曲線方程為：y=-2.758973x+29.080881(R2=0.999497)此標準曲線的R2>0.99。β-actin的標準曲線方程為：y=-2.758807x+22.635201(R2=0.999815)，此標準曲線的R2>0.99。圖3.13三黃雞NLRP3的標準曲圖3.14三黃雞β-actin的標準曲NLRP3在各個組織的相對表達水組織中均有表達。表3.1和圖3.15結果顯示，NLRP3在三黃雞的肺臟和氣管中表達量明顯高于其它組織，而在其他組織的表達無明顯差異。NLRP3表3.1NLRP3在各個組織的相對表達水 肝 脾 肺 腎 大 氣 法氏 (**圖3.15三黃雞NLRP3在各個組織的相對表達水三黃雞NLRP3的原核表達與多抗PCR擴增獲得NLRP3片斷，將片段與PET32α(+)載體同時分別進行/XhoⅠ雙酶切然后連接獲得PET32α(+)-NLRP3轉化至BL21(DE3)感受態(tài)中3.163.16PET32α(+)-NLRP3質粒PCR（M：DL5000DNAMarker；1：PCR；2PET32α(+)-NLRP3NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物三黃雞NLRP3將陽性BL21(DE3)感受態(tài)細胞，置于IPTG濃度為1mM的LB培養(yǎng)基37°C誘導5h后，電泳，在100kDa處出現(xiàn)特異的表達蛋白條帶。而PET32α(+)空載體WB檢測，得到單一條帶，且大小與目的條帶一致（3.17,3.18）3.17PET32α(+)-NLRP3（M:marker；1：PET32α(+)不誘導；2：PET32α(+)誘導；3：PET32α(+)-NLRP3；4：PET32α(+)-NLRP3）圖3.18His單克隆抗體檢測NLRP3的表3.19,3.20。3.19SDS3.20WB三黃雞NLRP3蛋白多克隆抗體的將好的抗體用WB方法檢測，圖3.21結果顯示：所的抗體能與抗原有效的結合并且無雜帶，所以所的抗特異性較好。圖3.21抗特異性檢三黃雞NLRP3的組織學分檢測結果表明：三黃雞NLRP3蛋白在細胞的細胞質中表達。NLRP3強陽性反應，環(huán)狀軟骨細胞呈（圖3.22A）。肺泡上皮細胞呈現(xiàn)強陽性反性（圖3.22E）。在法氏囊，髓質中的淋巴細胞呈現(xiàn)強陽性反應，而皮質細胞則（圖3.22F）在肝臟，部分肝細胞呈現(xiàn)中至強陽性反應（3.22G）。在腎臟，大多數(shù)腎小管上皮細胞呈現(xiàn)中至強陽性反應，而腎小球和腎小球囊細胞呈（圖3.22H）A性。Scanbar=50μm。BScanbar=50μmC心肌細胞呈弱陽性至中強陽性，心肌間結締組織呈。Scanbar=50μmDScanbar=50μmE脾臟內(nèi)皮網(wǎng)狀細胞呈弱陽性至中強陽性，淋巴細胞呈。Scanbar=50μmScanbar=50μmGScanbar=50μmH大多數(shù)腎小管上皮細胞呈中至強陽性，腎小球和腎小球囊細胞呈。Scan圖3.22NLRP3在三黃雞的檢測組織內(nèi)分布的免疫組織化學檢(pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs)和受損或細胞釋放的損傷相關模式分子(damageassociatedmolecularpatterns,DAMPS)，激活并參與到機體性免疫應答之（Elinavetal.,2011）。然而，炎性復合體活化失調(diào)會產(chǎn)生過多的細胞因子從而導致多種炎癥性疾病的發(fā)生（Strowigetal.2012）。NLRP3作為最重要的感受器非常顯著的作用（Burdetteetal.,2012；Pontilloetal.,2012；Pontilloetal.,2012；Shietal.,2012）NLRP3蛋白的組織學表達分布可以有助于闡明其在雞炎NLRP3在雞的組織特異性表達NLRP3在禽類炎癥性疾病中作用的進一步研究。本研究對三黃雞NLRP3進行了克隆和序列分析比對。結果顯示，該52%BirdS（Birdetal.2002）通過對雞IL-1β序列進行分析，也發(fā)現(xiàn)了IL-1β在哺乳類動物和禽類制可能相異。我們關于雞NLRP3與其他物種同源性的分析結果，將會為哺炎性復合體的激活和調(diào)控信號通路與其他信號通路通路有著廣泛和密切的F-κBp-1（Anndta.2011；Pothlichtta.2013；Suttrwlatal2014hngtal2012）。本試驗所LP3LP3炎性復合體相關信號通路的深入研究，從而進一步探究哺乳類和禽類炎癥反應機制的差異。實時熒光定量和免疫組織化學檢測的結果分別顯示了NLRP3和蛋白在三黃雞組織中的表達和分布情況。NLRP3mRNA在三黃雞所檢測的所有組織中NLRP3mRNA在肺臟和氣管中的表達量遠遠高于其在的可激活NLRP3炎性復合體改變下游因子IL-1β的表達（Yu細胞均呈現(xiàn)出強陽性反應。這個結果與Mansson等（Manssonetal.,2011）關于NALP3mRNA和蛋白存在于鼻息肉和正常的上呼吸道鼻粘膜的研究結果一致。中的皮質和髓質淋巴細胞則呈現(xiàn)強陽性，這與我們之前關于NLRP3蛋白在BALB/c小鼠組織中分布情況的研究結果一致（Huangetal.,2014）。由于法氏囊是禽類相比于哺乳類動物所特有的免疫在雞對抗病原體中扮演著重要的角色，從該試驗結果可推測，NLRP3可能是該免疫發(fā)生炎癥反應的重要分子。同樣，NLRP3蛋白也可以在人類的主要免疫細胞中被檢測出來（Kummeretal.2007）。以上結果均表明，NLRP3在炎癥反應中的作用具有位點專一性。BALB/cNLRP3蛋白表達的免疫組織化學結果顯示，只有極少量的肝細胞呈現(xiàn)中至強陽性反應（Huangetal.,2014），但是本試驗中大部分肝細胞中卻沒有出現(xiàn)，這與之前人類的膠質細胞分泌IL-1β結果相異（Yaoetal.,1992）。這些結果說明，NLRP3組織分布在不同的物種間有顯著的差異。NLRP3對于調(diào)控炎性復合體激活以避免過度活化所造成的損傷具有非常重2014NLRP3在雞的組織特異性表達和分布的詳細數(shù)據(jù)，不利于研究NLRP3在禽類炎癥性疾病中作用。本研究對三黃雞NLRP3進行了克隆和序列分析，通過重組原核表達純化蛋白出三黃雞NLRP3多克隆抗體，分別通過實時熒光定量PCRNLRP3的mRNA相對表達水平及NLRP3蛋白的組織分布。研究結果顯示，三黃雞NLRP3與牛、羊、豬、狨、人、獼猴、小鼠和大鼠的同源性分別為54.2%、53.9%、53.7%、55.4%、54.3%、54.5%、53.5%、53.7%。該在哺乳類動物間52%。NLRP3mRNA在所NLRP3蛋白的細胞質表達。本研究關于雞NLRP3克隆及序列分析，組織特NLRP3在雞炎癥性疾病中的作用和為進一步NLRP3在不同物種的功能和進化提供了基礎數(shù)據(jù)，有助于禽類炎癥性疾病的預 有一點的不端和隨便的行為寧老師的良苦用心鞭策著我在過去兩年的研究程中給予的和幫助。醫(yī)解剖組胚教研室葉亞瓊師姐、梁美樂、張麗華同學，在實驗和寫作過程中過以及過我的所有老師、同學以及已畢業(yè)的師兄師姐。在畢業(yè)之際，我還要感謝我的家人。感謝他們在我兩年的階段，始終包容著我的，支持著我的決定，在物質上和精神上給予我無微不至的關在即將完成之際，再一次向所有關心、幫助、支持我的親人、老師、同學和朋友表達我最誠摯的謝意!向一直培養(yǎng)了我七年的華南表示最衷心AgostiniL,MartinonF,BurnsK,etal..NALP3formsanIL-1beta-processinginflsomewithincreasedactivityinMuckle-Wellsautoinfltorydisorder[J].Immunity,2004,20(3):319-AkiraS,UematsuS,TakeuchiO.Pathogenrecognitionandinnateimmunity[J].Cell,AllenIC,ScullMA,MooreCB,etal..TheNLRP3inflsomemediatesinvivoinnateimmunitytoinfluenzaathroughrecognitionofviralRNA[J].Immunity,2009,30(4):556-AnandPK,MalireddiRK,KannegantiTD.Roleofthenlrp3inflsomeinmicrobialinfection[J].FrontiersinMicrobiology,2011,2:12.AndersHJ,MuruveDA.Theinflsomesinkidneydisease[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrology,2011,22(6):1007-1018.BarlanAU,GriffinTM,McguireKA,etal..AdenomembranepenetrationactivatestheNLRP3inflsome[J].JournalofVirology,2011,85(1):146-155.BauerC,DuewellP,LehrHA,etal..ProtectiveandaggravatingeffectsofNlrp3inflsomeactivationinIBDmodels:Influenceofgeneticandenvironmentalfactors[J].DigDis,2012,30Suppl1:82-90.BauernfeindFG,HorvathG,StutzA,etal..Cuttingedge:NF-kappaBactivatingpatternrecognitionandcytokinereceptorslicenseNLRP3inflsomeactivationbyregulatingNLRP3expression[J].JournalofImmunology,2009,183(2):787-791.BirdS,ZouJ,WangT,etal..Evolutionofinterleukin-1beta[J].CytokineGrowthFactorRev,BonaE,AnderssonAL,BlomgrenK,etal..Chemokineandinfltorycellresponsetohypoxia-ischemiainimmaturerats[J].PediatricResearch,1999,45(4Pt1):500-509.Bouchier-HayesL,ConroyH,EganH,etal..CARDINAL,anovelcaspaserecruitmentprotein,isaninhibitorofmultipleNF-kappaBactivationpathways[J].JournalofBiologicalChemistry,2001,276(47):44069-44077.BrozP,NewtonK,LamkanfiM,etal..RedundantrolesforinflsomereceptorsNLRP3andNLRC4inhostdefenseagainstSalmonella[J].JournalofExperimentalMedicine,BryantC,FitzgeraldKA.Molecularmechanismsinvolvedininflsomeactivation[J].TrendsinCellBiology,2009,19(9):455-464.BurdetteD,HaskettA,PresserL,etal..HepatitisCactivatesinterleukin-1betaviacaspase-1-inflsomecomplex[J].JournalofGeneralVirology,2012,93(Pt2):235-246.ByrneSN,HallidayGM,JohnstonLJ,etal..Interleukin-1betabutnottumornecrosisfactorisinvolvedinWestNile-inducedLangerhanscellmigrationfromtheskininC57BL/6mice[J].JournalofInvestigativeDermatology,2001,117(3):702-709.CasselSL,EisenbarthSC,IyerSS,etal..TheNalp3inflsomeisessentialforthedevelopmentofsilicosis[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(26):9035-9040.CruzCM,RinnaA,FormanHJ,etal..ATPactivatesareactiveoxygenspecies-dependentoxidativestressresponseandsecretionofproinfltorycytokinesinmacrophages[J].JournalofBiologicalChemistry,2007,282(5):2871-2879.CsakT,GanzM,PespisaJ,etal..Fattyacidandendotoxinactivateinflsomesinmousehepatocytesthatreleasedangersignalstostimulateimmunecel