基因工程生化產(chǎn)品制備原理及方法

關(guān)于基因工程生化產(chǎn)品制備原理及方法第1頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.1概述生物技術(shù)最為活躍的研究領(lǐng)域?yàn)獒t(yī)學(xué)領(lǐng)域→集中于開展活性蛋白和多肽類藥物及單克隆抗體的研究人類基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)研究的進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與植物、蛋白質(zhì)工程、抗體工程、基因治療和生物芯片等新技術(shù)的建立且取得重大突破與發(fā)展→新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)第一個(gè)生物技術(shù)藥物：人胰島素，1982年第2頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)1993年生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品銷售達(dá)77億美元，2000年已超過200億美元已得到臨床應(yīng)用的基因工程藥物有：人胰島素、人生長(zhǎng)激素、干擾素、乙肝疫苗、人促紅細(xì)胞生成素（EPO）、GM－集落刺激因子（GM－CSF）、組織溶纖酶原激活素、白細(xì)胞介素－2及白介素－11等。正在研究的有降鈣素因子、腫瘤壞死因子、表皮生長(zhǎng)因子等140多種。隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展，多肽與蛋白質(zhì)類藥物的研究與開發(fā)，已成為醫(yī)藥工業(yè)中一個(gè)重要的領(lǐng)域，同時(shí)給生物制劑帶來了新的挑戰(zhàn)。第3頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用限制實(shí)際應(yīng)用中，蛋白質(zhì)類藥物受到一定限制，大多數(shù)只能注射給藥或局部用藥。Why？為克服這些缺陷→合成這些天然蛋白質(zhì)的較小活性片段，即“多肽模擬”或“多肽結(jié)構(gòu)域”，又叫“小分子結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)”?？煽诜欣谟善つw、粘膜給藥，用于治療免疫缺陷癥、HIV感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，其制造成本也更低。該設(shè)計(jì)思想也已應(yīng)用于多糖類藥物、核酸類藥物和模擬酶的有關(guān)研究。小分子藥物設(shè)計(jì)屬于第二代結(jié)構(gòu)相關(guān)性藥物設(shè)計(jì)，能替代原先天然活性蛋白與特異靶相互作用口服應(yīng)用時(shí)生物利用度低，會(huì)受到消化酶的破壞，在胃酸作用下不穩(wěn)定，在體內(nèi)半衰期較短第4頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月在給藥方式的研究方面，對(duì)注射用溶液和注射用無菌粉末（目前上市的多肽蛋白質(zhì)類藥物多為此種劑型），除了繼續(xù)改進(jìn)其穩(wěn)定性外，還通過一些其他技術(shù)手段，研制出了化學(xué)修飾型、控釋微球型和脈沖式給藥系統(tǒng)。如PEG修飾能有效地改善多肽蛋白質(zhì)類藥物的免疫原性，增加穩(wěn)定性，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，減少毒副作用等。PEG-腺苷脫胺酶已投放市場(chǎng)，PEG-天冬酰胺酶，PEG-IL-2，PEG-SOD，均已進(jìn)入臨床。非注射途徑的給藥如鼻腔、直腸、肺部給藥方面也取得重大進(jìn)展。第5頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程藥物的研究進(jìn)展第一代基因工程藥物是針對(duì)因缺乏天然內(nèi)源性蛋白所引起的疾病。應(yīng)用基因工程技術(shù)去擴(kuò)大這類多肽蛋白質(zhì)的產(chǎn)量以替代或補(bǔ)充體內(nèi)對(duì)這類活性多肽蛋白質(zhì)的需要，主要是以蛋白質(zhì)激素類為代表的，如人胰島素、胰高血糖素、人生長(zhǎng)激素、降鈣素、生長(zhǎng)激素及α-EPO等。第二代基因工程藥物是根據(jù)內(nèi)源性多肽蛋白的生理活性，應(yīng)用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)這些極為稀有物質(zhì)，以超正常濃度劑量供給人體，以激發(fā)它們的天然活性作為其治療疾病的藥理基礎(chǔ)，主要是以細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子為代表的，如G-CSF，GM-CSF，α-IFN，γ-IFN和tPA等。第6頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程藥物的研究進(jìn)展應(yīng)用重組DNA技術(shù)表達(dá)人源性抗體或?qū)⒖贵w小型化(如Fab抗體，單鏈抗體、單域抗體，分子識(shí)別抗體等)，與非人源化抗體和完整抗體相比，其免疫原性弱，穿透力強(qiáng)，表達(dá)效率高。人源化抗體藥物和小型化抗體靶向藥物正成為腫瘤治療，自身免疫性疾病，器官移植排斥和艾滋病防治藥物的又一研究熱點(diǎn)。

第7頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月利用微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)基因工程藥物是目前工業(yè)化生產(chǎn)基因工程藥物的最主要方法。從1982年重組胰島素批準(zhǔn)上市以來，現(xiàn)已有近40種基因工程蛋白質(zhì)藥物投放市場(chǎng)，主要用于治療癌癥、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、細(xì)菌感染、骨損傷、創(chuàng)傷、代謝病等疑難病。近年來，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程疫苗和利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)基因工程人類蛋白質(zhì)藥物的研究也取得重大進(jìn)展。第8頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月1、轉(zhuǎn)基因植物基因工程疫苗1990年以來利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程疫苗的研究得到了迅速的發(fā)展。將抗原基因?qū)胫参?，讓其在植物中表達(dá)，人或動(dòng)物攝入該植物或其中的抗原蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生對(duì)某抗原的免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗的研究主要集中在煙草、馬鈴薯、蕃茄、香蕉等植物。

第9頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程藥物利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)基因工程人類蛋白質(zhì)藥物，其成本較微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)基因工程藥物大大降低→近年不少研究者從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程藥物的研究。基本方法：將藥用蛋白質(zhì)基因連接到乳汁蛋白質(zhì)基因的調(diào)節(jié)元件下游，然后將連接產(chǎn)物顯微注射到哺乳動(dòng)物受精卵或胚胎干細(xì)胞，當(dāng)轉(zhuǎn)基因胚胎長(zhǎng)成個(gè)體后，在泌乳期藥用蛋白質(zhì)基因表達(dá)，從動(dòng)物乳汁可獲得基因工程藥物。第10頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器1988年開始在大哺乳動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器中表達(dá)基因工程藥物以來，在動(dòng)物的奶汁中生產(chǎn)出的人類蛋白質(zhì)藥物：牛奶：抗凝血酶、纖維蛋白原、人白血清蛋白、膠原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等；山羊奶：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、組織型溶纖維原激活因子、單克隆抗體；綿羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纖維蛋白原、蛋白質(zhì)C，豬奶中亦有蛋白質(zhì)C、凝血因子IX、纖維蛋白原、血紅蛋白。乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程藥物的研究已取得了一些成功經(jīng)驗(yàn)，但離商業(yè)化生產(chǎn)還有距離。

第11頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.2基因工程生化產(chǎn)品的制備程序現(xiàn)代生物技術(shù)生化產(chǎn)品：將生物體內(nèi)生物活性物質(zhì)的基因分離出來，然后用重組DNA技術(shù)加以改造，使其在細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中大量表達(dá)，通過這種方式生產(chǎn)的新型生化產(chǎn)品基因工程技術(shù)：將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌或細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)→使得很多從自然界很難或不能獲得的蛋白質(zhì)得以大規(guī)模合成第12頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基因工程研發(fā)的程序1）制備基因工程菌株（或細(xì)胞）及實(shí)驗(yàn)室小試階段→主要涉及到DNA重組技術(shù)（基因工程上游技術(shù)）2）中試與質(zhì)量檢定階段→主要涉及基因工程產(chǎn)物的分離、純化（基因工程下游技術(shù)）3）臨床前研究階段4）臨床試驗(yàn)階段5）試生產(chǎn)階段第13頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月二、基因工程的基本過程通過對(duì)核酸分子的剪接、重組和插入而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)重新組合，再借助質(zhì)粒、病毒、細(xì)菌或其它載體，將重組基因轉(zhuǎn)移到新宿主細(xì)胞，使其在新宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)復(fù)制和表達(dá)1）目的基因的制備2）載體的制備3）目的基因與載體的連接4）將含目的基因的表達(dá)載體引入受體細(xì)胞并在其中復(fù)制表達(dá)5）篩選帶有重組目的基因的轉(zhuǎn)化子6）鑒定目的基因的表達(dá)產(chǎn)物第14頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程生化藥物的生產(chǎn)上游階段：分離目的基因、構(gòu)建工程菌（細(xì)胞）；主要在實(shí)驗(yàn)室完成；目的基因獲取后，要選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)→原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)。主要考慮的是要保證蛋白質(zhì)的功能，其次考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易下游階段：從工程菌（細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。包括:工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立、新型生物反應(yīng)器的研制、高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)、分離純化的優(yōu)化控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)、生物傳感器的設(shè)計(jì)和制造。與傳統(tǒng)發(fā)酵不同，需對(duì)影響目的基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析第15頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月三、獲得目的基因合成一段與目的DNA雙鏈的兩個(gè)3‘末端部分序列互補(bǔ)的、20余個(gè)堿基的寡核苷酸作為引物（primer）目的DNA變性后（單鏈模板），加入四種單核苷酸（dNTP）、引物和耐熱聚合酶。T↓，引物將與待擴(kuò)增的DNA鏈復(fù)性結(jié)合，在聚合酶的作用下，不斷延伸合成新互補(bǔ)鏈（1條DNA雙鏈→兩條）。變性（90-95℃）→復(fù)性（50-55℃）→引物延伸（60-72℃）的順序循環(huán)20至40個(gè)周期，就可以得到大量的DNA片段（可使DNA擴(kuò)增100余萬倍）。PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)，靈敏度高，極微量的DNA即可作為擴(kuò)增的模板得到大量的擴(kuò)增片段。1、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得基因第16頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月來源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基因工程生化產(chǎn)品的目的基因，不能直接分離、克隆，Why？PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)引物時(shí)，可根據(jù)需要，在5‘延伸，添加限制酶識(shí)別序列及轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，或者利用堿基錯(cuò)配，對(duì)5’端密碼子進(jìn)行定點(diǎn)誘變，以改造翻譯起始區(qū)序列，提高基因表達(dá)效率第17頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2、從DNA文庫篩選基因1）制備基因文庫a.基因組文庫：由一種生物的基因組得到的DNA片段的集合，其中每個(gè)片段都連接到一個(gè)克隆載體上，該種生物的全部遺傳信息由文庫中的全部DNA片段代表。制備或選擇克隆載體→限制性酶局部消化基因組DNA→用蔗糖密度梯度離心法除去不適合克隆到選定載體中的片段→將基因組DNA片段和切開的載體DNA混合、連接→用連接物轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（載體為質(zhì)粒）或體外包裝成噬菌體顆粒（載體為噬菌體）→得到含有不同重組DNA分子的基因組文庫第18頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月b.cDNA文庫：只含有在一定生物或一定細(xì)胞和組織中表達(dá)的基因表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取總RNA，寡聚脫氧胸苷（dT）纖維素柱從總RNA中提取mRNA，以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA，再用DNA聚合酶合成cDNA的雙鏈，將產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段插入到適當(dāng)?shù)妮d體中克隆RNA轉(zhuǎn)錄加工過程中，內(nèi)含子序列已被剪切掉，cDNA文庫適于在原核中表達(dá)，但cDNA只包含蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因部分，缺少有關(guān)的調(diào)控序列（需根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)配以相應(yīng)的調(diào)控序列）真核生物基因中通常含有非編碼區(qū)及內(nèi)含子，在原核細(xì)胞宿主中不能正常表達(dá)，基因庫中的基因一般不能用于原核表達(dá)系統(tǒng)的基因工程第19頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2）DNA文庫中篩選目的基因每個(gè)基因都有唯一的核苷酸序列，利用與該基因互補(bǔ)的標(biāo)記DNA片段（探針）檢出目的基因探針可用放射性同位素標(biāo)記，也可用非放射性物質(zhì)如生物素、地高辛、熒光素等標(biāo)記作為探針的DNA片段，可為另一物種克隆的同源基因，也可為根據(jù)目的基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列和遺傳密碼知識(shí)設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸序列第20頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月利用標(biāo)記DNA探針從DNA文庫中篩選目的基因的方法：1）硝酸纖維素膜或特制尼龍膜印在含有許多單菌落的瓊脂平板上（每個(gè)菌落都含有不同的重組DNA），每個(gè)菌落都有一些細(xì)胞黏在膜上，形成平板影印膜2）堿處理濾膜，變性后DNA仍留在原來菌落的位置3）標(biāo)記探針加到濾膜上，只與含有互補(bǔ)DNA序列的目的基因退火，使相應(yīng)菌落所在位置帶上標(biāo)記4）通過放射性自顯影顯現(xiàn)標(biāo)記的菌落（目的基因的克?。┰S多生長(zhǎng)因子的早期基因工程都是利用cDNA基因第21頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月3、人工合成基因已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列或其基因的核苷酸序列，可利用DNA合成儀合成編碼該蛋白的基因現(xiàn)有DNA合成儀能力限制，先需分段合成目的基因的核苷酸序列，再將這些片段連接成完整基因可根據(jù)需要修改密碼子：采用宿主細(xì)胞偏愛的密碼子；在結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置添加轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列；在目的基因的兩側(cè)添加限制酶識(shí)別序列，以利于和載體的連接許多細(xì)胞生長(zhǎng)因子：胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、干擾素、EPO等都采用了人工合成基因第22頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月4、載體的制備與連接表達(dá)載體除了具有一般克隆載體的特性外，還需有強(qiáng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子及翻譯調(diào)控序列如SD序列等表達(dá)載體的構(gòu)建或選擇由所用宿主類型和表達(dá)戰(zhàn)略兩因素決定不同的宿主有不同的表達(dá)載體；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可采用直接表達(dá)、融合表達(dá)和分泌型表達(dá)三種不同戰(zhàn)略非融合表達(dá)載體：pBV220；pET系統(tǒng)；分泌型表達(dá)載體等第23頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月（共有24種核酸內(nèi)切限制酶對(duì)pBR322DNA分子只具有單一識(shí)別位點(diǎn)。其中有9種限制酶其識(shí)別位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因區(qū)，還有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因（ampr）內(nèi)具有單一的識(shí)別位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活→因DNA插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱為插入失活效應(yīng)。）具有較小的分子量(4361bp)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)（每個(gè)細(xì)胞中可累積1000～3000個(gè)拷貝）具較高的拷貝數(shù)第24頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月5、目的基因與載體連接根據(jù)目的基因和載體制備過程中產(chǎn)生的末端性質(zhì)不同，可采用黏性末端連接、平頭末端連接和人工接頭連接三種不同的連接策略6、轉(zhuǎn)化：細(xì)胞在一定生理狀態(tài)即感受態(tài)（competence）時(shí)，可攝取外源遺傳物質(zhì)，攝入的遺傳物質(zhì)可獨(dú)立復(fù)制或在體內(nèi)重組成為宿主細(xì)胞染色體的一部分，并帶給宿主細(xì)胞某些新的遺傳形狀→不同宿主需用不同的方法處理方法氯化鈣轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體-PEG轉(zhuǎn)化法電穿孔法適用范圍E.coli、葡萄球菌、其它G－枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、酵母菌微生物、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞DNA連接酶主要來自T4噬菌體和大腸桿菌DNA連接酶T4DNA連接酶催化粘性末端間的連接效率要比催化平末端連接效率高。大腸桿菌DNA連接酶不能催化DNA分子平端連接第25頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月EcoRI的識(shí)別序列5‘-G_AATTC-3’3’-CTTAA_G-5’SmaI的識(shí)別序列5‘-CCC_TTT-3’3’-TTT_CCC-5’EcoRI的同尾酶MunI的識(shí)別序列是5'-C_AATTG–3‘3'-GTTAA_C–5'第26頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月7、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定1）抗藥性篩選（質(zhì)粒載體幾乎都帶有某種抗藥性基因作為篩選標(biāo)記）→問題：只要在抗生素平板上或培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的菌體一定為含有目的基因的重組菌嗎？2）單菌落快速電泳：抗藥性轉(zhuǎn)化子單菌落隨機(jī)挑出→快速提取質(zhì)粒→電泳檢測(cè)→電泳結(jié)果判斷（比載體分子量大or?。?？3）限制酶圖譜分析（對(duì)初步篩選的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞或質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析)4）Southern印跡雜交或菌落原位雜交：重組質(zhì)粒抽提→經(jīng)或不經(jīng)過酶切，瓊脂糖電泳→轉(zhuǎn)纖維素膜，標(biāo)記mRNA或cDNA為探針，Southern印跡雜交；也可不經(jīng)電泳，進(jìn)行菌落原位雜交5）基因及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定：測(cè)定核苷酸序列、通過免疫分析鑒定基因表達(dá)產(chǎn)物的存在，直接測(cè)定產(chǎn)物的氨基酸序列、功能活性第27頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物（提取時(shí)需破胞→較多雜質(zhì)釋放出來）分泌能力不足，真核蛋白常形成不溶性包含體→表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性和復(fù)性不存在翻譯后修飾→不能糖基化翻譯起始：甲硫氨酸的AUG密碼子開始→N端多余Met殘基→引起免疫反應(yīng)易產(chǎn)生難除去的內(nèi)毒素、蛋白酶破壞等第29頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌產(chǎn)物的形式：胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包含體）、胞內(nèi)可溶表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等影響真核基因在E.coli中表達(dá)效率的主要因素：?jiǎn)?dòng)子強(qiáng)度翻譯起始區(qū)序列mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)密碼子選擇、轉(zhuǎn)錄終止質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒穩(wěn)定性和宿主細(xì)胞生理學(xué)第30頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.3.1選擇和構(gòu)建強(qiáng)的啟動(dòng)子啟動(dòng)子：與RNApolymerase結(jié)合并啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄的40－50bp的DNA序列原核細(xì)胞啟動(dòng)子有-10區(qū)和-35區(qū)兩個(gè)保守區(qū)域必須選用原核生物的強(qiáng)啟動(dòng)子，且該強(qiáng)啟動(dòng)子必須受到控制或可誘導(dǎo)的（目的？）E.coli常用的強(qiáng)啟動(dòng)子有：Lac、Trp、Tac、λPL和T7啟動(dòng)子第31頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月E.coli常用強(qiáng)啟動(dòng)子Lac、LacUV5（突變的Lac啟動(dòng)子）→異丙基硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)Trp：色氨酸饑餓或色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑β-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)Tac：IPTG誘導(dǎo)λPL：

λ噬菌體cI阻遏物基因的溫度敏感型突變基因cIts857調(diào)控轉(zhuǎn)錄，42oC誘導(dǎo)T7：IPTG誘導(dǎo)第32頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.3.2優(yōu)化翻譯起始區(qū)SD序列或核糖體結(jié)合位點(diǎn)rbs：位于其實(shí)密碼子AUG上游3－11bp，由3－9bp組成，富含A、T核苷酸，若4個(gè)A或4個(gè)T能產(chǎn)生最高的翻譯效率AUG前面的三聯(lián)體也能影響翻譯效率：在β半乳糖苷酶mRNA中，該三聯(lián)體最好為UAU和CUU，AUG后面的密碼子組成也影響翻譯效率§10.3.3優(yōu)化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)mRNA的起始密碼子和SD序列不應(yīng)該形成雙鏈結(jié)構(gòu)→便于接近30S核糖體、mRNA5’末端和SD序列間距離會(huì)影響翻譯、SD序列和起始密碼子之間的距離變化也影響翻譯第33頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.3.4使用宿主偏愛的密碼子多數(shù)氨基酸有一個(gè)以上的密碼子大腸桿菌、酵母和果蠅中編碼豐度高的蛋白質(zhì)的基因明顯避免低利用率的密碼子（稀有密碼子）密碼子利用或偏愛對(duì)翻譯過程的延伸有深刻的影響。例如，如果mRNA有很多成簇的稀有密碼子，這可能對(duì)核糖體的運(yùn)動(dòng)速度造成負(fù)面影響，大大減低了蛋白表達(dá)水平。密碼子最佳化：利用偏愛密碼子(preferredcodons)并避免利用率低的或稀有的密碼子合成基因。第34頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.3.5提高質(zhì)粒拷貝數(shù)利用高拷貝質(zhì)?？寺∧康幕颍憾鄶?shù)是colEI質(zhì)粒的衍生物colEI復(fù)制受兩種負(fù)調(diào)節(jié)因子控制：RNAI（一種180個(gè)核苷酸的非翻譯RNA）、蛋白質(zhì)阻遏物RopRop基因缺失（如pAT153質(zhì)粒）或RNAI突變→均可使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加已構(gòu)建一些質(zhì)粒，其拷貝數(shù)受可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制，有兩個(gè)復(fù)制原點(diǎn)：其一在30度有活性，與par基因序列結(jié)合后，維持質(zhì)粒的的拷貝數(shù)；另一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)使λPL啟動(dòng)子取代了RNAII基因啟動(dòng)子（cI857菌株中，阻遏物受溫度誘導(dǎo)失活時(shí)才有功能→維持高拷貝數(shù)）第35頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.3.6利用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子一些強(qiáng)的啟動(dòng)子可能引起轉(zhuǎn)錄通讀、使轉(zhuǎn)錄超過真核基因終止信號(hào)，產(chǎn)生超長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物副作用：增加細(xì)胞能量消耗或使轉(zhuǎn)錄物形成非需要的二級(jí)結(jié)構(gòu)→降低翻譯效率，還可能干擾其它必須基因或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄（Rop基因連讀）酵母和哺乳動(dòng)物偏愛的終止密碼子分別是UAA和UGA，單子葉植物最常利用UGA，而昆蟲和大腸桿菌傾向于用UAA第36頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.3.7增強(qiáng)質(zhì)粒穩(wěn)定性外源基因的高效表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低或形態(tài)學(xué)變化，如成為纖絲狀或減少質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒不穩(wěn)定性：若產(chǎn)生丟失質(zhì)粒或發(fā)生結(jié)構(gòu)重排的突變體（不再表達(dá)重組基因或減少質(zhì)?？截悢?shù)），則可能具有更快的生長(zhǎng)速度，并迅速在培養(yǎng)物中占優(yōu)勢(shì)原因：分配不穩(wěn)定性（分配缺陷引起質(zhì)粒丟失，避免方法：質(zhì)粒中盡量保留一個(gè)負(fù)責(zé)分配功能的par區(qū)/反選擇無質(zhì)粒細(xì)胞/消除質(zhì)粒多聚化）；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性（由DNA缺失、插入或重排產(chǎn)生的質(zhì)粒不穩(wěn)定性，利用阻遏物控制外源基因的表達(dá)）第37頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.3.8宿主細(xì)胞生理學(xué)營(yíng)養(yǎng)成分及其提供方式，環(huán)境參數(shù)如溫度、pH和溶解氧等目前，無生長(zhǎng)條件對(duì)外源蛋白在大腸桿菌中合成的影響相關(guān)的系統(tǒng)研究，可供參考資料不多宿主細(xì)胞生理學(xué)對(duì)外源基因表達(dá)的重要性：高效表達(dá)的外源蛋白在E.coli中往往形成包含體，但降低培養(yǎng)溫度或采用降低細(xì)胞生長(zhǎng)速率地培養(yǎng)基組成和pH均能增加正確折疊的蛋白的含量第38頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.4非大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)非大腸桿菌宿主系統(tǒng)：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、昆蟲細(xì)胞及其幼體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等§10.4.1枯草芽孢桿菌系統(tǒng)（B.subtilis）優(yōu)點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)，表達(dá)的蛋白質(zhì)一般穿過質(zhì)膜，進(jìn)入培養(yǎng)基中，不形成包含體→產(chǎn)物后處理簡(jiǎn)單（成本↓），無致病性，不產(chǎn)生內(nèi)毒素缺點(diǎn)：不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解第39頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月枯草芽孢桿菌系統(tǒng)特點(diǎn)革蘭氏陽性專性需氧菌，近30％的基因起始密碼子為UGC（Cys）或CUG（Ile）E.coli質(zhì)粒在B.subtilis中不能有效復(fù)制，而B.subtilis本身的天然質(zhì)粒都為隱蔽型質(zhì)粒，沒有可檢測(cè)的表型→不能用于基因克隆S.aureus中分離的質(zhì)粒有些具有抗生素特性，如PC194、pE194、pUB110及pTL27等能轉(zhuǎn)化B.subtilis并在其中正常復(fù)制和表達(dá)抗生素特性第40頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月枯草芽孢桿菌系統(tǒng)特點(diǎn)直接在B.subtilis中克隆由于治理的結(jié)構(gòu)和分配不穩(wěn)定而遇到困難→構(gòu)建穿梭載體（在兩種生物細(xì)胞如E.coli和B.subtilis中保持和復(fù)制的質(zhì)粒載體）常用穿梭載體：pHV系列、pHP系列、pEB10和pLB5等B.subtilis的表達(dá)載體中，一些是以E.coli的lac系統(tǒng)、λ噬菌體或B.subtilis

的φ105→溫度敏感性阻遏物為基礎(chǔ)構(gòu)建的；有些是以的蔗糖誘導(dǎo)性基因sacB的調(diào)節(jié)區(qū)為基礎(chǔ)構(gòu)建的第41頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.4.2酵母表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)：最簡(jiǎn)單的真核生物，E.coli的許多遺傳操作方法均適用于酵母；安全無毒，易培養(yǎng)，遺傳背景清楚，適于大規(guī)模生產(chǎn)，能進(jìn)行翻譯后修飾加工如糖基化→一些經(jīng)過糖基化修飾才有生物活性的蛋白酵母常用載體：酵母附加體質(zhì)粒YEp、復(fù)制型質(zhì)粒YRP、著絲粒型質(zhì)粒YCP、整合型質(zhì)粒YIP、人造酵母染色體YAC等外源基因的拷貝數(shù)、啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、終止序列、宿主菌株等都會(huì)影響外源基因的表達(dá)第42頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.4.3昆蟲細(xì)胞及幼體表達(dá)系統(tǒng)主要載體為感染昆蟲的桿狀病毒，有：苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）NPV病毒在正常感染期間，產(chǎn)生和包含體為一種多角體蛋白，不是病毒復(fù)制所必須，可用外源基因取代多角體蛋白基因。多角體蛋白基因的啟動(dòng)子為極強(qiáng)啟動(dòng)子，在病毒感染細(xì)胞后期，多角體蛋白可達(dá)細(xì)胞總蛋白的50％AcMNPV感染秋黏蟲；BmNPV感染家蠶第43頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月§10.4.4哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物可分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液成分可人為控制，易于分離純化，產(chǎn)物是糖基化的，具有與自然分子一樣的功能缺點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度小，且表達(dá)所用傳代細(xì)胞一般認(rèn)為均是惡性化細(xì)胞，致癌？哺乳動(dòng)物細(xì)胞無類似質(zhì)粒的載體可以利用，外源基因必須整合到宿主細(xì)胞染色體中才能在其中復(fù)制表達(dá)第44頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)操作方法1、外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的方法：電穿孔法、病毒載體導(dǎo)入法（SV40、重組痘苗病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒）、纖維注射法、脂質(zhì)體包裹法、磷酸鈣-DNA共沉淀法等2、選擇性標(biāo)記基因：?jiǎn)渭儼捳畈《荆℉SV）腺苷激酶基因（HSV

tk）和二氫葉酸還原酶（DHFR）氡甲蝶呤（DHFRMtx）系統(tǒng)3、外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高