羅紅霉素膠囊微生物限度檢查方法驗(yàn)證

STP-QC-HY-007-00檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案羅紅霉素膠囊微生物檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證方案浙江花園藥業(yè)概述羅紅霉素（Roxithromycin），英文別名：Claramid、Rulid，是新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要作用于革蘭氏陽性菌、厭氧菌、衣原體和支原體等。其體外抗菌作用與紅霉素相類似，體內(nèi)抗菌作用比紅霉素強(qiáng)1—4倍。羅紅霉素膠囊為該藥物的固體產(chǎn)品。驗(yàn)證目的2010年版藥典中未明確指出羅紅霉素膠囊的微生物檢驗(yàn)方法，所以現(xiàn)在為了得到一個(gè)可行的、可控的、科學(xué)的微生物檢驗(yàn)方法，特進(jìn)行一系列的對稀釋劑、抑菌劑等方面的方法學(xué)驗(yàn)證活動。驗(yàn)證依據(jù)3.1《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪJ3.2《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》2010年版四、實(shí)驗(yàn)用品4.1供試品次數(shù)品名規(guī)格批號來源1浙江花園藥業(yè)234.2培養(yǎng)基名稱批號廠家營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司玫瑰紅鈉培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配制方法均按照廠家說明書要求進(jìn)行配制，符合《中國藥典》2010年版的要求。4.3緩沖液名稱批號廠家杭州微生物試劑4.4驗(yàn)證菌種：名稱菌種編號菌齡來源大腸埃希菌CMCCB（B）44102—金華食品藥品檢驗(yàn)所金黃色葡萄球菌CMCCB（B）26003—枯草芽孢桿菌CMCCB（B）63501—白色念珠菌CMCCB（F）98001—黑曲霉CMCCB（F）98003—4.5菌液制備4.5.1大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌：取少量的三種菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，在30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml中含50～100cfu的菌懸液。4.5.2白色念珠菌：取少量的白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至5ml改良馬丁培養(yǎng)基上，在23～28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml中含54.5.3黑曲霉：取少量的黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至5ml改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在23～28℃培養(yǎng)5~7天，加入3~5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫后移置無菌管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml中含50～100cfu的孢子懸液。4.6菌落計(jì)數(shù)取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50~100cfu，分別注入無菌平皿中，立即注入15~20ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固后，置30~35℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50~100cfu，分別注入無菌平皿中，立即注入15~20ml玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，混勻，待凝固后，置23~28℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。結(jié)果大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉12平均操作人/日期：復(fù)核人/日期：五、檢查法驗(yàn)證5.1細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查5.1.1預(yù)實(shí)驗(yàn)5.1.1.1供試品配制：將供試品用稀釋配制成1:10的供試品溶液。5.1.1.2菌液：白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌5.1.1.3平皿法：取供試品溶液1ml注入三個(gè)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿中，第一個(gè)平皿中加入1ml金黃色葡萄球菌，第二個(gè)平皿中加入1ml枯草芽孢桿菌，第三個(gè)平皿中加入1ml白色念珠菌，另做一空白對照，培養(yǎng)72h后，計(jì)算每種菌種的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：菌種計(jì)數(shù)結(jié)果空白對照回收率金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌操作人/日期：復(fù)核人/日期：5..4培養(yǎng)基稀釋法：取供試品1ml分別按0.5ml/皿和0.2ml/皿的添加量分別加入2個(gè)和5個(gè)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿中，然后分別將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌各1ml按照供試品溶液的加入法，分別加入到各個(gè)平皿中，另做一空白對照，培養(yǎng)72h后，計(jì)算每種菌種的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：菌種計(jì)數(shù)結(jié)果回收率1ml1ml金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌空白對照——操作人/日期：復(fù)核人/日期：5..5薄膜過濾法：取供試品1ml通過薄膜過濾，分別用200、400、600、800ml沖洗，分別在每張膜上加1ml金黃色葡萄球菌、1ml枯草芽孢桿菌、1ml大腸埃希菌，放置在營養(yǎng)培養(yǎng)基上，另做一空白對照，培養(yǎng)72h后，計(jì)算每種菌種的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：菌種計(jì)數(shù)結(jié)果回收率200ml400ml600ml800ml200ml400ml600ml800ml金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌大腸埃希菌空白對照——操作人/日期：復(fù)核人/日期：實(shí)驗(yàn)總結(jié)：操作人/日期：復(fù)核人/日期：5.1.2實(shí)驗(yàn)方法計(jì)數(shù)方法：根據(jù)上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出選用來進(jìn)行供試品的細(xì)菌檢查，霉菌和酵母菌檢查可用。5.1.2.。5.1.2.3供試品處理方法：取供試品，稱取10g，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，搖勻制成1:10的供試液。5.1.2.4操作步驟5.1.2.4.1細(xì)菌檢查：5.1.2.4.2霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)：5.1.2.5實(shí)驗(yàn)次數(shù)：每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。5.1.3試驗(yàn)內(nèi)容5.1.3.1供試品組：取1:10的供試液按照5.1.2.4.1及5.1.2.4.2描述的方法進(jìn)行試驗(yàn)，按每1ml供試液加入50~100cfu試驗(yàn)菌，結(jié)果記錄在下表：次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉123平均操作人/日期：復(fù)核人/日期：5.1.3.2活菌組：參見的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。5.1.3.3供試品對照組：參照5.1.3，結(jié)果記錄在下表：菌落數(shù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)第一次第二次第三次細(xì)菌霉菌和酵母菌操作人/日期：復(fù)核人/日期：5.1.3.4稀釋劑對照組：用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖代替供試品，照供試品組檢查法同法處理，結(jié)果記錄在下表中：次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉123平均操作人/日期：復(fù)核人/日期：5.1.4驗(yàn)證結(jié)果5.1.4.1供試品組的回收率次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉123平均計(jì)算公式：供試品組的回收率%=供試品組平均菌落數(shù)-空白組平均菌落數(shù)×100%活菌組的平均菌落數(shù)操作人/日期：復(fù)核人/日期：5.1.4.2對照組的回收率次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉123平均計(jì)算公式：供試品對照組的回收率%=對照組平均菌落數(shù)×100%活菌組的平均菌落數(shù)操作人/日期：復(fù)核人/日期：5.2控制菌檢查因本品為口服固體制劑，所以按照《中國藥典》中的規(guī)定，必須要檢測大腸埃希菌，選用金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。5.2.1驗(yàn)證試驗(yàn)：按照5.1.2.3的方法配制供試品溶液。5.2.1.1常規(guī)法5.2.1.1.1試驗(yàn)組：取供試品溶液10ml和1ml含50~100cfu的大腸埃希菌的菌液，加入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.1.2陽性對照組：取50~100cfu的大腸埃希菌菌液加入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.1.3陰性對照組：取pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液10ml加入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)第一次第二次第三次試驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組操作人/日期：復(fù)核人/日期：5.2.1.2培養(yǎng)基稀釋法5.2.1.1.1試驗(yàn)組：取供試品溶液10ml和1ml含50~100cfu的大腸埃希菌的菌液，加入到200ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.1.2陽性對照組：取50~100cfu的大腸埃希菌菌液加入到200ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.1.3陰性對照組：取pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液10ml加入到200ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)第一次第二次第三次試驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組操作人/日期：復(fù)核人/日期：5.2.1.3離心集菌薄膜過濾法：取項(xiàng)下配置好的溶液在500r/min離心3分鐘，取上清液10ml加到200ml稀釋液中，混勻，作為控制菌檢查供試液，沖洗液的量可參考。試驗(yàn)組：取供試品溶液10ml通過薄膜過濾，在最后一次沖洗液中加入1ml含50~100cfu的大腸埃希菌的菌液，將濾膜放入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.3.2陽性對照組：取1ml含50~100cfu的大腸埃希菌菌液通過薄膜過濾并用沖洗液沖洗，將濾膜放入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.3.3陰性對照組：取pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液10ml通過薄膜過濾，將濾膜放入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。5.2.1.3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)第一次第二次第三次試驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組操作人/日期：復(fù)核人/日期：七、驗(yàn)證總結(jié)7.1細(xì)菌、霉菌和酵母菌在細(xì)菌