氯仿薰蒸浸提法測定土壤微生物生物量磷

氯仿薰蒸浸提法測定土壤微生物生物量磷一、 采樣與樣品預(yù)處理（同微生物生物量碳）土壤樣品的采集方法和要求與測定其它土壤性質(zhì)時沒有本質(zhì)區(qū)別。采集到的新鮮土壤樣品立即去除植物殘體、根系和可見的土壤動物（如蚯蚓）等,然后迅速過篩（2?3mm）,或放在低溫下（2?4°C）保存。如果土壤太濕無法過篩，進(jìn)行晾干時，必須經(jīng)常翻動土壤，避免局部風(fēng)干導(dǎo)致微生物死亡。過篩的土壤樣品調(diào)節(jié)到田間持水量的50%左右，在室溫下于密閉裝置中預(yù)培養(yǎng)1周，密閉容器中要放入兩個50mL的燒杯，分別加入水和稀NaOH，以保持其濕度和吸收釋放的CO2。預(yù)培養(yǎng)后的土壤最好立即分析，若需要放置一段時間，在低溫下（2?4C）最好不要超過10d。二、 方法一氯仿薰蒸浸提法（FE）1、 方法原理土壤經(jīng)氯仿薰蒸處理，微生物被殺死，細(xì)胞破裂后，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到土壤中，導(dǎo)致土壤中的可提取的磷大幅度增加。通過測定浸提液中磷的增加量，估算土壤微生物量磷。浸提液中磷用鉬銻抗比色法測定。2、 儀器及設(shè)備培養(yǎng)箱；真空干燥器；真空泵；往復(fù)式振蕩機(jī)（速率200rev/min）；冰柜；分光光度計(jì)3、 試劑無乙醇氯仿：量取500mL氯仿于1000mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[9（H2SO4）=5%]，充分搖勻，棄除上層硫酸溶液，如此進(jìn)行3次。再加入50mL去離子水，同上搖勻，棄去上部的水分，如此進(jìn)行5次。得到純氯仿存放在棕色瓶中，并加入約20g無水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存?zhèn)溆?。（試劑濃硫?（H2SO4）=95~98%，稀釋19倍）2.0.5mol/LNaHCO3：42.0gNaHCO3（化學(xué)純）溶于800mL水中，用0.5mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至8.5,用去離子水稀釋至1L。溶液貯存于塑料瓶中。長時間放置，使用前必須檢驗(yàn)pH值。鉬銻抗試劑：稱取酒石酸銻鉀0.5g，溶解于100mL水中，制成0.5%的溶液。另稱取鉬酸銨10g，溶于450mL水中，徐徐加入153mL濃^Sq，邊加邊攪。再將°.5%的酒石酸銻鉀溶液加入到鉬酸銨溶液中，最后加水至1L，充分搖勻，貯存于棕色瓶中。臨用前（當(dāng)天），稱取左旋抗壞血酸1.5克（Vc，三級），溶解于100mL鉬銻貯備液中，此溶液有效期為24h。磷標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取在105C烘箱中烘干的KH2PO4（分析純）0.4394g，溶解在400mL水中，加濃H2SO45mL（防止發(fā)霉），轉(zhuǎn)入皿容量瓶中，定容，搖勻。此溶液為100mg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4°C冰箱中可長期貯存。吸取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液5mL，稀釋至100mL，即為5mg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液（不宜久存）。250ug/mLKH2PO4：0.5492gKH2PO4-定容至500ml水；0.10984g定容至100ml。硫酸溶液（2.5molL-1）：量取70.0ml分析純濃硫酸，稀釋至500ml。1molL-1NaOH:稱取40g分析純氫氧化鈉，溶于1L蒸餾水中。2,6二硝基酚指示劑：稱取0.2g指示劑溶于100ml水中。4、操作步驟4.1薰蒸稱取相當(dāng)于5.0g烘干土重的濕潤土壤3份，分別放在約100mL的燒杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小燒杯盛裝少量的水以保持濕度，同時放入一個裝有50mLNaOH溶液和一個裝有約50mL的無乙醇氯仿的小燒杯（根據(jù)干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同時加入少量的直徑約為0.5mm的碎瓷片），用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽氣至氯仿沸騰并保持至少2min。關(guān)閉干燥器的閥門，在25oC的黑暗條件下放置24h。打開閥門，如果沒有空氣流動的聲音，表示干燥器漏氣，應(yīng)重新稱樣進(jìn)行薰蒸處理。當(dāng)干燥器不漏氣時，取出裝有水、堿液和氯仿的燒杯，氯仿倒回瓶中可重復(fù)使用。擦盡干燥器底部，用真空泵反復(fù)抽氣，每一次都要打開干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤聞不到氯仿氣味為止。薰蒸開始的同時，稱取等量土壤3份，用NaHCO3溶液（見下一步驟，試劑2）浸提，同時做不加土壤為空白對照。浸提液在室溫下可以放置1周，4C下放置1個月或在-15oC下保存。4.2浸提薰蒸結(jié)束后，將土壤全部轉(zhuǎn)移到250mL的震蕩瓶中，加入80mL0.5mol/LNaHCO3溶液，在振蕩機(jī)上振蕩浸提30min（25C，185rev/min），用無磷濾紙過濾。薰蒸開始的同時，稱取等量土壤3份，同上用0.5mol/LNaHCO380mL溶液浸提，同時做不加土壤為空白對照。浸提液立即測定或在-15oC下保存。P回收率測定另取等量土壤3份，加入0.5mL250ug/mLKHPO（50ugP/g土），同上加入80mL0.5mol/L2 4NaHCO3溶液浸提，浸提液在室溫下可以放置1周，4C下放置1個月或在-15￡下保存。4.3測定吸取土壤浸提液25mL（根據(jù)土壤含磷量進(jìn)行調(diào)整）于50mL容量瓶中.調(diào)解pH：加2,6-二硝基苯酚1-2滴，用3mol/L的硫酸把溶液調(diào)至無色。回滴用1mol/L的NaoH溶液。緩緩加入鉬銻抗溶液5mL(試劑3),邊加邊輕輕搖動(防止溶液溢出)，全部排除溶液中的CO2。加去離子水定容。靜置0.5h后(如果溫度太低，顯色比較緩慢，可以在水浴中加熱)，用分光光度計(jì)在880nm波長下比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別準(zhǔn)確吸取5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(試劑4)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于50mL容量瓶中，再加入NaHCO3溶液(試劑2)10mL。調(diào)pH(同4.3上)。加入鉬銻抗溶液5mL，靜置0.5h比色。4.4測定土壤含水量：稱5.00g上述濕潤土壤，放在鋁盒中，在105°C烘箱中烘8h，然后稱其干重。(三個平行)。5、結(jié)果計(jì)算熏蒸和未熏蒸浸提的磷量(mg/kg)P(mg/kg)=顯色液P(mg/kg)X顯色液體積Xts/DW式中：顯色液P(mg/kg) 標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得顯色液的P(mg/kg)數(shù)；顯色液體積 50mL；ts——分取倍數(shù)(浸提液總體積/吸取浸提液體積)DW一土壤的烘干質(zhì)量，g。生物量磷(Bp)的計(jì)算Bp=(F-UF)/(KpXR)式中：F一熏蒸浸提的磷量(mg/kg)；UF 未熏蒸浸提的磷量(mg/kg)；Kp一提液微生物生物量磷占總微生物生物量磷的比例，為0.4；R(%)—