流式細胞儀簡介和使用方法

關于流式細胞儀簡介和使用方法第1頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第一部分流式細胞儀標本準備染色的一般原則及方法第2頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月標本來源：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細胞、脫落細胞及其他。根據(jù)各種具體實驗，選用不同的抗凝劑。可用的抗凝劑如下：EDTA：2mg/ml枸椽酸鈉：0.38%肝素：15IU/ml第3頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月標本處理時間：新鮮樣本分析時，樣本采集后應立即分析樣本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分鐘。注：不同的實驗，所用的固定方法不完全相同。第4頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月樣本處理標準試劑：一、10%BovineSerumAlbuminBSA1.溶解10gBSA至100ml蒸餾水中2.4oC，20000g離心30分鐘3.分裝后-20oC保存第5頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月二、0.1%BSA-PBS緩沖液1.準備500ml，PH7.3PBS2.加入5ml10%BSA3.使用0.45um濾網(wǎng)過濾三、氯化銨溶血劑1.在一升蒸餾水中溶解8.29gNH4CL,1gKHCO3和37mgNa2EDTA2.調(diào)節(jié)PH值至7.23.在使用前配置該溶血劑，并用0.45um濾膜過濾第6頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月方法一：溶血法取100ul抗凝全血；2.快速加入2mlNH4CL溶血劑,混勻；3.室溫孵育10分鐘；4.4oC，400g離心10分鐘。去上清，加入2mlBSA-PBS；5.4oC，400g離心10分鐘。去上清，加入2mlBSA-PBS；6.4oC，400g離心10分鐘。去上清，調(diào)整細胞濃度至5x106/ml。富集白細胞第7頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月注：化學試劑直接作用于紅細胞的溶血劑有：以草酸為主的溶血劑（CoulterQ-Prep），基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血劑。優(yōu)點：溶血時間快？？？，在流式細胞儀上可清楚地將淋巴、單核、粒及紅細胞碎片相區(qū)分。缺點：需嚴格掌握溶血時間，對白細胞表面抗原有影響，隨時間細胞形態(tài)變化大。第8頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月方法二：密度離心法提取單個核細胞Histopaque1077為Ficoll與Sodiumdiatrizoate(泛影酸鈉)混合物，其密度為1.119～1.077。通過離心可將全血中的粒細胞與單個核細胞分離。粒細胞沉積于1.119～1.077的血漿層，而單個核細胞則在1.077以下的血漿層中。第9頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月1.準備2ml抗凝血（根據(jù)實驗要求確定用血量），等量PBS稀釋；2.準備1mlHistopaque1077(Sigma)；3.室溫下700g離心30分鐘；4.仔細將含有單個核細胞血漿層吸出；5.加4mlBSA-PBS，400g離心10分鐘；6.加2mlBSA-PBS清洗2次。操作第10頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月

淋巴節(jié)、扁桃體、脾、胸腺等淋巴組織由于結構松散，容易分離成單個細胞。一般對樣本進行切剪、研磨、過濾便可。從組織獲取淋巴細胞將樣本置于陪替氏培養(yǎng)皿，加入15mlBSA-PBS；將樣本切成3-4mm3大小，用鑷子將其分離；將樣本經(jīng)濾網(wǎng)過濾，用密度法分離、提純淋巴細胞。方法：第11頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月其他標本：通常在其他組織中分離淋巴細胞需用酶進行消化。對于不同標本，處理方法也各不相同。制備大鼠腎臟浸潤細胞解剖刀、CO2孵育箱、濾網(wǎng)以及含1mg/ml膠原酶的細胞培養(yǎng)液（無血清）材料：第12頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月方法：1.將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，用解培刀切成小塊；2.加入10ml膠原酶溶液，37oCCO2培養(yǎng)箱孵育30分鐘；3.濾網(wǎng)過濾；4.密度梯度法離心提純淋巴細胞。第13頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月其他類型細胞

在組織中提取細胞通常使用酶消化法。同樣對于不同組織處理方法也各異，以下是講述通用的膠原酶消化法制備組織細胞。改良后的此法尚可用于制備人、鼠上皮細胞。第14頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月材料

解剖刀0.15%胰蛋白酶Hanks’s緩沖鹽或PBS，pH7.3不含Ca、Mg離子的HBSSII型膠原酶1%BSA或5%FBS5ml的吸樣管35um尼龍濾網(wǎng)DNase第15頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月

將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，加15mlBSA-PBS，將樣本切成1mm3大小，用鑷子將其分離；

HBSS或PBS洗清加入10ml無Ca、Mg離子0.2%II型膠原酶溶液0.02%DNase1的HBSS；

37oC搖床上孵育15~60分鐘，視樣本類型而定；操作第16頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月用5ml的吸樣管反復吹打，制成單個細胞懸液；使用35um濾網(wǎng)過濾，300g離心5分鐘；用PBS或細胞培養(yǎng)液重懸樣本；對于某些樣本過濾后仍有小塊組織，重復第5步獲取細胞，重復第7步；用含0.15%胰酶、0.02%DNase1不含Ca、Mg的HBSS重懸，37oC孵育一段時間加入1%BSA或5%FBS，滅活酶活性。第17頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞培養(yǎng)

許多原代細胞和培養(yǎng)細胞系，都為貼壁型生長。通常先用胰酶處理獲得單細胞懸液，需注意消化過度會損害細胞，特別是改變其表面抗原標記。準備單細胞懸液1.儀器和試劑：

0.25%rEDTA,pH7.20.25%的胰酶10%血清的培養(yǎng)液2.方法：

a.PBS洗滌細胞；

b.加入0.25%有胰酶，37oC處理2~8分鐘；

c.倒置顯微鏡下觀察，至大部分細胞脫落懸浮后，加入含10%血清的培養(yǎng)液。

d.PBS液洗滌細胞，最后配成終濃度為1×106/ml

的細胞懸液。第18頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月樣本處理第19頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月抗體染色一般方法外周血白細胞分析：100ul全血血小板分析：1~5ul全血（根據(jù)樣本血小板數(shù)量）紅細胞分析：1ul全血（根據(jù)樣本中紅細胞數(shù)稀釋后使用）骨髓：100ul其他樣本，計數(shù)后決定使用體積目標細胞數(shù)量及檢測終濃度：1×106/ml第20頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞計數(shù)方法傳統(tǒng)手工計數(shù)：耗時、準確度差流式細胞儀計數(shù)：BD，Coulter儀器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec儀器:最為精密的細胞計數(shù)器，直接報告細胞濃度第21頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月反應體積樣本中加完抗體后，1×106細胞反應體積應不小于100ul。第22頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月抗體染色最為普通的抗體染色原則：1×106細胞對1ug抗體（抗體供應商所推薦使用單位），此濃度90%處于過飽合狀態(tài)精確使用：滴定抗體，抗體對于抗原恰達到飽合濃度第23頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月SPECIFICANTIBODYNON-SPECIFICANTIBODYCONCENTRATIONAMOUNTBOUND抗體滴定原理第24頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細胞儀抗體滴定方法33μgs/n=2.51μgs/n=2.10.3μgs/n=2.40.1μgs/n=4.10.03μgs/n=4.80.01μgs/n=4.60.003μgs/n=3.50.001μgs/n=3.2auto第25頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月65432100102030405060DilutionSignaltoNoiseTITER第26頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月孵育、溶血、固定抗體孵育：室溫下避光15分鐘（某些情況下如：細胞內(nèi)因子檢測需冰育）溶血：如樣本含中有紅細胞需溶血（見下頁）樣本溶血后需立即上機檢測，固定后可放置較長時間第27頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月白細胞保護型溶血劑Cal-Lyse(其中已含細胞固定劑)：1，100ul外周血，加入100ul溶血劑2，混勻后，室溫下孵育10分鐘3，加入2ml蒸餾水，混勻后室溫下孵育10分鐘4，根據(jù)實驗需要，免洗直接上機檢測或400g離心10分鐘后PBS重懸優(yōu)點：試劑為溫和型溶血劑，不影響細胞表面抗原及溶血時間無需精確把握第29頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月各溶血劑性能比較第30頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月抗體標記熒光素及其他熒光染料熒光激發(fā)及發(fā)射原理能量級激發(fā)激發(fā)態(tài)發(fā)射激光能量損失第33頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月標記抗體常用熒光素FITC激發(fā)光：488nm發(fā)射光：525nm;使用面最廣，價格便宜AlexaGreen具有更佳的能量轉移效率及更純的發(fā)射光譜第34頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月PE激發(fā)光488nm發(fā)射光575nm此熒光的激發(fā)效率最佳，故此熒光得到的信號最強檢測某些弱表達的抗原，推薦使用此熒光素價格較FITC昂貴第35頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月PE-Cy5TC激發(fā)光488nm,發(fā)射光667nm為復合熒光素，熒光激發(fā)較率較高，信號強FTIC、PE、PE-Cy5三者為流式細胞最為常的熒光，并經(jīng)常將三者共同使用進行三色分析第36頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月PE-Cy7激發(fā)光488nm，發(fā)射光767nm為復合熒光素，2000年后被開發(fā)出來，激發(fā)效率佳與前三者聯(lián)進可進行單激光四色分析（488nm），光譜之間影響較小第37頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月APC激發(fā)光633nm，發(fā)射光660在配有雙激光的流式細胞儀上，此熒光染料與FITC、PE、PE-Cy5聯(lián)用做四色分析。但現(xiàn)在因單激光四色可實現(xiàn)，故使用該染料意義不大。第38頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸染料第39頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞膜電位、離子、脂類探針現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)或開發(fā)出來了各種細胞膜電位、各類離子、pH值、脂類探針，運用這些探針在流式細胞儀上可輕易檢測各種細胞功能，可實現(xiàn)一些異想不到的效果。詳細信息，見細胞探針公司網(wǎng)站：

www.molecularP第40頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月與流式細胞儀相關的熒光術語MESF（Moleculesofequivalentsolublefluorochrome）等量可溶性熒光分子：國際標準單位，用來衡量熒光強度自發(fā)熒光：細胞或顆粒在激發(fā)照射下會發(fā)出各種波長的熒光。白細胞自發(fā)熒光強度為650~1150MESF，血小板及其他顆粒自發(fā)熒光更低流式細胞儀精度：分析白細胞要求精度在1000MESF以內(nèi)，分析其他細胞或顆粒需要更高的精度：300MESF以內(nèi)第41頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第二部分流式細胞儀使用一般方法及技巧第42頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月上機檢測樣本染色及溶血過程處理完后應立即上機檢測打開流式細胞儀：預熱及進行質控程序選擇相應的方案或新建方案加載或重新調(diào)節(jié)各參數(shù)上樣檢測第43頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月技巧一：定位目標細胞群體尋找細胞群：如標本為外周血，在FS/SS散點圖中信號最強的為粒細胞，依次為單核、淋巴、紅細胞碎片。要尋找淋巴細胞，可首先調(diào)低FS/SS電壓定位粒細胞后逐步調(diào)高電壓依次尋找各細胞群。使用目標群所特有的表面標志物結合SS信號，可最快、最特異性地定位目標細胞群如標本中無明顯特征細胞群，可使用已建淋巴細胞檢測方案根據(jù)相對位置定位目標細胞群第44頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月技巧二：陰性對照陰性對照作用：調(diào)節(jié)PMT電壓；設立陰、陽性界線使用抗體相應同型熒光免疫球蛋白作為陰性對照，注對照及抗體需出自同一廠家（檢測一過性樣本中的某些指標）使用對照組樣本作陰性對照（與其他實驗中對照組含意相同，但此時仍需使陰性對照初始化儀器）對與非抗體染色，如各類核酸染料或探針：PI、ANNEXIN-V。使用空白標本作為陰性對照，或設立陽性對照。第45頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月技巧三：常見故障及解決時刻注意鞘液及廢液桶液量，熟悉儀器各類報警信號通過軟件操作儀器，很少能引起儀器硬件固障如樣本中有可見顆粒，建議過濾后再檢測如儀器經(jīng)常不使用，管道會結晶、長菌、堵塞、漏氣，此時叫工程師便可解決如儀器出現(xiàn)硬件故障，通常是儀器自身問題，與操作者無關第46頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月技巧四：檢測指標檢測前要清楚地知道：除陽性百分比指標外，還有熒光強度指標。后者往往比前者更有意義檢測時，靈活應用放大模式：線性或對數(shù)（如指標相差不大，使用線性放大，如：SS、FS；一般熒光參數(shù)使用對數(shù)放大）靈活運用門的邏輯關系及顏色示蹤功能，可使檢測結果更為明了合理選擇不同的熒光素標記試劑，以最少的投入獲取最多的信息第47頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光補償：極其重要的操作第48頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月FITC與PE第49頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月調(diào)與未調(diào)補償FL1FL2第50頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月補償調(diào)節(jié)原理第51頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月補償調(diào)節(jié)原理第52頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月雙色熒光補償調(diào)節(jié)標準方法：第一步IgGFITC/IgGPE通過調(diào)節(jié)電壓使陰性群體落在FTIC及PE雙陰性區(qū)注在進行調(diào)補償時必須將原補償全部歸零第53頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月雙色熒光補償調(diào)節(jié)標準方法：第二步FITC標記抗體/IgGPE第54頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月雙色熒光補償調(diào)節(jié)標準方法：第三步通過補償設置按鈕增、減補償百分數(shù)第55頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月因為：第56頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月所以：第57頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月注意！用來調(diào)節(jié)補償?shù)腇ITC、PE抗體必須有明顯的陽性信號，否則就不會出現(xiàn)熒光滲漏現(xiàn)像，調(diào)節(jié)補償也無從入手。在正式數(shù)據(jù)采集前要調(diào)整好補償，一旦數(shù)據(jù)被獲取，BD、Coulter儀器無法再改變補償partec流式細胞儀提供軟件調(diào)節(jié)補償技術，無論何時都可重新調(diào)節(jié)多色熒光補償調(diào)節(jié)方法同雙色法第58頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月復雜方案分析了解流式儀胞儀各參數(shù)的意義熟悉設門操作開擴思路，靈活設計各種檢測方案第59頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細胞儀CD34陽性干細胞計數(shù)標準方案：ISHAGE背景知識：外周血現(xiàn)已被廣泛地被用作骨髓移植癌癥患者接受大劑量化療或放療后骨髓重建造所需血干細胞HemotopoieticProgenitorCellsHPC的來源外周血源性干細胞現(xiàn)主要被運用自體移植其應用面也逐步拓展至異基因骨髓移植中。運用流式細胞儀可最早監(jiān)測外周血中是否有足夠的干細胞供采集。由于此類樣本中，碎片、血小板、聚集物對檢測結果影響較大，故設計了ISHAGE方案去除這些影響。第60頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月CD34計數(shù)中的問題溶血劑：避免溶血時間過長，處理完成后將樣本置于冰水中，將降低溶血劑繼續(xù)作用的效果。另溶血后染色/染色后溶血效果各有不同。有些樣本可能存在某些特殊問題血小板可能會與CD34+或CD34-細胞結合影響精確計數(shù)這個問題可通過增加EDTA來解決聚集的血小板可能會與CD34CD45抗體微弱結合但可通過巧妙的設門方案將其去除樣本保存：血小板聚集問題，細胞死亡問題，凍存液如DMSO對樣本的影響抗體選擇：熒光素對抗體結合的影響陰性對照：在用CD34抗體染色的標本中目標細胞群可能少于總細胞群的0.1%而只有目標細胞群大于1%時才合適用同型作為陰性對照。需使用多參數(shù)設門來確定陰性對照收集標本數(shù)：由于CD34+細胞一般只占1%整單個核細胞固可將其視作泊松分布曲線如要得到一個變異系數(shù)為10%左右值就要采集100個陽性細胞。第61頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第一步一個門R1是基于CD45/SSC雙參數(shù)圖上的通過對其設門可去除紅細胞碎片和聚集物這些干擾在造血細胞樣本中尤為多見特別是在樣本使用溶血-免洗法處理后第62頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第二步將通過R1門獲取的細胞顯示在CD34/SSC雙參數(shù)點圖在此圖中設立R2門并調(diào)節(jié)其位置包含所有CD34強陽性或弱陽性的并SSC信號弱及中等的細胞第63頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第三步建立一CD45/SSC雙參數(shù)點圖將以上CD34陽性細胞顯示于其中在其中設門R3門去除CD34陽性顆粒中的聚集血小板淋巴細胞和單核細胞第64頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第四步將R3門中圈定的細胞顯示在FS/SS圖中以檢測細胞是否落在平時的幼稚淋巴細胞門R4中通過R4要去除比淋巴細胞小的顆粒第65頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第五步如何確定R4門的位置呢？方法如下在CD45/SSC雙參數(shù)點圖中設立R5門圈定CD45強陽性且SSC低信號的淋巴細胞群體將R5門中的細胞顯示在R4門所在的FS/SS雙參數(shù)直方圖中根據(jù)其中的淋巴細胞的位置調(diào)節(jié)R4門確定R4門在FS和SS軸上最小值的最低范圍第66頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第六步R1門在CD45從標的下限則根據(jù)以下直方圖來確認建立第5張CD45/CD34雙參數(shù)直方圖根據(jù)CD34陽性顆粒的CD45表達的最小值建立十字門確保所有CD34陽性CD45極弱表達的細胞全部在CD45設定界線的左側然后根據(jù)此進的CD45界線位置確定R1門的最小值第67頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第七步絕對計數(shù)：對于普通流式細胞儀在樣本中加入標準微球，校準流式細胞的計數(shù)，從而得出干細胞的濃度Partec流式細胞儀所有檢測指標均為絕對計數(shù)，無需校準微球，計數(shù)過程由硬件完成。第68頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月陰性對照對于陽性細胞數(shù)很少的樣本，如何建立有效的陰性對照是值得考慮的問題第69頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細胞儀數(shù)據(jù)保存及分析所有商業(yè)流式細胞儀樣本分析結果數(shù)據(jù)包均以FCSII格式保存無論操作平臺是DOS、Windows、MAC，流式數(shù)據(jù)文件均可被自由拷貝流式數(shù)據(jù)包含有各項參數(shù)信息及分析顆粒信號信息第70頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月功能強大的免費分析軟件：PC版WinMDI提供流式軟件分析所需的所有功能，運行在Windows平臺可在任何PC機上分析流式數(shù)據(jù)并輸出報告下載：第71頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第三部分

臨床流式細胞儀應用簡介以下將簡單地、舉例性地介紹流式細胞可開展的部分項目。只須掌握了流式細胞儀的原理及操作軟件，您可開展任何基于熒光技術的檢測項目流式細胞儀是一種任您自由展開想像力的、非凡的檢測工具第72頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA倍體分析：DNA分析是流式細胞儀最初且是現(xiàn)在應用最廣檢測項目。由于惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同，存在異倍體細胞，所以現(xiàn)有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預后的關系。DNA含量檢測還可提供細胞周期方面的信息，這在細胞生物學中運用很廣泛。特別地，它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標志物標記同時進行，這樣在細胞混合培養(yǎng)中，可通常追蹤表達特異標志物的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學反應并發(fā)射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。流式細胞儀要求：488nm光源，575nm濾光片。第73頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞生存能力實驗，使用Heochest33342染料與DNA特異性結合，后因細胞活力不同染料的結合程度也各異，故可評估細胞的活性度。流式細胞儀要求：360nm光源，455nm濾光片計數(shù)外周血中檢測網(wǎng)織紅細胞：使用TO染料能夠特異性地與RNA結合，結合系數(shù)高達3000，故具有很好的信噪比。流式細胞儀要求：488nm光源，525nm濾光片，液量絕對計數(shù)系統(tǒng)第74頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月血小板自身抗體檢測：血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起各種臨床相關癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片移植交叉配型：原細胞毒實驗，主要用于避免移植物超急性排拆反應。流式細胞儀用于監(jiān)測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預實驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領域內(nèi)的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片第75頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測細胞經(jīng)抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應：淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細胞使用三色分析可監(jiān)測淋巴細胞各亞群活化情況：FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm濾光片細胞增殖狀態(tài)檢測：核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況，在評估腫瘤預后有重要意義。為些標志物的檢測一般同細胞表面標志物同時檢測。FITC標記PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5標記細胞表面標志物。儀器要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片第76頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測細胞內(nèi)因子（TH1/TH2細胞檢測）：未活化的淋巴細胞所分泌的細胞因子極少用流式細胞儀很難檢測出來因此在檢測前需刺激活化活化所用的刺激素為PMA佛波酯+Ionomycin淋巴細胞在刺激素的作用下活化分泌細胞因子到細胞外因流式細胞儀只能對細胞表面或內(nèi)部的抗原進行檢測如細胞因子分泌到細胞外則檢測不到因此必須阻止細胞因子的分泌抑制細胞因子分泌的試劑為BrefedlinA或Monensin。Th1/Th2細胞首先是CD4+T細胞因此存在著用CD4來設定細胞群的問題我們知道CD4不但在T細胞上表達還在所有的單核細胞上表達因此單獨用CD4設門無法將CD4+T細胞區(qū)分開來那么我們用CD3和CD4雙參數(shù)設門是否可以呢回答是否定的因為在佛波酯的刺激作用下CD4抗原的表達會迅速下調(diào)甚至完全喪失所以不適合于設門用CD3和CD8設門因CD8不受佛波脂的影響且絕大多數(shù)D3+CD8-的細胞都是CD3+CD4+細胞因此可用CD3+CD8-細胞群來確定CD4+T細胞群。FITC標記CD8，PE標記IL-4和，PE-CY5標記IFN-r，APC或PE-CY7標記CD3。

儀器要求：488nm或633nm（僅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm濾光片第77頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體分析：流式細胞儀染色分析運用兩種特異性染料：Hoechest33258與核苷酸AT結合；ChromomycinA3與GC相結合。從而在雙參數(shù)坐標上根據(jù)染色體ATCG含量的不同識別各種染色體。平時進行的染色體分析耗時且需要操作者極具經(jīng)驗，而用流式細胞儀時可快速地識別出異常染色體，如加配分選系統(tǒng)可將這些異常染色體分選出來作進一步分析。儀器要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm濾光片BrdUrd標記追蹤細胞分化：通過細胞分化時涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗體及PI核酸染料可精確識別它們。在流式細胞儀上可清楚地識別出處于G1、S、G2、M期的細胞，在腫瘤研究中有著重要作用。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片第78頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月淋巴細胞亞群分析：外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各類淋巴細胞亞群定量分析。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片，液量絕對計數(shù)系統(tǒng)

白血病免疫分型：CD45設門三色白血病免疫分型。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。最少三色熒光，參數(shù)越多檢測越為靈敏。

血小板分析：血小板活化實驗、血小板功能分析。血小板識別抗體及相應活化指標。儀器要求：488nm光源