植物組織培養(yǎng)概述

關于植物組織培養(yǎng)概述第1頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月一、植物組織培養(yǎng)的概念1．組織培養(yǎng)的定義

植物離體培養(yǎng)（Plantinvitroculture）是指通過無菌操作，把植物體的各類結構材料，即外植體（Explant）,接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的環(huán)境條件下，進行離體培養(yǎng)的一套技術與方法，通常稱之為植物組織培養(yǎng)（Planttissueculture），或植物的細胞與組織培養(yǎng)。第2頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2.組織培養(yǎng)的原理

組織培養(yǎng)是建立在植物細胞全能性學說的理論基礎上，所謂全能性，就是說，任何具有完整的細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植株所必需的全部遺傳信息。

第3頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月當然，全能性只是一種可能性，要把這種可能性變?yōu)楝F(xiàn)實性必須滿足兩個條件：

一是要把這些細胞從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來，也就是說必須使這部分細胞處于離體的條件下；二是要給予它們適當?shù)拇碳?，即給予它們一定的營養(yǎng)物質，并使它們受到一定的激素的作用。

第4頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月一個已分化的細胞要表現(xiàn)它的全能性，必須經歷上面所說的兩個過程，即首先要經歷脫分化過程，然后再經歷再分化過程。在大多數(shù)情況下，再分化過程是在愈傷組織細胞中發(fā)生的，但在有些情況下，再分化可以直接發(fā)生在脫分化的細胞當中，其間不需要插入一個愈傷組織階段，比如煙草的薄層表皮細胞在離體培養(yǎng)中就能不經愈傷組織直接分化出芽來。第5頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月3．組織培養(yǎng)的種類

根據(jù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的不同可以將組織培養(yǎng)分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；根據(jù)外植體的不同可以將組織培養(yǎng)分為器官培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)和組織培養(yǎng)。第6頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)根據(jù)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方式，可以將植物組織培養(yǎng)區(qū)分為：

固體培養(yǎng):

也叫瓊脂培養(yǎng)。

液體培養(yǎng):

液體培養(yǎng)又可分為振蕩培養(yǎng)、旋轉培養(yǎng)、靜止培養(yǎng)等。液體培養(yǎng)基中放入濾紙，再將外值體置于濾紙上進行的培養(yǎng)稱為紙橋培養(yǎng)。第7頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）按植物不同結構材料(外植體),將離體培養(yǎng)技術體系分為：

器官培養(yǎng)及器官原基培養(yǎng)，包括根、莖、葉、花器官及其原基的培養(yǎng)（含根、莖段和花藥等）；

胚胎培養(yǎng)及以胚胎為基礎的培養(yǎng)技術，包括原胚和成熟胚培養(yǎng)，胚乳培養(yǎng)，胚珠或子房培養(yǎng)等；

組織培養(yǎng)，包括分生組織、形成層組織或其他組織結構（含愈傷組織）的培養(yǎng)。第8頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月4．組織培養(yǎng)的主要內容

愈傷組織培養(yǎng)；

器官培養(yǎng)；

細胞培養(yǎng)；

原生質體培養(yǎng)。第9頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）愈傷組織培養(yǎng)：

所謂愈傷組織，原是指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團薄壁細胞，在組織培養(yǎng)中，則指在人工培養(yǎng)基上由外植體（由活植物體上切取下來以進行培養(yǎng)的那部分組織或器官）長出來的一團無序生長的薄壁細胞。愈傷組織培養(yǎng)所以是一種最常見的培養(yǎng)形式，是因為除莖尖分生組織培養(yǎng)和一部分器官培養(yǎng)以外，其他幾種培養(yǎng)形式最終也都要經歷愈傷組織才能產生再生植株，此外，愈傷組織還常常是懸浮培養(yǎng)的細胞和原生質體的來源。第10頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）器官培養(yǎng)：主要指根端、莖尖、葉以及未成熟果實等的培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)具有快速繁殖和脫除病毒的作用。第11頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）細胞培養(yǎng)：分散性的離體細胞或細胞團的懸浮培養(yǎng)，可用于生產，提取某些有用成分和次生物質。單細胞培養(yǎng)還可獲得單細胞無性系，進行突變體選育。第12頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）原生質體培養(yǎng)：將去除細胞壁的裸露植物細胞進行離體培養(yǎng)，主要用于遺傳操作。第13頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月5．脫分化（Differentiation）

在組織培養(yǎng)中，當我們把分化組織中的不分裂的靜止細胞，放在一種能促進細胞增殖的培養(yǎng)基上以后，細胞內就會發(fā)生某些變化，從而使細胞進入分裂狀態(tài)。一個成熟細胞轉變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程叫做脫分化。第14頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月6．再分化（植株再生方式）

脫分化后的細胞進行再分化的過程有兩種不同的方式：器官發(fā)生方式和胚胎發(fā)生方式。

第15頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)器官發(fā)生方式:其中莖芽和根是在愈傷組織的不同部位分別獨立形成的，形成的時間可能也不一致，它們?yōu)閱螛O性結構，里面各有維管束與愈傷組織相連，但在不定芽和不定根之間并沒有共同的維管束把二者連在一起；第16頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)胚胎發(fā)生方式:即在愈傷組織表面或內部形成很多胚狀體，或稱體細胞胚，它們經歷的發(fā)育階段與合子胚相似，成熟胚狀體的結構也與合子胚相同。胚狀體是雙極性的，有共同的維管束貫穿兩極，可脫離愈傷組織在無激素培養(yǎng)基上獨立萌發(fā)。第17頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月二、植物組織培養(yǎng)的發(fā)展歷史雖然組織培養(yǎng)技術的蓬勃發(fā)展只是近30年來的事，但它的整個歷史可以追溯到上世紀末和本世紀初。從那時起到現(xiàn)在，組織培養(yǎng)的發(fā)展過程大致可以分為三個階段：第18頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1．探索階段（20世紀初至30年代中）

1902年，Haberlandt（德國植物生理學家）首次進行離體細胞實驗，發(fā)表了“植物離體細胞培養(yǎng)實驗”報告；

1904年，Haunts在無機鹽和蔗糖溶液中培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，并使這些胚在離體條件下長到成熟。

1922年，Robbins（美國）和Kotte（德國）分別報道培養(yǎng)離體根尖獲得某些成功，這是有關根培養(yǎng)的最早的實驗。1925年，Laibach把由亞麻種子和雜交形成的不能成活的種子中的胚剖出，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)至成熟，從而證明了胚培養(yǎng)在植物遠緣雜交中利用的可能性；第19頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2．奠基階段（30年代中至50年代末）

1934年，White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性系，第一次器官培養(yǎng)；起初，他在實驗中使用的培養(yǎng)基包含無機鹽、酵母浸出液和蔗糖。后來（1937），他用3種B族維生素，即毗哆醇、硫胺素和煙酸，取代酵母浸出液獲得成功。在這個以后被稱為White培養(yǎng)基的合成培養(yǎng)基上，他把某些干1934年建立起來的根培養(yǎng)物一直保存到1968年他逝世前不久。

第20頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1934年，Gautheret在山毛柳和黑楊等形成層組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，雖然在含有葡萄糖的Knop溶液中，這些組織也可以不斷增殖幾個月，但只有在培養(yǎng)基中加入了B族維生素和IAA以后，山毛柳形成層組織的生長才能顯著增加。由于這些實驗揭示了B族維生素和生長素的重要意義，又直接導致了同年，White由煙草種間雜種的瘤組織1939年，Gautheret連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功；

1934年，Nobecourt由胡蘿卜，也建立了類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物；因此，Gau－theret，White和Nobecourt一起被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人。

第21頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

50年代開始以后，植物組織培養(yǎng)的研究日趨繁榮，10年當中引人注目的進展就有以下6項：

1952年，Morel和Martin首次證實，通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，可以由已受病毒侵染的大麗花中獲得無毒植株。

第22頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1953～1954年，Muir進行單細胞培養(yǎng)獲得初步成功。方法是把萬壽菊（Tageteserecta）和煙草的愈傷組織轉移到液體培養(yǎng)基中，放在搖床上振蕩，使組織破碎，形成由單細胞和細胞聚集體組成的細胞懸浮液，然后通過繼代培養(yǎng)進行繁殖。Muir等還用機械方法由細胞懸浮液和容易散碎這種“看護培養(yǎng)”技術揭示了實現(xiàn)Haberlandt培養(yǎng)單細胞這一設想的可能性。

第23頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1955年，Miller等由鯡魚精子DNA中分離出一種首次為人所知的細胞分裂素，并把它定名為激動素（kinetin）。現(xiàn)在，具有和激動素類似活性的合成的或天然的化合物已有多種，它們總稱為細胞分裂素（cytokinin）。應用這類物質，我們就有可能誘導已經成熟分化的組織（如葉肉和干種子胚乳）的細胞進行分裂。第24頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

1957年，Skoog和Miller提出了關于植物激素控制器官形成的概念，指出在煙草髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長素對細胞分裂素比率的函數(shù)，通過改變培養(yǎng)基中這兩類生長調節(jié)物質的相對濃度可以控制器官的分化：這一比率高時促進生根，低時促進莖芽的分化，二者濃度相等時，組織則傾向于以一種無結構的方式生長。后來證明，激素可調控器官發(fā)生的概念對于多數(shù)物種都可適用，只是由于在不同組織中這些激素的內生水平不同，因而對于某一具體的形態(tài)發(fā)生過程來說，它們所要求的外源激素的水平也會有所不同。

第25頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

1958年，Wickson和Thimann指出，應用外源細胞分裂素可促成在頂芽存在的情況下處于休眠狀態(tài)的胞芽的生長。這意味著，當把莖尖接種在含有細胞分裂素的培養(yǎng)基上以后，可使側芽解除休眠狀態(tài)，且能夠從頂端優(yōu)勢下解脫出來的不只是那些存于原來莖尖上的腋芽，此外，還有由原來的莖尖在培養(yǎng)中長成的側枝上的腋芽，結果就會形成一個郁郁蔥蔥的結構，里面包含了數(shù)目很多的小枝條，其中每個小枝條又可取出來重復上述過程，于是在相當短的時間內，就可以得到成千上萬的小枝條。當把這些小枝條轉移到另外一種培養(yǎng)基上誘導生根以后，即可移植于土壤中。后來，Murashige發(fā)展了這一方法，制訂了一系列標準程序，把這一方法廣泛用于到花卉和果樹的快速繁殖上。第26頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

1958～1959年，Reinert和Steward分別報道，在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細胞胚。這是一種不同于通過芽和根的分化而形成植株的再生方式?，F(xiàn)在知道有很多物種都能形成體細胞胚。在有些植物如胡蘿卜和毛獎中，事實上由植物體的任何部分都可以得到體細胞胚。

第27頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月綜上所述，在這一發(fā)展階段中，通過對培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分的廣泛研究，特別是對B族維生素、生長素和細胞分裂素在組織培養(yǎng)中作用的研究，已經實現(xiàn)了對離體細胞生長和分化的控制，從而初步確立了組織培養(yǎng)的技術體系，為以后的發(fā)展奠定了基礎。第28頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月3．迅速發(fā)展階段（60年代至現(xiàn)在）

據(jù)羅土韋統(tǒng)計，在60年代初期，全世界還只有十幾個國家的少數(shù)實驗室從事組織培養(yǎng)研究，但到了70年代，組織培養(yǎng)領域仍然空白的國家已經屈指可數(shù)。60年代以來組織培養(yǎng)技術所以得到了迅速發(fā)展，一方面是由于有了前60年建立的理論和技術基礎；另一方面是由于這項技術開始走出了植物學家和植物生理學家的實驗室，通過與常規(guī)育種、良種繁育和遺傳工程技術相結合，在植物改良中發(fā)揮了重要的作用，并且在若干方面已經取得了可觀的經濟效益。60年代以來組織培養(yǎng)技術的發(fā)展，概括起來可以分為三個方面：第29頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）原生質體培養(yǎng)取得重大突破

1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質體獲得成功，激發(fā)了人們對原生質體培養(yǎng)的熱情。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質體獲得了再生植株，這不但在理論上證明了除體細胞和生殖細胞以外，無壁的原生質體同樣具有全能性，而且在實踐上可以為外源基因的導入提供理想的受體材料。最近幾年間，水稻、玉米、小麥、高粱、谷子和大麥等的原生質體培養(yǎng)才相繼告捷。原生質體培養(yǎng)的成功，促進了體細胞融合技術的發(fā)展。1972年，Carlson等通過兩個煙草物種之間原生質體的融合，獲得了第一個體細胞雜種。后來在有性親合及有性不親合的親本之間，又獲得了若干其他的體細胞雜種。第30頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）花藥培養(yǎng)取得顯著成績

1964年，Guha和Maheshwari報道，在南洋金花中通過離體花藥培養(yǎng)由小抱子直接發(fā)育成胚。1967年，Bourgin和Nitsch通過花藥培養(yǎng)獲得了完整的煙草植株。由于單倍體在突變選擇和加速雜合體純合化過程中的重要作用，這一領域的研究在整個70年代得到了迅速發(fā)展，獲得成功的物種數(shù)目增加到160余種，其中包括很多種重要的栽培植物。煙草、水稻和小麥等的花培育種在中國取得了引人注目的成就。第31頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）微繁技術得到廣泛應用

1960年，Morel提出了一個離體無性繁殖蘭花的方法，繁殖系數(shù)極高。由于這一方法有巨大的實用價值，很快被蘭花生產者所采用，迅速建立起“蘭花工業(yè)”，目前，用這種方法繁殖的蘭花至少已有35個屬150余種。除蘭花外，在其他很多觀賞植物和經濟作物（如甘蔗和草萄等）中，微繁也已達到了工廠化的生產規(guī)模，在若干作物中與通過莖尖培養(yǎng)進行脫毒相結合，產生了可觀的經濟效益。第32頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

在整個組織培養(yǎng)發(fā)展的歷史中，我國學者曾經做出過多方面的貢獻。除了前面提到過的崔墩的工作以外，1933年李繼侗等關于銀杏胚胎培養(yǎng)的工作，1935～1942年間羅宗洛等關于玉米等植物離體根尖培養(yǎng)的工作，以及后來羅主韋關于幼胚和莖尖培養(yǎng)的工作，李正理等關于離體胚培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生及離體莖尖培養(yǎng)的工作，王伏雄等關于幼胚培養(yǎng)的工作等，都是組織培養(yǎng)各有關領域里的有價值的文獻。70年代以來，我國組織培養(yǎng)研究出現(xiàn)了新的局面，發(fā)展速度較快，在某些方面已經做出了舉世公認的重要成績，尤其是在花藥培養(yǎng)和原生質體培養(yǎng)方面，我國學者的工作已經受到世界各國同行的普遍重視和贊賞。第33頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

從上述組織培養(yǎng)發(fā)展簡史我們可以看到，象任何其他科學領域一樣，組織培養(yǎng)在開始時也只是一種純學術性的研究，用以回答有關植物生長和發(fā)育的某些理論問題。但其發(fā)展的結果，卻顯示出巨大的應用價值，某些技術已經在農業(yè)生產中直接或間接地產生了顯著的經濟效益，并且肯定將會產生更大的經濟效益。第34頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月三、組織培養(yǎng)的應用（TissueCultureApplications）

1．用組織培養(yǎng)技術快速繁殖優(yōu)良種苗，生產“人工種子”；2.用莖尖分生組織培養(yǎng)結合熱處理脫除病毒；3.用花粉培養(yǎng)培育遺傳上純合的優(yōu)良新品種；4.用植物試管受精或胚胎培養(yǎng)獲得種間或屬間遠緣雜種；

第35頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

5.用細胞融合技術生產植物體細胞雜種和病害檢測用的單克隆抗體；6.用植物懸浮細胞和固定化細胞技術生產有用的次生代謝產物；7.用液氮冷凍植物組織或細胞，保存種質資源。第36頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月四、植物組織培養(yǎng)的發(fā)展前景

目前我國共有較大型的植物組培快繁企業(yè)50多家,主要繁殖花卉、果樹和經濟樹木的良種苗木。但年生產能力多在100萬株以下,且90%以上的企業(yè)實際處于虧損狀態(tài)。其中的主要問題有兩個:一是生產規(guī)模太小,二是生產成本太高。這兩個問題是相互聯(lián)系的。只有通過擴大規(guī)模,降低成本,才能充分發(fā)揮這種高新技術在現(xiàn)代植物生產和農業(yè)產業(yè)化中的重要作用。植物組織培養(yǎng)技術的發(fā)展主要體現(xiàn)在以下三個方面:第37頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1．組培容器的大型化

目前大量使用的是玻璃或耐高溫塑料制成的三角瓶、罐頭瓶,最大體積不超過500毫升。通過模擬植物在微生態(tài)條件下的氣體交換、營養(yǎng)吸收、形態(tài)建成,計算植物微群落生長的最佳空間形狀與大小,依此改進容器形態(tài),擴大體積,增加單位培養(yǎng)面積中組培苗的數(shù)量。同時改良封口材料,以達到優(yōu)質(通氣隔菌)、方便、耐久的目的。第38頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2