chap結構生物信息學

生物信息學第八章基因芯片分析中國科學技術大學目前一頁\總數五十六頁\編于十一點本章內容提要1.Microarray簡介2.圖像處理與數據標準化3.基因芯片的數據分析4.Microarray:工具&數據庫目前二頁\總數五十六頁\編于十一點基因芯片1.基因芯片(1987)2.根據免疫測定的(immunoassay)的方法予以改進3.高通量、點陣以及Northern雜交同時測定細胞內數千個基因的表達情況將mRNA反轉錄成cDNA與芯片上的探針雜交4.芯片的體積非常?。何⒘繕悠返臋z測5.基因表達情況的定量分析6.其他類型的芯片：組織芯片蛋白質芯片目前三頁\總數五十六頁\編于十一點基因芯片的密度：100-1millionDNA探針/1cm2將樣品中的DNA/RNA表上熒光標記，則可以定量檢驗基因的表達水平堿基互補目前四頁\總數五十六頁\編于十一點基因表達情況的定量測定1.發(fā)現在特定生長時期，或者隨著環(huán)境變化，那些基因的表達收到誘導或者抑制2.在相同條件下，上調或者下調變化規(guī)律相似的基因，可能具有功能上的關聯3.可以從共表達的基因中尋找調控模體4.基因表達的模式可以用來表征異常的細胞調控，例如，癌癥的診斷目前五頁\總數五十六頁\編于十一點基因芯片技術的類型按技術手段、探針類型分類1.Shortoligonucleotidearrays(Affymetrix)2.cDNAarrays(Brown/Botstein)3.Longoligoarrays(Agilent)4.Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)按實驗要求分類1.單通道(SingleChannel):一次檢驗一種狀態(tài)2.雙通道(DualChannel):差異表達基因的篩選目前六頁\總數五十六頁\編于十一點兩類主流的DNA芯片1.cDNAmicroarrays:將500~5,000bp的cDNA固載到介質上(例如玻璃)，Stanford開發(fā)設計，通常為雙通道2.DNAchips:將寡核苷酸探針(20~80-mer)合成到芯片上，Affymetrix開發(fā)設計，通常為單通道目前七頁\總數五十六頁\編于十一點(1)cDNAmicroarrayscDNAclones目前八頁\總數五十六頁\編于十一點Robotspotter普通的蓋玻片cDNAmicroarrays的制備目前九頁\總數五十六頁\編于十一點差異表達基因的篩選Treatment/controlNormal

/tumortissueBrain/liver…目前十頁\總數五十六頁\編于十一點點樣后的cDNAMicroarrays目前十一頁\總數五十六頁\編于十一點GenesmRNAsamplesGeneexpressionlevelofgeneiinmRNAsamplej=Log(Redintensity/Greenintensity)Log(Avg.PM-Avg.MM)

sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 …1 0.46 0.30 0.80 1.51 0.90 ...2 -0.10 0.49 0.24 0.06 0.46 ...3 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20 ...4 -0.45 -1.03 -0.79 -0.56 -0.32 ...5 -0.06 1.06 1.35 1.09 -1.09 ...基因表達的數據目前十二頁\總數五十六頁\編于十一點(1)DNAchips目前十三頁\總數五十六頁\編于十一點目前十四頁\總數五十六頁\編于十一點DNAchips的制備：

Affymetrixphotolitography探針長度：25bp每個基因：22-40個探針PerfectMatch(PM)vs.MisMatch(MM)probes目前十五頁\總數五十六頁\編于十一點點樣后的Genechip目前十六頁\總數五十六頁\編于十一點總結目前十七頁\總數五十六頁\編于十一點基因芯片的實驗流程目前十八頁\總數五十六頁\編于十一點2.圖像處理與數據標準化單通道基因芯片

white(veryhigh)

red(high)

Yellow(alittlehigh)green(medium)blue(low)black(no)目前十九頁\總數五十六頁\編于十一點圖像處理植根區(qū)域生長法(SRG)FixedCircle柵格化：確定點的位置圖象分割(Segmentation)：將點從背景中分離出來。抽提亮度：各個像素亮度的平均值(mean)或中位數(median)背景校正：局部或全局目前二十頁\總數五十六頁\編于十一點基因表達量的定量對于每個點，我們可以計算Redintensity=Rfg-Rbgfg=foreground,bg=background,andGreenintensity=Gfg-Gbgandcombinetheminthelog(base2)ratioLog2(Redintensity/Greenintensity)

Greenintensity(medium):~1目前二十一頁\總數五十六頁\編于十一點Microarray:誤差的來源系統(tǒng)的隨機的

log

signalintensity

logRNAabundance目前二十二頁\總數五十六頁\編于十一點Microarray:誤差的來源1.圖像分析2.掃描3.DNA雜交過程(溫度、時間、混合均勻程度等)4.探針的標記5.RNA的抽提6.加樣7.其他目前二十三頁\總數五十六頁\編于十一點Red/green比值存在亮度的傾向M=log2R/G=log2R-log2G=(log2R+log2G)/2Valuesshouldscatteraboutzero.目前二十四頁\總數五十六頁\編于十一點數據標準化beforeafter目前二十五頁\總數五十六頁\編于十一點3.基因芯片的數據分析(1)差異表達基因的分析(2)基因共表達分析(3)基因表達數據的聚類(4)基因表達數據的分類(5)MaptoGO(6)Generegulatorynetwork目前二十六頁\總數五十六頁\編于十一點(1)差異表達基因的分析1.差異表達基因的分析:尋找處理前后表達上調或者下調的基因2.Arethetreatmentsdifferent?3.使用標準的統(tǒng)計學方法檢驗(t-testorf-test)，發(fā)現統(tǒng)計顯著性差異表達的基因，4.如果處理本身并不顯著，則結果無意義目前二十七頁\總數五十六頁\編于十一點統(tǒng)計學分析1.Foldchange,一般2-foldincreaseordecrease(平行實驗的樣本較少)2.p-value(平行實驗的樣本較多)under-expressedover-expressed/2/2目前二十八頁\總數五十六頁\編于十一點P-value:學生分布1.T-test:學生分布2.Excel函數：TTEST(array1,array2,tails,type)Array1為第一個數據集Array2為第二個數據集Tails指示分布曲線的尾數。如果tails=1，函數TTEST使用單尾分布。如果tails=2，函數TTEST使用雙尾分布Type為t檢驗的類型1成對2等方差雙樣本檢驗3異方差雙樣本檢驗目前二十九頁\總數五十六頁\編于十一點P-value:學生分布1.一般選擇雙尾分布2.異方差雙樣本檢驗3.Excel函數：=TTEST(B2:D2,E2:G2,2,3)

4.C：對照組；T：實驗組C1C2C3T1T2T3TTESTGene11.3221.6761.4573.5264.2343.8790.001988目前三十頁\總數五十六頁\編于十一點MultipleComparisons1.在基因芯片的實驗中，每一個基因/探針，都是一個獨立的實驗2.基因芯片：高通量，>1,000個基因/探針3.因此，無論怎么比較，總會有一些基因會是統(tǒng)計顯著性差異表的——可能是隨機產生的4.如何評估表達差異基因預測的有效性？5.例：1,000個探針的雙通道芯片，以p-value<0.01為域值，發(fā)現7個上調基因，5個下調基因，分析結果是否具有統(tǒng)計學意義？目前三十一頁\總數五十六頁\編于十一點FalseDiscoveryRate(FDR)1.Falsepositiveprediction:“Type1error"or"FalseDiscovery"2.FalseDiscoveyRate(FDR)=p-value*No.ofGenes上例：FDR=0.01*1,000=10(隨機)7個上調基因，5個下調基因<10因此上例計算的結果無統(tǒng)計學意義3.FDR必須遠小于發(fā)現的差異表達基因數目實驗的有效性p-value的選擇目前三十二頁\總數五十六頁\編于十一點(2)基因共表達分析1.在N個不同的條件下(時間序列的芯片數據)，考察基因X和Y的表達是否相似2.Gene1#是否與Gene2#、Gene3#和Gene4#共表達？3.共表達：正相關：相似的表達譜，可能存在正關聯負相關：相反的表達譜，可能存在負調控EisenMB,etal.,(1998)PNAS95:14863-14868GeneNameT1T2T3T4T5T6Gene1#123456Gene2#100200300400550610Gene3#660540430320210101Gene4#150421535725451670998目前三十三頁\總數五十六頁\編于十一點沒有相關性？目前三十四頁\總數五十六頁\編于十一點基因相關性分析1.Spearmanrankcorrelation2.Kendall'stau3.Euclideandistance4.Pearsoncorrelationcoefficient:-1~1Excel函數：=PEARSON(array1,array2)EisenMB,etal.,(1998)PNAS95:14863-14868目前三十五頁\總數五十六頁\編于十一點Pearson相關系數1.r~[-1,1]r~1，正相關r~-1，負相關Gene1#Gene2#Gene3#Gene1#Gene2#0.996368Gene3#-0.99988-0.99611Gene4#0.2452920.254855-0.2395結論：Gene1#與Gene2#表達正相關，與Gene3#表達負相關，與Gene4#無關聯目前三十六頁\總數五十六頁\編于十一點(3)基因表達數據的聚類1.將表達譜相似的基因聚類在一起2.無督導學習(unsupervisedlearning)3.Patternfinding:發(fā)現新的模式4.聚類方法：A.HierarchicalclusteringB.K-meansclusteringHierarchicalClustering目前三十七頁\總數五十六頁\編于十一點Hierarchicalclustering1.用樹狀結構來表征基因表達之間的相似性/相關性2.優(yōu)點：不需要指定結果有多少類Object123451223654109459853DistancematrixDistanceCluster01,2,3,4,52(1,2),3,4,53(1,2),3,(4,5)4(1,2),(3,4,5)5(1,2,3,4,5)目前三十八頁\總數五十六頁\編于十一點K-meansclustering1.對數據進行聚類2.必須給定結果分成多少類！3.假設，該例中，指定為聚成5類目前三十九頁\總數五十六頁\編于十一點K-meansclustering1.隨便選取5個點，作為每一個類的中心點目前四十頁\總數五十六頁\編于十一點K-meansclustering2.計算其他點與這5個中心點的距離距離：歐氏距離馬氏距離皮爾孫相關系數…點的歸類：離哪個中心點近，歸哪個類目前四十一頁\總數五十六頁\編于十一點K-meansclustering3.針對每一類中的每一個點，計算其與其他點的距離，加和，除以該類點的數目；找到新的中心點，即改點到該類中其他點的平均值最?。淮_定新的5個中心點！目前四十二頁\總數五十六頁\編于十一點K-meansclustering4.重復2,3，直到結果收斂實際操作時，因結果完全收斂時間過長，一般指定迭代的次數，如1,000次目前四十三頁\總數五十六頁\編于十一點K-meansclustering5.最終結果：所有基因芯片數據被聚成5類軟件：Cluster3.0,MichaelEissen,Stanford目前四十四頁\總數五十六頁\編于十一點(4)基因表達數據的分類1.根據基因表達的數據將樣本分成兩類或多類；2.督導學習(supervisedlearning)：根據發(fā)現的pattern進行預測3.應用：癌癥vs.正常組織癌癥的亞型、不同階段(良性的vs.惡性的)對藥物的敏感性(tamoxifenforbreastcancer)目前四十五頁\總數五十六頁\編于十一點DiffuselargeB-celllymphoma(DLBCL)1.通過聚類發(fā)現各種亞型之間的關系