HPLCfinal高效液相色譜分析

HPLCfinal高效液相色譜分析演示文稿目前一頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)2HPLCfinal高效液相色譜分析目前二頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。

不同點(diǎn)僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率

和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化

操作。高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動(dòng)相的新色譜技術(shù)。一、概述HPLC的特點(diǎn)目前三頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度

高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定的有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。二、高效液相色譜法的特點(diǎn)

目前四頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素

高效液相色譜法的基本概念及理論基礎(chǔ)，如保留值、分配系數(shù)、分配比、分離度、塔板理論、速率理論等與氣相色譜法是一致的。而兩者的主要區(qū)別可歸結(jié)于流動(dòng)相的不同。高效液相色譜的流動(dòng)相為液體，而氣相色譜的流動(dòng)相為氣體。目前五頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)液體的擴(kuò)散系數(shù)只有氣體的萬分之一至十萬分之一；液體的粘度比氣體大一百倍，而密度為氣體的一千倍。這些差別將對(duì)色譜過程產(chǎn)生影響。參數(shù)氣體液體擴(kuò)散系Dm/cm2·s-1密度ρ/g·cm-3粘度η/g·(cm·s)-110-110-310-410-5110-2目前六頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)He與氣相色譜相同。2.縱向（分子）擴(kuò)散項(xiàng)Hd式中：Cd為一常數(shù)；Dm為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)。高效液相色譜中的速率方程式

由于分子在液體中的擴(kuò)散系數(shù)比氣體中小4~5個(gè)數(shù)量級(jí)，因此在液相色譜中，當(dāng)流動(dòng)相的線速度大于0.5cm/s時(shí)，縱向擴(kuò)散項(xiàng)對(duì)色譜峰的擴(kuò)展的影響可以忽略。而氣相色譜中這一項(xiàng)卻是重要的。目前七頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

3.傳質(zhì)阻力項(xiàng)（1）固定相傳質(zhì)阻力：發(fā)生在液-液分配色譜中。式中：Cs是與容量因子有關(guān)的常數(shù)；Ds是試樣分子在固定液內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)；df是固定液膜的厚度。固定相傳質(zhì)：試樣分子從流動(dòng)相進(jìn)入到固定液內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量交換的傳質(zhì)過程目前八頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)（2）流動(dòng)相傳質(zhì)阻力a.流動(dòng)的流動(dòng)項(xiàng)中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)Hm式中：Cm是一個(gè)與容量因子有關(guān)的常數(shù)，其值取決于柱直徑、形狀和填充的填料結(jié)構(gòu)。當(dāng)柱填料規(guī)則排列并緊密填充時(shí)，Cm降低。dp為固定相粒度；Dm是試樣分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)。b.滯留的流動(dòng)項(xiàng)中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)Hsm式中Csm是一與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)的常數(shù)。目前九頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)高效液相色譜中的速率方程式為：簡寫為：與氣相色譜的速率方程式一致，其主要區(qū)別在于縱向(分子)擴(kuò)散項(xiàng)可以忽略不計(jì)，影響柱效的主要因素是傳質(zhì)項(xiàng)。目前十頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)GC的H-u曲線是一條拋物線，有一個(gè)最低點(diǎn)（最佳流速）；HPLC的H-u曲線是一條斜率不大的直線，這表示分子擴(kuò)散項(xiàng)對(duì)H基本上沒有影響，這也說明HPLC分離可以在高的流動(dòng)相流速下而不至于使柱效損失太多，從而可以實(shí)現(xiàn)快速分離。目前十一頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u較小，可以忽略不計(jì)，即：

H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同。液體的粘度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。討論——影響分離的因素與提高柱效的途徑目前十二頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。1.固定相粒度目前十三頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)2.流速

流速大于0.5cm/s時(shí),H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。

3.固定相及分離柱氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。目前十四頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相間的分配；

流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。

C-18柱（反相柱）。HPLC的主要類型及其分離原理一、液-液分配色譜目前十五頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

固定相：為固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；

適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；二、液-固吸附色譜

目前十六頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生反復(fù)的離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。三、離子交換色譜

目前十七頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；

反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+X-后；在兩相間分配。四、離子對(duì)色譜目前十八頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。

五、離子色譜目前十九頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；可采用電導(dǎo)檢測器，快速分離分析微量無機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。1.離子色譜法原理目前二十頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)（1）分析速度快

可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；（2）分離能力高在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2.

離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)目前二十一頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離六、排阻色譜色譜目前二十二頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)（1）全多孔型擔(dān)體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；

（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30~40μm的玻璃微球(實(shí)心)，表面附著一層厚度為1~2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量低；液相色譜固定相

1.液-液分配及離子對(duì)分離固定相目前二十三頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)（3）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相:用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面，是目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N目前二十四頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；（3）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（4）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)目前二十五頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

2.液-固吸附分離固定相

目前二十六頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂

薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相

薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）3.離子交換色譜分離固定相目前二十七頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。4.空間排阻分離固定相目前二十八頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

1.流動(dòng)相特性（1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。液相色譜的流動(dòng)相

目前二十九頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

按流動(dòng)相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。2.流動(dòng)相類別目前三十頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)3.流動(dòng)相選擇目前三十一頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。4.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題目前三十二頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)液相色譜儀器

目前三十三頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)目前三十四頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)高效液相色譜儀1.流程目前三十五頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2.主要部件目前三十六頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)(2)梯度淋洗裝置外梯度（低壓梯度）:

常壓下將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后用高壓泵送入色譜柱。內(nèi)梯度（高壓梯度）:利用兩臺(tái)高壓輸液泵增壓后，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。目前三十七頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)(3)進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置目前三十八頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1~6mm，柱長5~40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。(4)高效分離柱目前三十九頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

(5)液相色譜檢測器目前四十頁\總數(shù)四十七頁\編于十三點(diǎn)光電二極管陣列檢測器:

紫外檢測器的重要進(jìn)展；1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三