甘薯脫毒技術(shù)“衡水賽”一等獎(jiǎng)

作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯脫毒技術(shù)靳改龍2019.2

甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯生產(chǎn)技術(shù)(一）甘薯脫毒的重大意義“脫毒甘薯”指的是通過(guò)組培技術(shù)得到的植株，并經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病毒檢測(cè)、確認(rèn)不帶有某些病毒的甘薯及其在無(wú)蚜蟲(chóng)條件和無(wú)病源土壤繁育的后代。

甘薯脫毒技術(shù)是生物技術(shù)、病毒學(xué)技術(shù)和良種繁育技術(shù)有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)脫毒一般可增產(chǎn)20％～30％，并對(duì)其外觀、商品性還有所改善。因此，選用脫毒甘薯良種是取得甘薯高產(chǎn)的前提。由于甘薯本身無(wú)性繁殖的特點(diǎn)，甘薯品種一旦感染病毒后，病毒即在體內(nèi)積累并通過(guò)薯塊代代相傳。病毒病不同于真菌和細(xì)菌病害，無(wú)法用殺菌劑和抗生素予以防治。雖然有些化學(xué)物質(zhì)如人工合成的藥劑以及某些提取的天然物質(zhì)能抑制病毒增殖，但由于病毒不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它的核酸入侵寄主后，利用寄主的代謝功能復(fù)制自己，因此，它和寄主的依存關(guān)系更為密切，雖然很多藥劑能使病毒在體外失活，但施用于感染病毒的寄主以防治病毒病，亦對(duì)寄主具有嚴(yán)重的毒害作用。目前尚無(wú)有效的化學(xué)藥劑防治病毒病，生產(chǎn)中也缺少高抗或免疫的甘薯品種。防治甘薯病毒病最有效的途徑是培養(yǎng)、推廣脫毒甘薯，從根本上克服病毒病對(duì)甘薯生產(chǎn)造成的危害，關(guān)鍵是要獲得無(wú)病毒種苗。無(wú)病毒種苗是產(chǎn)生健康植株的前提和基礎(chǔ)，而且由于無(wú)病毒種苗投放生產(chǎn)后，又會(huì)逐漸感染病毒，因此，只有保證能源源不斷地為生產(chǎn)提供無(wú)病毒種苗，才能獲得甘薯的持續(xù)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，充分發(fā)揮甘薯的生產(chǎn)潛力作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯生產(chǎn)技術(shù)（二）甘薯脫毒的原理早在20世紀(jì)40年代，就有研究發(fā)現(xiàn)病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，在染病的植株中，愈靠近莖尖病毒含量越低，頂端分生組織不帶病毒或僅有少量病毒，隨組織的老化，病毒含量增加。莖尖分生組織不帶毒或很少帶毒的可能原因是：在旺盛生長(zhǎng)的分生組織細(xì)胞中，細(xì)胞的代謝活性很高，病毒的復(fù)制速度趕不上細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，另外，病毒在甘薯體內(nèi)主要通過(guò)維管束組織和胞間連絲途徑運(yùn)轉(zhuǎn)，而在莖尖分生組織中維管束尚未形成，胞間連絲的傳導(dǎo)速度低于莖尖的快速生長(zhǎng)，這速度之差就形成了莖尖無(wú)病毒區(qū)。甘薯脫毒苗的培養(yǎng)是利用甘薯莖尖導(dǎo)管組織不健全，病毒顆粒不易通過(guò)，甘薯莖尖不帶或很少帶病毒的原理,削離莖尖培養(yǎng)甘薯莖尖苗,對(duì)莖尖進(jìn)行病毒檢測(cè),選出不帶病毒的莖尖進(jìn)行快速繁殖后在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用利用以上所述莖尖存在無(wú)病毒區(qū)的現(xiàn)象，結(jié)合細(xì)胞全能性理論，在無(wú)菌條件下切取甘薯莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，即可得到不帶病毒的植株。1960年NielSen用莖尖培養(yǎng)成功獲得甘薯無(wú)病毒植株，此后，國(guó)內(nèi)外許多研究者在這方面做了大量卓有成效的工作。研究表明，莖尖離體培養(yǎng)可有效地去除甘薯體內(nèi)的病毒，目前甘薯莖尖分生組織脫毒技術(shù)已進(jìn)入實(shí)用階段。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯生產(chǎn)技術(shù)（三）甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)1.甘薯脫毒的準(zhǔn)備①器具條件除了高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、鑷子、解剖針、長(zhǎng)柄刀片等植株組織培養(yǎng)所需的一般工具外，由于須剝離只帶1～2個(gè)葉原基的莖尖分生組織，大小只有0．1—0．3毫米，所以。還需要準(zhǔn)備1臺(tái)雙目解剖鏡。②培養(yǎng)基的配制甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)目前常用的為MS培養(yǎng)基，由于在莖尖培養(yǎng)及試管微繁中需要經(jīng)常配制培養(yǎng)基，為方便起見(jiàn)，一般將培養(yǎng)基組分先配成比所需濃度高的母液，配制培養(yǎng)基時(shí)只要按比例量取即可。一般將大量元素[MS(一)]配制成10倍溶液，F(xiàn)e鹽[MS(二)]、微量元素[MS(三)]及維生素[MS(四)]配成100倍溶液，分別存放。具體配方如下：

MS(一)：

NH4N031650×10=16500毫克

KNO31900×10=19000毫克

CaCl2·2H20440×10=4400毫克

M克S04·7H20370×10=3700毫克

KH2P04170×10=1700毫克稱取以上藥品，順序溶解后定溶至1000毫升，即成MS(一)10倍母液，取量100毫/升。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯生產(chǎn)技術(shù)（三）甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)MS(二)：

FeS04·7H2027．8×100=2780毫克

Na2一EDTA37．3×100=3730毫克按以上重量稱取藥品分別溶解后，置火上煮20～30分鐘，以使Fe鹽充分絡(luò)合，呈黃亮溶液。冷卻后定容至1000毫升，為100倍Fe鹽母液，取量10毫升／升。

MS(三)：

H3B036．2×100=620毫克

MnS04·4H2022．3×100=2230毫克

CoCl2·6H200．025×100=2．5毫克

CuS04·5H200．025×100=2．5毫克

ZnS04·7H208．6×100=860毫克

Na2Mo04·2H200．25×100=25毫克

KI0．83×100=83毫克分別溶解后定容至1000毫升，取量10毫升／升。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯生產(chǎn)技術(shù)（三）甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)Ms(四)：維生素B1O．1×100=10毫克維生素B60．5×100=50毫克煙酸0．5×100=50毫克甘氨酸2．0×100=200毫克溶解后定容至1000毫升，取量100毫升／升。肌醇可在配制培養(yǎng)基時(shí)加入，以免引起母液渾濁。母液配制好后，分別貼上標(biāo)簽，標(biāo)明母液號(hào)、倍數(shù)、取量及配制日期，置于冰箱備用。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)也如上所述分別制成一定濃度的母液備用。配制培養(yǎng)基時(shí)，先稱取6克／升瓊脂粉加水溶解，并煮沸，以避免濃度不勻，然后按母液順序依次量取規(guī)定的量后加入已溶解的瓊脂中，最后加入30克／升蔗糖，定容至所配制體積。甘薯莖尖培養(yǎng)基pH值以5.8為宜，可用NaOH或HCl調(diào)節(jié)，然后用pH值試紙或酸度計(jì)進(jìn)行pH值測(cè)試。培養(yǎng)基趁熱分注后進(jìn)行高壓滅菌，一般保持7.84×104～10.78×104pa壓力，20分鐘既可達(dá)到滅菌效果，培養(yǎng)基也不受破壞。蒸餾水和器具消毒以30分鐘為宜。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯生產(chǎn)技術(shù)（三）甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)③外植體取材與消毒甘薯外植體取自苗床、大田植株或人工控制條件下薯塊產(chǎn)生的幼芽均可，以生長(zhǎng)健壯為宜，過(guò)弱不易剝?nèi)∏o尖，莖尖接種后也不易成活。外植體進(jìn)行消毒的原則是既要達(dá)到良好的消毒效果，又要將對(duì)外植體的毒害限制在最低限度，保持較高的成活率。具體方法如下：剪取2～3厘米芽段，去除較大葉片后，對(duì)頂芽進(jìn)行表面消毒。先將芽段置于燒杯中，加入少量洗衣粉、洗滌劑振蕩洗滌15分鐘，然后用清水沖洗干凈，置超凈工作臺(tái)備用。在超凈工作臺(tái)上，選用70％酒精浸泡30秒(酒精有很強(qiáng)的穿透力，切記時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng))，然后用2％次氯酸鈉溶液浸10分鐘或0．1％氯化汞浸6分鐘，其間要不斷振蕩，最后用無(wú)菌水沖洗3～4遍。次氯酸鈉能分解產(chǎn)生具有殺菌作用的氯氣而揮發(fā)掉，相對(duì)比較安全，副作用??；氯化汞較難去除，且毒力很強(qiáng)，易對(duì)外植體產(chǎn)生毒害，處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。在實(shí)際操作中，由于莖尖分生組織有彼此重疊的葉原基嚴(yán)密保護(hù)，消毒方法可視外植體的來(lái)源靈活掌握，如人工控制條件下薯塊產(chǎn)生的幼芽比從大田所取外植體雜菌污染機(jī)會(huì)要少，只要操作仔細(xì)，即可避免接種莖尖發(fā)生污染。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯生產(chǎn)技術(shù)(2)脫毒甘薯的生產(chǎn)脫毒甘薯的生產(chǎn)過(guò)程包括優(yōu)良品種篩選、莖尖苗培育、病毒檢測(cè)、優(yōu)良莖尖苗株系評(píng)選、高級(jí)脫毒試管苗速繁、原原種、原種和良種種薯及種苗的繁殖等8個(gè)環(huán)節(jié)，每個(gè)環(huán)節(jié)都有嚴(yán)格的要求，最終目的是保證各級(jí)種薯的質(zhì)量，充分發(fā)揮脫毒甘薯的增產(chǎn)潛力①選用優(yōu)良品種甘薯優(yōu)良品種很多，而且經(jīng)過(guò)脫毒后都能不同程度地提高產(chǎn)量、改善外觀品質(zhì)。但甘薯品種都有一定的區(qū)域適應(yīng)性和生產(chǎn)實(shí)用性，在進(jìn)行甘薯脫毒時(shí)一定要根據(jù)本地區(qū)氣候、土壤和栽培條件，選用適合本地區(qū)大面積栽培的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種或具有特殊用途的品種。②莖尖苗培育

在超凈工作臺(tái)上，把幼芽置于解剖鏡下，一手用一把短鑷子將其固定，另一手用解剖針剝離包被莖尖的葉片及葉原基，當(dāng)半透明狀的頂端分生組織充分暴露之后，用長(zhǎng)柄手術(shù)刀片將帶l～2個(gè)葉原基，長(zhǎng)0．1～0．3毫米莖尖切下，接種在附加1～2毫克／升6一BA的MS培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，26～28℃下光培養(yǎng)，莖尖膨大變綠后轉(zhuǎn)入無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)成莖尖試管苗。待苗長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)移至營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)進(jìn)行病毒檢測(cè)。一般來(lái)講，從剝莖尖到誘導(dǎo)出5～7片葉的莖尖苗至少要用60～90天。利用分生組織培養(yǎng)誘導(dǎo)甘薯莖尖苗是甘薯脫毒的技術(shù)關(guān)鍵。而且甘薯莖尖苗的培育需要有設(shè)備完善、儀器齊全的組織培養(yǎng)室，技術(shù)水平較高，投資較大，一般單位特別是基層單位不必要開(kāi)展此項(xiàng)研究，可以從有條件的單位索取已經(jīng)鑒定確認(rèn)的脫毒試管苗或原原種進(jìn)行繁育。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)甘薯生產(chǎn)技術(shù)③病毒檢測(cè)莖尖分生組織培養(yǎng)得到的莖尖苗并不都是脫毒苗，只有部分苗不含病毒，是脫毒苗；莖尖苗必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病毒檢測(cè)確認(rèn)不帶病毒后，才是脫毒莖尖苗。莖尖苗的檢測(cè)一般首先采取目測(cè)法淘汰弱苗和顯癥苗，然后再用血清學(xué)方法或分子生物學(xué)方法進(jìn)行篩選。經(jīng)血清學(xué)或分子生物學(xué)方法檢測(cè)呈陰性的樣品再進(jìn)行指示植物嫁接檢