m第十四章 基因工程

基因重組和基因工程

第十四章目錄目前一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

目前二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)DNA重組細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組接合作用、轉(zhuǎn)化作用、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)座重組同源重組特異位點(diǎn)的重組目前三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組目前四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)Holliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟①兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊②一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體拼接重組體目前五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄目前六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)片段重組體：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。目前七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄目前八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組接合作用轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用細(xì)胞融合目前九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌），這種DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。質(zhì)粒——細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子目前十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)目前十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

。

目前十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。目前十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)目錄目前十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞（供體）釋放出來、再次感染另一細(xì)胞（受體）時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。目前十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶源菌生長途徑例目錄目前十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)目錄目前十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)三、位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。目前十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)例（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復(fù)序列(LTR)。

目前十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組鼠傷寒沙門桿菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變目前二十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。目前二十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段H1鞭毛素沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列hinH2IH1目前二十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLVDJC目前二十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段目前二十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過程目錄目前二十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。目前二十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)典型的插入序列(IS)組成：二個(gè)分離的反向重復(fù)(IR)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因特有的正向重復(fù)序列

IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座復(fù)制性轉(zhuǎn)座（一）插入序列轉(zhuǎn)座目前二十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座目錄目前二十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。

轉(zhuǎn)座子組成：反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座目前二十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)目前三十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座目錄目前三十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique目前三十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉目前三十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系本節(jié)主要內(nèi)容目前三十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆目前三十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)技術(shù)水平：分子克隆即DNA克隆

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）目前三十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子。也稱基因克隆或重組DNA。目前三十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。目前三十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶目前三十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基目前四十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ目前四十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）目前四十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶目前四十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目前四十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口目前四十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)同功異源酶來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ目前四十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA目前四十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（三）目的基因

cDNA基因組DNA目的基因①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）目前四十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA目前四十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。目前五十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。目前五十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)1.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。目前五十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)目錄目前五十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列目前五十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)M13噬菌體pUC系列的物理圖譜目前五十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)3.粘性質(zhì)粒(cosmid)目前五十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他目前五十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)二、重組DNA技術(shù)基本原理克隆基本過程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

目前五十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目錄目前五十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章）目前六十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)*1、化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列目前六十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*2、從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄目前六十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)目前六十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)目前六十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目前六十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接目前六十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄目前六十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA不同限制酶切位點(diǎn)（配伍末端）的連接配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目前六十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體目錄目前六十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目前七十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄目前七十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。目前七十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄目前七十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

目前七十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄目前七十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)受體菌條件安全宿主菌（從大腸桿菌K-12改造）限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌目前七十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等目前七十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄目前七十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)目前七十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)α互補(bǔ)目錄目前八十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)α互補(bǔ)的檢測目錄目前八十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)原位雜交目錄目前八十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)Southern印跡目錄目前八十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄目前八十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體目前八十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄目前八十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(diǎn)表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)目前八十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十