免疫組化教程

word文檔精品文檔分享第一章免疫細(xì)胞化學(xué)根本概念及開展簡史一．免疫細(xì)胞化學(xué)的根本概念免疫細(xì)胞化學(xué)〔immunocytochemistry〔或抗體〕的定位和定量的技術(shù)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可以在光鏡和電鏡水平觀察細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)某種抗原物質(zhì)的存在。從而為生物醫(yī)學(xué)研究生命大分子，特別是那些對細(xì)胞化學(xué)方法來說尚無作用物或作用物特異性不強(qiáng)的酶、蛋白質(zhì)、激素及受體蛋白等在組織內(nèi)分布、細(xì)胞內(nèi)定位以及代謝狀態(tài)等，提供了特異性強(qiáng)、靈敏度高而又直觀化的原位分析細(xì)胞組成物質(zhì)的細(xì)胞化學(xué)手段。二．免疫細(xì)胞化學(xué)的開展簡史1941年，等創(chuàng)立了熒光抗體法1959年，Singer創(chuàng)立了鐵蛋白法1966年，Nakane等創(chuàng)立了免疫酶技術(shù)1971年，F(xiàn)aulk和Taylor創(chuàng)立了免疫膠體金法1976年，Bayer等提出了親合組織化學(xué)法第二章免疫細(xì)胞化學(xué)相關(guān)的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)技術(shù)一．取材〔一〕組織標(biāo)本的取材1.活檢鉗的刃口鋒利，以免組織受擠壓。2.取所需組織：主要病變區(qū)、病灶與正常組織交界區(qū)。必要時(shí)取遠(yuǎn)word文檔精品文檔分享離病變區(qū)的正常組織作為對照。3.為充分保存組織的抗原性,取材要快，盡量保持組織新鮮?！捕臣?xì)胞標(biāo)本的取材．印片法應(yīng)用：活檢標(biāo)本、手術(shù)切除的標(biāo)本。方法：新鮮標(biāo)本以最大面剖開暴露病區(qū)，載玻片輕壓病區(qū)，脫落細(xì)胞黏附于載玻片上，立即浸入固定液中－10分鐘，取出自然枯燥，低溫保存。優(yōu)點(diǎn)：簡便省時(shí)，細(xì)胞抗原保存較好。缺點(diǎn)：細(xì)胞分布不均重疊，影響標(biāo)記效果。．穿刺吸取涂片法應(yīng)用：實(shí)質(zhì)器官的病變區(qū)。方法：①穿刺液較少時(shí)直接涂片，力求均勻。②穿刺液較多時(shí)，穿刺液滴入1－2毫升HanksRPMI1640液〕內(nèi)，輕攪，500rpm離心－10分鐘，棄上清，制成細(xì)胞懸液〔2x106細(xì)胞/ml,吸一滴于載玻片上，輕涂，干后固定。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞均勻。缺點(diǎn)：細(xì)胞易變形。．體液沉淀涂片法①細(xì)胞數(shù)多，取一滴直接涂片。②細(xì)胞數(shù)少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm離心10分word文檔精品文檔分享鐘，棄上清，將沉淀涂片，略干后固定備用。．培養(yǎng)細(xì)胞①貼壁生長的細(xì)胞：將蓋玻片插入培養(yǎng)液中。②懸浮生長的細(xì)胞：可用離心涂片法制成涂片。．離心涂片機(jī)法5~6，1000r/min，2min，50~100l。細(xì)胞懸液210考前須知：①防止脫片,②為節(jié)省試劑及便于鏡下觀察和計(jì)數(shù)，將細(xì)胞集中到直徑5為宜。0.6-1.0cm圓圈內(nèi)，細(xì)胞總數(shù)以10③粘液豐富的標(biāo)本如胃液、痰液等未經(jīng)特殊處理，不宜作免疫組化。二．固定〔一〕免疫組化的固定法選擇最正確固定的標(biāo)準(zhǔn)最好的保存細(xì)胞和組織的形態(tài)構(gòu)造。最大限度的保存抗原的免疫活性。固定有：〔〕物理固定：血膜空氣快速枯燥，凍結(jié)枯燥?！病郴瘜W(xué)固定：固定方法1.浸潤法〔immersionmethod〕4－24小時(shí)。word文檔精品文檔分享2.灌流法(irrigationmethod)麻醉動(dòng)物，經(jīng)動(dòng)物左心室主動(dòng)脈插管，生理鹽水沖洗，注入固定液，組織在30分鐘內(nèi)取材?！捕持匾墓潭ㄒ海ブ行跃彌_福爾馬林雙功能交聯(lián)劑。使組織間相互交聯(lián)，保存抗原于原位。特點(diǎn)是對組織穿透性強(qiáng)，收縮性小，易使組織硬化而浸蠟困難。固定時(shí)間不宜過長。．4%多聚甲醛磷酸緩沖液適應(yīng)性較廣泛的固定液，固定時(shí)間不宜過長。．Bouin,s液對組織固定力強(qiáng)且較均勻。比單獨(dú)醛類固定更適合免疫組化染色，4C。．Zamboni,s液可用于光鏡、電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)觀察。采用2.5%多聚甲醛和30%飽和苦味酸，更可增加對組織的穿透力和固定效果，以保存更多的組織抗原。6~18小時(shí)。．丙酮用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的固定。固定較好，對組織穿透性很強(qiáng)，保存抗原的免疫活性較好，染色效果稍差。4C，5－10分鐘，枯燥后低溫保存。．％乙醇word文檔精品文檔分享用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定。固定效果差，可和其他試劑混合使用，染色較好。．AAF液：95-100%酒精85ml,冰醋酸5ml,濃甲醛〕〔三〕固定劑的選擇各種抗原的最正確固定劑的選擇見表。鑒于10%中性甲醛是國際最通用的固定劑，雖然它對保存Ig抗原方面較差，假設(shè)采用適宜的蛋白酶消化處理，進(jìn)一步暴露抗原，結(jié)合使用敏感的免疫組化方法，如PAPABC固定時(shí)間可適當(dāng)縮短至16-24小時(shí)。免疫球蛋白類抗原可選用含汞類的固定液，(如Zenker固定液)，或蛋白沉淀性固定液(如Bouin固定液，甲醛醋酸酒精固定液等)。扁桃體、淋巴結(jié)和骨髓還可用甲縮醛(formal-Saline)加2-10%醋酸，石蠟切片，能有效地保存Ig。腫瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA)對多種固定均穩(wěn)定。一般可用中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片〕激素類中的多肽類激素宜選用Bouin。組織之中酶和一些組織特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII凝血因子等)可用10%中性甲醛。待測抗原與固定液的關(guān)系抗原適用固定液word文檔精品文檔分享細(xì)胞外表抗原100%丙酮，95%乙醇，10%福爾馬林，Bouin液免疫球蛋白Zenker固定液,10%福爾馬林，95%乙醇，100%丙酮，酶，蛋白類10%福爾馬林，Bouin液，95%乙醇，100%丙酮肽類激素Bouin液，10%福爾馬林，固定液固醇類10%福爾馬林，Bouin液補(bǔ)體95%乙醇，100%丙酮，10%福爾馬林，Bouin液腫瘤胚胎抗原10%福爾馬林，〔四〕考前須知免疫組化固定方法的原那么是：在保持細(xì)胞形態(tài)完好和所測抗原的前提下，應(yīng)采用濃度最低的固定液和最短的固定時(shí)間。為此，固定組織時(shí)應(yīng)該：．組織新鮮，盡早、盡快固定。．組織塊盡量小(<220.4cm)。．固定液體積大于組織體積20倍以上。．固定后充分水洗，減少固定液造成的人為假象．針對抗原、染色法選擇最正確固定方法。三．包埋和切片法固定的和未經(jīng)固定的組織、細(xì)胞以及各種涂片和切片方法均可用于免疫組化，但其效果不同?！惨弧潮鶅銮衅瑆ord文檔精品文檔分享優(yōu)點(diǎn)：是能較好地保持抗原活性(尤其是外表抗原)和酶。冰凍切片簡便快速，省去固定、包埋和切片處理等一系列繁瑣步驟。不利于常規(guī)檢查和長期保存標(biāo)本，不如石蠟切片清晰。常用致冷切片和恒冷箱切片機(jī)(Cryostat)，以后者最正確，可制成4~6μm的薄片。組織切片可直接貼附于玻璃載片，或貼附于涂有明膠或histostik(商品粘附劑)的玻璃片上，以減少組織片脫落。為防止冷凍過程中冰晶形成，破壞組織構(gòu)造和保持抗原，取材后立即將標(biāo)本浸入深低溫預(yù)冷的(干冰容器內(nèi)，－70度)正已烷液內(nèi)驟冷30-60秒，取出后再冰凍切片。切片最好盡快進(jìn)展組化染色亦可吹干儲存于片盒內(nèi)，外包塑料袋，置于－20度低溫冰箱，一個(gè)月內(nèi)使用。置室溫枯燥105-10分(未固定者)，即可進(jìn)入染色程序。〔冰凍切片OCT包埋，置液氮液面上－20秒，低溫保存?！场捕呈炃衅话愫窦sμm，切片于37度烘烤過夜，可置4度保存。切片前，固定的組織塊需經(jīng)酒精逐級脫水，二甲苯透明，再浸蠟包埋。各步驟時(shí)間均不宜過長(1-2小時(shí))，以免組織變脆?！彩炃衅倜撍?、透明在4C進(jìn)展。②浸蠟、包埋時(shí)石蠟溫度低于600C〔三〕振動(dòng)切片可把新鮮組織〔不固定不冷凍，或低濃度固定液稍稍固定〕切成word文檔精品文檔分享20~100m厚，漂浮免疫組化染色，檢出陽性部位，后固定，常規(guī)電鏡樣品制備。適于免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)觀察?！菜摹乘芰习袂衅瑑?yōu)點(diǎn)是組織塊可同時(shí)用于光鏡切片、半薄切片〔0.5~1.5m〕和電鏡超薄切片。目前常用包埋塑料有兩大類：甲基丙烯酸鹽類和環(huán)氧樹脂類。前者能較好地保存抗原，染色前不必脫去包埋材料，但切片易皺折?！参濉吵∏衅d玻片及蓋玻片的處理和切片的附貼載玻片及蓋玻片的處理①載玻片：清洗液〔酸〕浸泡－24小時(shí)，水洗，％酒精浸泡2小時(shí)后擦干或烤干。②蓋玻片：清洗液浸泡2小時(shí)，或鹽酸酒精浸泡后水洗，95％酒精浸泡，擦干。切片的附貼免疫組化染色過程較長，并需用含外表活性劑的緩沖液屢次浸泡切片。有的石蠟切片染色前要用蛋白酶消化。新鮮組織如用灌注法或浸潤法固定后再作冰凍切片會失去粘附性。以上這些因素常常造成染色過程中切片的脫落。要防止這一問題的發(fā)生，常規(guī)的蛋白甘油附貼法已不符合要求。免疫組化染色中可選用的附貼劑。word文檔精品文檔分享(1)甘油—明膠：1%明膠100ml混勻，涂布載破片上，切片附貼后置多聚甲醛蒸氣(80度)甘油12ml中1小時(shí)麝香草酚數(shù)滴(2)甲醛—明膠：1%明膠5ml涂布載片上，切片附貼后置37度溫箱中1小時(shí)或過夜2%甲醛5ml(3)鉻明礬---明膠：1%明膠與0.1%鉻明礬(硫酸鉻鉀)等量混合后即可涂片。60C晾干。(4)多聚賴氨酸：Poly-L-Lysine0.5%多聚賴氨酸(MW>300，000)水溶液，涂布載片后，晾干或45C烤干，一周內(nèi)應(yīng)用。此溶液需冷凍貯藏。〔〕：3-AminopropyltriethoxysilaneAPES/丙酮〔1/50〕涂片晾干。〔〕APES和Poly-L-lysine〔PLL〕聯(lián)合應(yīng)用適于特別容易脫片的情況。第三章免疫細(xì)胞化學(xué)染色免疫細(xì)胞化學(xué)的類型根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)，可將免疫組化染色法分為以下幾種：(1)免疫熒光法(Immunofluorescencetechnique)(2)免疫酶法(Immunoperoxidasetechnique)(3)親合組織化學(xué)法〔affinityhistochemistry〕(4)免疫金銀法(Immunogoldtechnique)(5)其它：放射免疫法。此外，尚有根據(jù)染色及抗體滴加步驟，分類為直接法，間接法，橋法等。word文檔精品文檔分享一．免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法及原理〔一〕免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescencetechnique)1.免疫熒光直接法原理：優(yōu)點(diǎn)：簡單、省時(shí)、特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)：一種標(biāo)記抗體只能檢測一種抗原；敏感性差。2.免疫熒光間接法原理：word文檔精品文檔分享優(yōu)點(diǎn)：一種標(biāo)記抗體可用于多種一抗〔只要一抗是同種動(dòng)物產(chǎn)10倍左右。缺點(diǎn)：非特異性著色時(shí)機(jī)較多；染色時(shí)間長。3.雙重免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)本保存及封片介質(zhì)①及時(shí)照相，可－0C暗處保存。②緩沖甘油液〔PH8.5〕0.5mmol/lPH8.5碳酸鹽緩沖液19份混勻即用。熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求①載玻片光潔均勻，厚度，在0.8-1.2mm間，無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需石英玻璃載玻片。②蓋玻片光潔，厚度0.17mm左右。③切片不宜太厚。④暗視野熒光顯微鏡和油鏡觀察時(shí)，使用無熒光鏡油，或上述甘油及液體石蠟?！捕趁庖呙笜?biāo)技術(shù)(Immunoperoxidasetechnique)1.酶標(biāo)抗體法通過共價(jià)鍵將酶結(jié)合在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物，于顯微鏡下進(jìn)展細(xì)胞或組織外表或內(nèi)部某種抗原成分定位觀word文檔精品文檔分享察。HRP〔POD〕ALP直接法優(yōu)點(diǎn)：簡單、省時(shí)、特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)：一種標(biāo)記抗體只能檢測一種抗原；敏感性差。間接法優(yōu)點(diǎn)：與免疫熒光技術(shù)相比，此法終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察，切片可長久保存，反復(fù)觀察。word文檔精品文檔分享2.非標(biāo)記抗體酶法(1)酶橋法word文檔精品文檔分享優(yōu)點(diǎn)：提高了敏感性。(2)過氧化物酶—抗過氧化物酶法〔peroxidaseanti-peroxidasemethod,PAP法〕1970年，Sternbergerword文檔精品文檔分享優(yōu)點(diǎn)：敏感，適合于石蠟切片中微量抗原的檢測。缺點(diǎn)：步驟多，費(fèi)時(shí)，不適合臨床常規(guī)檢驗(yàn)。〔三〕親合組織化學(xué)〔affinityhistochemistry〕word文檔精品文檔分享1.抗生物素(親合素)—生物素—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(Avidin-Biotin.-PeroxidaseComplextechniqueABC法)根本原理：．鏈酶親合素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)〔StreptAvidin-Biotin-PeroxidaseComplex，SABC〕根本原理：鏈酶親合素是一種從鏈酶菌StreptomycesAvidinii培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，親和力高。是一種接近于更完美的生物素結(jié)合蛋白。生物素是一種水溶性維生素〔維生素H可以標(biāo)記抗體和酶而不影響其活性。鏈酶親合素同一定濃度的生物素化酶混合后，形成鏈酶親合素－生物素－酶復(fù)合物。這種復(fù)合物至少存在一個(gè)尚未被生物素占據(jù)的親和素結(jié)合位這種復(fù)合物即是SABC。word文檔精品文檔分享市售的試劑盒中SABC的A液和B液合二為一。SABC具有下述特點(diǎn)：．高敏感性。．低背景。．簡便快速。．結(jié)果穩(wěn)定。試劑盒分型濃縮型－過氧化物酶即用型－過氧化物酶：SABC濃縮型SABC－堿性磷酸酶(容易克制組織細(xì)胞中內(nèi)源性酶的干擾，尤其是血液、骨髓、胃腸等富含過氧化物酶的組織，應(yīng)用SABC－AP效果較好。)即用型－堿性磷酸酶SABC免疫組化雙重染色試劑盒：(同時(shí)采用SABC－POD和－AP試劑盒進(jìn)展免疫組化雙重染色。)．葡萄球菌蛋白A技術(shù)〔StaphylococalProteinA,SP〕．凝集素〔組織化學(xué)〕技術(shù)凝集素(lectin)無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)word文檔精品文檔分享物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅細(xì)胞而得名。種類很多，常用的為植物凝集素，如：花生凝集素(Peanutagglutinin)PNAD-半乳糖刀豆素A〔Concanavalinensifomisagglutinin〕ConAD-葡萄糖特點(diǎn)：1〕能識別糖蛋白和糖肽，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物構(gòu)造〔碳水化合物抗原決定簇〕2〕具有多價(jià)結(jié)合的能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金及鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡、電鏡水平顯示其結(jié)合部位。一般認(rèn)為，細(xì)胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細(xì)胞的類型及反映細(xì)胞在分化、成熟和細(xì)胞惡變中的變化。凝集素本身不是來源或參與免疫反響的產(chǎn)物，放此講授，是由于凝集素具有某些親合特性，能被免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)方法所應(yīng)用。word文檔精品文檔分享(四)免疫金銀法(Immunogoldtechnique)二．免疫組化染色的重要環(huán)節(jié)．選擇最正確的固定方法和制片方法．免疫組織化學(xué)中的對照實(shí)驗(yàn)由于影響免疫組化的因素甚多，染色中必須有陽性和陰性對照。①陽性對照片可選用其它組織標(biāo)本并行固定、包埋、染色，并且經(jīng)該抗體證實(shí)為中等陽性反響。②陰性對照片仍用上述一樣程序，證實(shí)其免疫反響為陰性。待檢標(biāo)本上滴加PBS以及同種非免疫動(dòng)物血清以代替第一抗體，用以檢查抗體的特異性。假設(shè)僅滴加第一抗體的標(biāo)本陽性，說明特異性高。免疫組化對照試驗(yàn)及判斷標(biāo)本號試驗(yàn)組陽性對照陰性對照替代抗體對照結(jié)論word文檔精品文檔分享1++－－受檢標(biāo)本含抗原2－+－－受檢標(biāo)本不含抗原3－－－－操作錯(cuò)誤4++++非特異性染色5++－+非特異性反響6+－－－陽性對照差注：①第一批抗血清做一次對照實(shí)驗(yàn)即可。②必須用連續(xù)切片普通染色組進(jìn)展對照。3.選擇抗體的最正確稀釋度最正確稀釋度可提高染色的陽性率，獲得染色的良好的對比?？贵w濃度過高。反而會減弱抗原抗體的結(jié)合，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果?？贵w稀釋的原那么是：①抗體的工作滴度(稀釋后的應(yīng)用濃度)高有助于減少污染蛋白的非特異著色，節(jié)省試劑。②選擇所測抗原著色最強(qiáng)、背景著色最弱的滴度。③根據(jù)抗體和待染標(biāo)本等具體情況，確定最正確工作滴度。④稀釋液中常用0.01MPBS，但不宜放過久。欲放置抗體長久，可用Tris緩沖液稀釋，或?qū)Ｓ每贵w稀釋液。直接測定法：其它條件穩(wěn)定，用于測定一抗最正確稀釋度。選擇抗體的最正確濃度一抗稀釋度特異性染色強(qiáng)度非特異性染色背景強(qiáng)度word文檔精品文檔分享1:50＋＋＋＋＋＋1:100＋＋＋＋1:200＋＋－陰性對照－－在1:100與1:200間如上找出最正確稀釋度。棋盤〔方陣〕測定法：欲測知二種以上抗體的免疫反響濃度，可測試比擬9X標(biāo)本的陽性反響和背景著色。從下表可知，應(yīng)采用1:20的第二抗體，并進(jìn)一步在1:50-1:100之間尋得第一抗體的最正確工作稀釋度?？贵w的最正確滴度測試表第二抗體第一抗體稀釋度1:501:1001:2001:20++++(++)++(－)+〔－〕1:40++〔－〕+〔－〕+〔－〕1:80+〔－〕+〔－〕+〔－〕注()內(nèi)為背景著色假設(shè)應(yīng)用三種以上抗體的染色法，如PAP法，ABC法，可按上表求得第二、第三抗體的最正確配伍滴度。之后可按商品說明選擇第一抗體滴度，或按優(yōu)選法求得高稀釋度，逐步縮小優(yōu)選X圍，選中最正確滴度。稀釋中，一般常微量加樣品。最常用者為10μl、20μl、50μl、μl、和μl?？贵w稀釋后應(yīng)充分混勻。．抗體的孵育時(shí)間word文檔精品文檔分享標(biāo)本染色比照度愈大。使用高滴度抗體，可將切片置于4度冰箱內(nèi)過夜(約18小時(shí)，以增強(qiáng)特異性著色而減少非特異染色，提高比照。為節(jié)省時(shí)間，加強(qiáng)反響亦可于室溫下孵育20分鐘，37度下孵育5-10分鐘。假設(shè)標(biāo)本中抗原很強(qiáng)，可適當(dāng)延長孵育時(shí)間。孵育應(yīng)在濕盒中進(jìn)展。．其它注意滴加抗體時(shí)應(yīng)適量。以抗體充分覆蓋組織片為準(zhǔn)，不可過多或過少。PBS洗滌抗體時(shí)應(yīng)充分，且應(yīng)防止使用同一PBS容器導(dǎo)致穿插反響。最終標(biāo)本顯色時(shí)，應(yīng)用光鏡控制和觀察最正確顯色反響和時(shí)—15著色為度。免疫細(xì)胞化學(xué)染色的考前須知①反響的pH值應(yīng)以接近體液環(huán)境為宜，即組織片與各種標(biāo)記抗體液應(yīng)處于同一酸堿度〔pH7.0-7.2〕②為防止非特異沉著和穿插反響，各標(biāo)記抗體液要在染色前經(jīng)離心去沉淀③要特別注意載玻片是否處于水平位置〔滴染時(shí)〕，確保染色液覆蓋整個(gè)切面。④染色反響要在保濕容器內(nèi)進(jìn)展，以防止染色液的蒸發(fā)干涸。⑤染色的抗原抗體反響要在37度或室溫下進(jìn)展。但對耐熱能力差的抗原，要在4度低溫下延長反響的時(shí)間。word文檔精品文檔分享四．免疫組化有關(guān)技術(shù)〔一〕抗體的保存C保存一年。稀釋后C保存－3天、7天后抗體的保存4效價(jià)顯著降低?！捕吃鰪?qiáng)特異性染色的方法．蛋白酶消化法①0.1％胰蛋白酶0C水浴。消化5－30分鐘。最常用。用前37②．4％胃蛋白酶37C消化5－30分鐘。．抗原修復(fù)高溫高壓組織抗原修復(fù)①適用X圍：大量常規(guī)福爾馬林固定石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，效果優(yōu)于微波法和直接煮沸法。②儀器設(shè)備：普通家用壓力鍋。③緩沖液：0.01M檸檬酸緩沖液，PH6.0。④方法：切片水化。緩沖液置于壓力鍋內(nèi)加熱至沸騰，放入切片，繼續(xù)加熱至噴汽〔扣閥至噴汽以－6－2分鐘后，壓力鍋離開熱源、1分鐘后，自來水淋壓力鍋至室溫，開蓋，取出切片，蒸餾水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。word文檔精品文檔分享⑤考前須知：用過的緩沖液棄去。加熱時(shí)間不宜太長，否那么背景加深。組織抗原微波修復(fù)②儀器設(shè)備：家用微波爐，進(jìn)口微波爐置“DEFROST〞檔。③方法：去除內(nèi)源性酶的切片置入盛有已煮沸緩沖液的耐熱容0C，持續(xù)8－10分鐘。取出容器至器中，繼續(xù)加熱至98－100室溫。蒸水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。④考前須知：不可將切片從緩沖液中取出冷卻。組織抗原直接煮沸修復(fù)②方法：切片水化。置入盛有已煮沸緩沖液的燒杯中繼續(xù)加熱10分鐘。參加蒸餾水補(bǔ)充水分損失。燒杯離開熱源，置流水槽內(nèi)冷卻至室溫。蒸水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。注：一般，對于不太熟悉的一抗染色石蠟切片時(shí)，應(yīng)比擬一下抗原修復(fù)、胰酶消化和不做預(yù)處理的染色效果。如果石蠟切片無法作出滿意的結(jié)果，那么應(yīng)考慮用冰凍切片。．適宜的抗體稀釋度抗體效價(jià)越高，工作液稀釋度越高?？贵w稀釋度越大，孵word文檔精品文檔分享育時(shí)間越長。只有高稀釋度時(shí)才能防止非特異性背景產(chǎn)生。盡量使用單克隆抗體〔MAB．孵育時(shí)間37C，30－60分鐘。40C過夜〔約18小時(shí)〕或室溫。．去污劑0.01-0.1%皂素，或0.04-0.2%TritonX-100處理切片，去除脂類，促進(jìn)抗體進(jìn)入細(xì)胞中。但是濃度過高會破壞細(xì)胞抗原和細(xì)胞膜構(gòu)造。．顯色增敏劑過氧化物酶底物中參加氯化鎳、0.1N異吡唑、氯化銨、硫酸鎳銨等可增強(qiáng)顯色敏感度。〔三〕非特異染色和內(nèi)源性過氧化物酶的消除法在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中，常在非抗原部位出現(xiàn)陽性反響〔非抗原抗體反響出現(xiàn)的陽性反響〕，稱為非特異性染色，致背景著色過深。非特異性染色，背風(fēng)光過深其可能原因有：．粘片劑使用不當(dāng)。．固定(如可因液中殘存的游離醛基所引起)．切片或涂片太厚。．脫蠟不徹底。．未用酶消化處理切片或進(jìn)展抗原修復(fù)。word文檔精品文檔分享．內(nèi)源性酶未阻斷。．標(biāo)記抗體、I抗的不純；抗體濃度過高，抗體的稀釋度不夠，反響后沖洗不充分。．血清封閉不夠或血清溶血。．洗滌不徹底。10．底物呈色時(shí)間過久。11造成。去除非特異染色的方法：．血清封閉加一抗前，用與二抗同種動(dòng)物非免疫血清封閉組織上帶電荷基團(tuán)，去除其與一抗的非特異性結(jié)合。必要時(shí)參加2－％牛血清白蛋白。也可用除制備一抗以外其他動(dòng)物非免疫血清。室溫或37度，30分鐘。．緩沖液洗滌用緩沖液參加0.9%NaCL成為高鹽溶液，充分洗滌切片。．盡可能高地稀釋一抗。在組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞含有較多的內(nèi)源性過氧化物酶，word文檔精品文檔分享其它細(xì)胞和組織中也有少量。為此，實(shí)驗(yàn)中設(shè)法消除或抑制內(nèi)源性過氧化物酶。去除內(nèi)源性過氧化物酶的常用方法：3％HO2蒸餾水或PBS，或％H2O2甲醇，室溫30min處理切片。去除內(nèi)源性生物素的常用方法：生物素是一種輔酶，是在脫羧基酶、羧基轉(zhuǎn)換酶等催化的代謝環(huán)節(jié)中所產(chǎn)生的羧基的中間載體，它存在于某些組織和細(xì)胞內(nèi)，在應(yīng)用ABC法，LSAB法，SP法SABC法染色時(shí)會與抗生物素結(jié)合而產(chǎn)生非特異性染色。和肝、腎、腦等組織的石蠟切片，在應(yīng)用上述染色方法前應(yīng)預(yù)先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分別作用20min除內(nèi)源性抗生物素結(jié)合活性，每次作用后用PBS洗5min3次。內(nèi)源性生物素封閉試劑：AvidinBiotinBlockingReagent(ABB)(市售)〔四〕顯色時(shí)間的控制①著色太深可減少反響時(shí)間。②過氧化物酶顯色時(shí)，HO2濃度較大使顯色反響過快而致背景加深，過量H2O2又抑制酶的活性，故HO2濃度要適中。五。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果判定陽性細(xì)胞①陽性細(xì)胞染色分布類型：word文檔精品文檔分享胞漿細(xì)胞核細(xì)胞膜word文檔精品文檔分享②陽性細(xì)胞分布呈現(xiàn)灶性彌漫性。③陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度不一。假設(shè)細(xì)胞間染色強(qiáng)度一樣，常常提示為非特異性反響。④陽性反響定位于細(xì)胞，且與陰性細(xì)胞相互交雜分布。而非特異性反響常常不限于單個(gè)細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞。word文檔精品文檔分享⑤切片邊緣、刀痕、皺折處或壞死擠壓的細(xì)胞區(qū)、膠原結(jié)締組但不能用于判斷陽性。染色失敗的原因假陰性①固定方法不對，抗原在石蠟切片中遭到破壞，尤其是不標(biāo)準(zhǔn)的石蠟標(biāo)本。②未加一抗，或一抗與試劑盒中二抗不配對，或抗體失效，或抗體的濃度過低。③抗體孵育時(shí)間太短。④染色過程中切片枯燥，或未嚴(yán)格按照步驟操作如抗原修復(fù)和消化等預(yù)處理不當(dāng)。⑤酶底物中HO2量少或失效。⑥復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)。假陽性①粘片劑太厚。②局部多克隆抗體特異