細(xì)胞內(nèi)化學(xué)組分測

細(xì)胞內(nèi)化學(xué)組分測第一頁，共47頁。流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）流式細(xì)胞技術(shù)（FlowCytometry,FCM）是利用流式細(xì)胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細(xì)胞生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技技術(shù)。第二頁，共47頁。流式細(xì)胞計(jì)基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞計(jì)主要由四部分組成。它們是：流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)。第三頁，共47頁。原理待測樣品(如細(xì)胞、染色體、精子或細(xì)菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進(jìn)樣管而進(jìn)入流動室，排成單列的細(xì)胞，由流動室的噴嘴噴出而成為細(xì)胞液流，并與入射激光束相交。細(xì)胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細(xì)胞液流成90°處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長。熒光檢測器為光電倍增管。散射光檢測器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細(xì)胞大小有關(guān)。第四頁，共47頁。第五頁，共47頁。激光光源第六頁，共47頁。光收集系統(tǒng)：濾光片第七頁，共47頁。光收集系統(tǒng)：光電倍增管第八頁，共47頁。液流系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng)第九頁，共47頁。細(xì)胞分選系統(tǒng)第十頁，共47頁。第十一頁，共47頁。FACSVantageDiva科研型（大型機(jī)）第十二頁，共47頁。應(yīng)用舉例流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及臨床腫瘤學(xué)、臨床血液學(xué)等諸多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用：第十三頁，共47頁。1.在細(xì)胞生物學(xué)方面的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)是FCM應(yīng)用最廣泛也是最基本的領(lǐng)域，細(xì)胞周期分析是其基本分析內(nèi)容之一，而實(shí)施的技術(shù)途徑是通過測定細(xì)胞周期各時相的DNA含量來達(dá)到的。第十四頁，共47頁。2．在免疫學(xué)方面的應(yīng)用：FCM以它的快速、靈活及定量的特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的各個方面，尤其是結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測、機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分?；诿庖呒夹g(shù)是免疫細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)的基礎(chǔ)，我們著重介紹FCM在免疫應(yīng)用中的技術(shù)問題。第十五頁，共47頁。3.在遺傳學(xué)研究的應(yīng)用：用流式細(xì)胞術(shù)測定染色體DNA含量,可得到染色體頻率分布圖，稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術(shù)不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的DNA文庫，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。第十六頁，共47頁。4．在腫瘤學(xué)研究的應(yīng)用：腫瘤細(xì)胞一般都含有異常數(shù)量的DNA。在大多數(shù)實(shí)體瘤和急性白血病中都發(fā)現(xiàn)有非整倍體的細(xì)胞，由于流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法簡單，測定結(jié)果精確，能快速得到有關(guān)DNA倍性的信息,因而能提供有價值的診斷數(shù)據(jù)。如果在測量DNA含量的同時，再測定其他參數(shù)（如不同類型的中等纖維蛋白，蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞大小、核質(zhì)比等）則可進(jìn)一步提高診斷的可靠性。。第十七頁，共47頁。此外，流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域中也得到廣泛的應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)正在向高靈敏、高速度、多參數(shù)測量、獲取形態(tài)學(xué)信息等方面發(fā)展。第十八頁，共47頁。第十九頁，共47頁。放射自顯影技術(shù)放射自顯影技術(shù)是利用感光材料的感光特性，使之感受放射性核素的涉嫌后，通過顯影和定影而得到和標(biāo)本中偶那個放射性示蹤劑所在部位、強(qiáng)度完全一致的銀粒影像的技術(shù)，所得到的圖像稱之為放射自顯影影像。第二十頁，共47頁。原理將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標(biāo)記上放射性的化合物進(jìn)行定位或相對定量測定。第二十一頁，共47頁。1.發(fā)射電子：核乳膠被發(fā)射源帶電粒子作用負(fù)電的鹵素離子中釋放電子AgBr+βAg++Br-+e-第二十二頁，共47頁。離子對形成：當(dāng)電離離子通過溴化銀晶體時形成許多離子對第二十三頁，共47頁。3.銀原子形成：溴離子所發(fā)出的電子被帶正電的銀離子所俘獲。e-+Ag+Ag第二十四頁，共47頁。4.潛影形成：俘獲電子的過程，是還原過程，很多帶正電的銀原子被還原，在溴化銀分子中形成潛影。第二十五頁，共47頁。5.顯影、定影形成：顯影：是形成潛影的鹵化銀晶體在顯影過程中被還原成銀鹽顆粒，顯出影像定影：未形成潛影的晶體通過定影而溶解第二十六頁，共47頁。第二十七頁，共47頁。

放射自顯影成像圖片第二十八頁，共47頁。用途放射自顯影術(shù)（radioautography）用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。第二十九頁，共47頁。應(yīng)用舉例

研究藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、毒物在器官、組織、細(xì)胞中的分布、運(yùn)轉(zhuǎn)，以及分析其合成、更新、蓄積作用機(jī)理等。研究特異性標(biāo)記前體（如胸腺嘧啶核苷酸DNA前體）的滲入部位、特點(diǎn)、影響因素等，探討生物活性分子代謝部位機(jī)理。標(biāo)記抗體或藥物在離體那個同位素標(biāo)記。標(biāo)本上顯示抗原或抗體位置，祚定位示蹤。用于核算中堿基程序的檢測—原位雜交時其探針用同位素標(biāo)記。第三十頁，共47頁。特點(diǎn)

定位精確，靈敏度高，分辨率好，能保存相當(dāng)長時間；操作簡便，無需復(fù)雜設(shè)備；可供定量研究和雙同位素示蹤；將形態(tài)、機(jī)能和代謝地研究統(tǒng)一起來；研究某些大分子在體內(nèi)地動態(tài)變化過程。第三十一頁，共47頁。免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)是用顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)技術(shù)。第三十二頁，共47頁。原理先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。第三十三頁，共47頁。常用免疫組織化學(xué)方法的原理

1、免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用比較廣。第三十四頁，共47頁。常用免疫組織化學(xué)方法的原理2、免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)?；驹硎窍纫悦笜?biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對比度好，染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。第三十五頁，共47頁。常用免疫組織化學(xué)方法的原理3、免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。第三十六頁，共47頁。第三十七頁，共47頁。

免疫組織化學(xué)技術(shù)照片第三十八頁，共47頁。用途組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測。

第三十九頁，共47頁。應(yīng)用舉例1確定細(xì)胞類型

通過特定抗體標(biāo)記出細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原成分，以確定細(xì)胞類型。如角蛋白是上皮性標(biāo)記，前列腺特異性抗原僅見于前列腺上皮，甲狀腺球蛋白抗體是甲狀腺濾泡型癌的敏感標(biāo)記，而降鈣素抗體是甲狀腺髓樣癌的特有標(biāo)記。有些細(xì)胞（如表皮內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、淋巴結(jié)內(nèi)指突狀和樹突狀網(wǎng)織細(xì)胞）光鏡下不易辨認(rèn)，但免疫組化標(biāo)記（S-100蛋白等）能清楚顯示其形態(tài)。

2辨認(rèn)細(xì)胞產(chǎn)物

利用某些細(xì)胞產(chǎn)物為抗原制備的抗體，可作為相應(yīng)產(chǎn)物的特殊標(biāo)記，如內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的各種激素，大多數(shù)可用免疫組化技術(shù)標(biāo)記出來，據(jù)此可對內(nèi)分泌腫瘤作功能分類，檢測分泌異位激素的腫瘤等。

第四十頁，共47頁。3了解分化程度

大多數(shù)標(biāo)記物都有其特定的分布部位，如上皮細(xì)胞膜抗原（EMA）著色部位在細(xì)胞膜上，但差分化乳癌胞漿內(nèi)也可出現(xiàn)陽性顆粒；角蛋白的含量也與分化程度有關(guān)，低分化或未分化癌含量較低、染色較弱。

4鑒定病變性質(zhì)

通過標(biāo)記Ig輕鏈（κ、λ）可區(qū)分部分B細(xì)胞性淋巴瘤與B細(xì)胞反應(yīng)性增生，前者常表達(dá)單一的Ig輕鏈（κ+/λ+），后者常為多克隆Ig輕鏈（κ+、λ+）。而標(biāo)記bcl-2蛋白在區(qū)別濾泡型淋巴瘤和反應(yīng)性濾泡增生上有相當(dāng)?shù)囊饬x。在濾泡型淋巴瘤，90%以上腫瘤性濾泡細(xì)胞有bcl-2的高表達(dá)；而在濾泡反應(yīng)性增生時，濾泡反應(yīng)中心的細(xì)胞不表達(dá)bcl-2蛋白，而套細(xì)胞則表達(dá)。

第四十一頁，共47頁。5發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶

某些癌的早期轉(zhuǎn)移有時與淋巴結(jié)內(nèi)竇性組織細(xì)胞增生不易區(qū)別。用常規(guī)病理組織學(xué)方法要在一個組織中認(rèn)出單個轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞或幾個細(xì)胞是不可能的，而采用免疫組化方法（如用上皮性標(biāo)志）則十分有助于微?。ò┺D(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)。對轉(zhuǎn)移性腫瘤也可借助免疫組化標(biāo)志尋找原發(fā)瘤，如骨組織內(nèi)有前列腺特異性抗原陽性細(xì)胞，提示前列腺癌轉(zhuǎn)移。

第四十二頁，共47頁。6探討腫瘤起源或分化表型

一些來源不明的腫瘤長期爭論不休，最后通過免疫組化標(biāo)記取得共識。如顆粒性肌母細(xì)胞瘤，曾被認(rèn)為是肌源性的，但該腫瘤肌源性標(biāo)記陰性，而神經(jīng)性標(biāo)記陽性，證明為神經(jīng)來源（可能來自神經(jīng)鞘細(xì)胞）。分化很差的腫瘤病理上常按細(xì)胞形態(tài)分為梭形細(xì)胞腫瘤、小圓細(xì)胞腫瘤等，通過多種標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用，也可能確定其來源。

第四十三頁，共47頁。7確定腫瘤分期

判斷腫瘤是原位還是浸潤及有無血管、淋巴管侵襲與腫瘤分期密切相關(guān)。用常規(guī)病理方法判斷有時是十分困難的，但用免疫組化法可獲得明確結(jié)果。如采用層粘連蛋白和Ⅳ型膠原的單克隆抗體可清楚顯示基底膜的主要成分，一旦證實(shí)上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸潤癌了，其預(yù)后是不同的。用第八因子相關(guān)蛋白、荊豆凝集素等顯示血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物則可清楚顯示腫瘤對血管或淋巴管的浸潤。對許多腫瘤的良惡性鑒別及有無血管或淋巴管浸潤，這是主要的鑒別依據(jù)，同時也有治療及預(yù)后意義。第四十四頁，共47頁。特點(diǎn)1、特異性強(qiáng)

免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫