生化分析攜帶污染的發(fā)現(xiàn)與排除課件

攜帶污染的來源測試項目A試劑針，比色杯等試劑成分殘留干擾下一個測試項目B引起攜帶污染的原因原因一

生化儀的發(fā)展變化：①、多項目，多樣本處理，②、處理能力的提高（高速化）共有化：①、樣本針，試劑針；②、比色杯；③、攪拌棒攜帶污染原因二生化儀狀態(tài)不良，使用不當：①、清洗力的低下（日常維護欠缺，儀器老化）②、生化儀內(nèi)污垢的積聚③、測試順序安排不當常規(guī)清洗不能有效的消除污染攜帶污染主要內(nèi)容1試劑針攜帶污染2樣本針攜帶污染3比色杯攜帶污染4攪拌棒攜帶污染5攜帶污染的消除一、試劑針攜帶污染原因一全自動生化分析儀一般采用雙試劑針，即所有項目的一試劑都共用試劑針R1，所有項目的二試劑都共用試劑針R2。試劑針R1或R2在每吸取一次試劑后都會進行一次清洗，之后會立即吸取下一個項目的試劑。當自身清洗能力下降，試劑針在吸取試劑時會將部分殘留的前項目試劑成分帶入到后項目反應杯中，對后項目的檢測結(jié)果造成影響。

原因二從各個項目設(shè)置的參數(shù)可知，試劑體積量遠大于樣本體積量。因此試劑針攜帶污染影響程度會高于樣本針攜帶污染。

試劑針攜帶污染的類型1、試劑成分間的直接影響試劑中含有下一個檢測所要測定的底物，或是含有的某種試劑成分與下一反應的底物有作用，因而直接干擾下一反應的測定結(jié)果。2、試劑成分間的間接影響前一個測定試劑與后一個測定試劑反應原理相近，或者都會通過相同的中間產(chǎn)物。該試劑所引導的反應對下一個項目的反應進程帶來間接的干擾，因為在有試劑污染的情況下，下一個測試所測定的是前后兩個項目反應的綜合作用結(jié)果。

部分常用試劑間可能產(chǎn)生的干擾如下：1.pH值改變：試劑中反應緩沖液之間因儀器攜帶污染而使下一反應的pH值改變，使下一反應達不到最佳狀態(tài)。如雙縮脲法測血清總蛋白，若其他條件相同，反應在堿性(pH值8-9)條件時，蛋白肽鍵（—CONH）才都能與堿性銅溶液作用生成紫色反應，完全測出血清蛋白的總量。若pH＜8時，總蛋白測定結(jié)果偏低，直接影響球蛋白、白蛋白/球蛋白的結(jié)果。酶活力測定在最適pH值時，反應最快，靈敏度最高，但是因為緩沖能力有限，可因攜帶污染使酶促反應出現(xiàn)無效值。大多數(shù)酶反應pH值在6.0-7.5之間；ALP、γ-GT、LDH須在堿性條件下最適宜。

2.TG、T-CH、UA、MG試劑中含有膽酸鹽，對循環(huán)酶法測定膽汁酸能產(chǎn)生嚴重干擾。3.ALT（IFCC）、AST（IFCC）試劑中含有高活力LD成分，有可能會對LD的測定帶來干擾。4.CK（NAC-activated）、CK-MB（NAC-activated）試劑中含有Glu成分，其分析方法的原理中包含Glu的已糖激酶(HK)反應過程，因此可能對Glu測定帶來干擾，尤其對Glu的HK法測定可能帶來嚴重干擾。

5.Glu(HK)、CK（NAC-activated）、CK-MB（NAC-activated）、TG、HDL-C、LDL-C(直接法)等試劑中使用了鎂鹽，可能會對其后的Mg2+測定帶來干擾；TP試劑中高濃度的Cu2+對Mg2+測定也會產(chǎn)生干擾。6.ChE(Butyrylthiocholine)、TC(ChOD-PAP)、Glu(GOD-PAP)、UA(Uricase)、α-HBDH(DGKC)等試劑使用磷酸緩沖液，可能會對無機磷的測定帶來干擾。

7.Mg2+試劑(Calmagite)中含有EDTA成分，為Ca2+絡合劑，可能對Ca2+的測定帶來干擾。8.CK檢測不應在ALP、Ca檢測之前，因CK反應液中加入EDTA-Na，能抑制ALP活性，結(jié)合Ca而使結(jié)果偏低。9.BUN酶法測定因谷氨酸脫氫酶（GLDH）消耗NADH，不能放在底物NADH如ALT、AST項目前檢測。

試劑針攜帶污染排查和發(fā)現(xiàn)1、思路目前絕大部分實驗室開展的生化檢測項目至少都在20項以上，評價全部項目之間的攜帶污染會非常耗時，并且試劑成本消耗量大。且不同儀器的動作原理不完全相同，設(shè)計一個較為簡單、合理的實驗方法是需要重點考慮的內(nèi)容。

2、原理通過設(shè)置特定的標本檢測順序，每個樣本只做一個項目的檢測，可以控制不同項目的先后吸取順序，實現(xiàn)任何一個項目都能與其他項目相遇。為了有效評價項目之間攜帶污染影響程度，污染實驗所用的病人樣本的混合血清應盡量包含醫(yī)學決定水平濃度。

試劑針攜帶污染實驗方法一1、攜帶污染初實驗

假設(shè)本次實驗以A、B、C、D、E五個項目來考察各個項目之間的試劑針攜帶污染。先在生化儀中輸入樣本測試號碼和選擇項目，每個樣本號碼只選擇一個項目，目的是使試劑針吸取項目的順序完全按照樣本測試號碼的選后順序進行，五個項目的測試順序表見表1。測試完成后，將數(shù)據(jù)輸入到處理表格2和表格3中，按照判斷標準，尋找可能存在的污染項目組合。

測試順序號123456789101112測試項目AAAAABACADAE測試順序號131415161718192021222324測試項目ABBBBBCBDBEB測試順序號252627282930313233343536測試項目CCCCCDCECDDD測試順序號373839404142434445測試項目DDEDEEEEE表1測試項目數(shù)為5時測試順序安排表表2各項目單獨測試5次時測試結(jié)果列表，數(shù)字代表對應檢測項目的測試結(jié)果測試次數(shù)ABCDE11142534412215263542331627364344172837445518293845平均值A(chǔ)vBvCvDvEv表3項目之間交叉列表縱向代表施污染項目橫向代表受污染項目ABCDEA6(A→B)8(A→C)10(A→D)12(A→E)6/Bv*100%8/Cv*100%10/Dv*100%12/Ev*100%B7(B→A)19(B→C)21(B→D)23(B→E)7/Av*100%19/Cv*100%21/Dv*100%23/Ev*100%C9(C→A)20(C→B)30(C→D)32(C→E)9/Av*100%20/Bv*100%30/Dv*100%31/Ev*100%D11(D→A)22(D→B)31(D→C)39(D→E)11/Av*100%22/Bv*100%31/Cv*100%39/Ev*100%E13(E→A)24(E→B)33(E→C)40(E→D)13/Av*100%24/Bv*100%33/Cv*100%40/Dv*100%攜帶污染實驗結(jié)果分析表3中顯示了試劑之間攜帶污染初實驗后的結(jié)果：◆將表格內(nèi)測試順序號代表的位置處輸入該項目對應的測試結(jié)果；◆對每個測試順序號下面對應的測試結(jié)果和該項目單獨5次重復結(jié)果的均值相比；◆比值以百分比形式表示，通過觀察百分比的大小來初步判斷攜帶污染的可能性。目前的判斷標準以正負百分之五作為判斷標準，超過范圍時懷疑有攜帶污染。

2、確認實驗◆由攜帶污染初實驗篩選出懷疑有污染的項目組合，假設(shè)（A→B）同（D→E）◆即A項目對B項目（A項目做好后緊接著做B項目），D項目對E項目（D項目做好后緊接著做E項目）懷疑有污染◆由于初實驗的項目交叉結(jié)果只是一次測試的結(jié)果，可能有偶然因素，還必須進行確認實驗。

確認實驗◆以（A→B）為例，（D→E）的情況相同◆先單獨做A項目，緊接著連續(xù)測試3次B項目，第一個B項目的結(jié)果受A項目影響最大，第三個B項目的結(jié)果因為有2次自身沖洗，結(jié)果比較準確。比較第一個B項目檢測結(jié)果同第三個B項目檢測結(jié)果，如果影響百分比同初實驗結(jié)果影響趨勢和程度相近，可以判斷A項目對B項目有攜帶污染。

確認實驗AB1B2B3DE1E2E3表4攜帶污染確認實驗

施污染項目AD受污染項目BE測試值1B1E1測試值2B2E2測試值3B3E3測試值1/測試值3*100%B1/B3*100%E1/E3*100%試劑針攜帶污染實驗方法二1、攜帶污染初實驗

假設(shè)本次實驗以A、B、C、D、E五個項目來考察各個項目之間的試劑針攜帶污染。先在生化儀中輸入樣本測試號碼和選擇項目，每個樣本號碼只選擇一個項目，目的是使試劑針吸取項目的順序完全按照樣本測試號碼的選后順序進行，五個項目的測試順序表見表1。測試完成后，將數(shù)據(jù)輸入到處理表格2和表格3中，按照判斷標準，尋找可能存在的污染項目組合。

測試順序號123456789101112測試項目AAAAABACADAE測試順序號131415161718192021222324測試項目AAAAABBBBBCB測試順序號252627282930313233343536測試項目DBEBBBBBCCCC測試順序號373839404142434445464748測試項目CDCECCCCCDDD測試順序號495051525354555657585960測試項目DDEDDDDDEEEE測試順序號616263646566測試項目EEEEEE表1測試項目數(shù)為5時測試順序安排表表2各項目測試10次時測試結(jié)果列表，數(shù)字代表對應檢測項目的測試結(jié)果測試次數(shù)ABCDE1118334657221934475833203548594421364960552237506161328415262714294253638153043546491631445565101732455666平均值A(chǔ)vBvCvDvEv平均值±3SDAv±3SDBv±3SDCv±3SDDv±3SDEv±3SD表3項目之間交叉列表縱向代表施污染項目橫向代表受污染項目ABCDEA6(A→B)8(A→C)10(A→D)12(A→E)B7(B→A)23(B→C)25(B→D)27(B→E)C9(C→A)24(C→B)38(C→D)40(C→E)D11(D→A)26(D→B)39(D→C)51(D→E)E13(E→A)28(E→B)41(E→C)52(E→D)實驗結(jié)果分析(方法二)◆各項目的均值如表2，計算10次測試結(jié)果的均值，并計算SD值◆表3中顯示了試劑之間攜帶污染初實驗后的初步結(jié)果：a將表格內(nèi)測試順序號代表的位置處輸入該項目對應的測試結(jié)果；b以（A→B）A項目對B項目為例，縱向施污染項目A對橫向受污染項目B的交叉，對應測試序號6號，項目B的結(jié)果同B項目的（均值±3SD）比較，在范圍內(nèi)認為沒有影響，不在范圍內(nèi)，則初步判斷有攜帶污染。

2、確認實驗◆由攜帶污染初實驗篩選出懷疑有污染的項目組合，假設(shè)（A→B）同（D→E）◆即A項目對B項目（A項目做好后緊接著做B項目），D項目對E項目（D項目做好后緊接著做E項目）懷疑有污染◆由于初實驗的項目交叉結(jié)果只是一次測試的結(jié)果，可能有偶然因素，還必須進行確認實驗。

確認實驗◆以（A→B）為例，（D→E）的情況相同◆先單獨做A項目，緊接著連續(xù)測試3次B項目，第一個B項目的結(jié)果受A項目影響最大，第三個B項目的結(jié)果因為有2次自身沖洗，結(jié)果比較準確。比較第一個B項目檢測結(jié)果是否在B項目（均值±3SD）以內(nèi)，如果影響程度和初實驗結(jié)果相近，可以判斷A項目對B項目有攜帶污染。

確認實驗AB1B2B3DE1E2E3表4攜帶污染確認實驗

施污染項目AD受污染項目BE測試值1B1E1測試值2B2E2測試值3B3E3二、樣本針攜帶污染方案一：方法：同一檢測項目濃度相差較大的A標本（高濃度），B標本（低濃度）。檢測順序：a1、a2、b1、b2、b3

計算：Q=（b1-b3）/（a2-b3）*100%

評價：以Q小于10%為判斷標準。

局限性：結(jié)果與選擇的標本濃度有關(guān)系例1：選擇高濃度的ALT樣本濃度值為2020U/L，低濃度ALT樣本第一次檢測結(jié)果為40U/L，第三次檢測結(jié)果為20U/L。通過計算攜帶污染率：Q=(40-20)/2000*100%=1%。

例2：選擇高濃度的Cl樣本濃度值為140mm/L，低濃度Cl樣本第一次檢測結(jié)果為86mm/L，第三次檢測結(jié)果為80mm/L。通過計算攜帶污染率：Q=(86-80)/60*100%=10%。上例中，例1的攜帶污染率只有1%，由于結(jié)果正好在醫(yī)學決定水平附近，因此對臨床判斷有較大影響。例2的攜帶污染率盡管達到了10%，但是對臨床判斷不會產(chǎn)生大的影響。因此，使用該方法評價樣本針攜帶污染需考慮樣本的實際濃度。

方案二：方法：收集高濃度樣本H和低濃度樣本L，將高濃度樣本H等體積分成10個高濃度樣本；另將低濃度樣本L等體積分成11個低濃度樣本，總共得到21個樣本。檢測順序：3L2H1L2H4L2H1L2H1L2H1L(注：順序前的數(shù)字代表測試次數(shù)，如3L代表連續(xù)測試3個低值樣本)

定義：L-L值為緊跟在低值標本后低值標本的結(jié)果

H-L值為緊跟在高值標本后低值標本的結(jié)果

攜帶污染指標：=（H-L）結(jié)果的平均值

減

（L-L）結(jié)果的平均值判斷標準：攜帶污染指標小于3SDSD是（L-L）結(jié)果的SD值

應用舉例某次實驗結(jié)果如下樣本結(jié)果L-LH-LL130L22828L32929H11205H21210L44545H31201H41218L54343L63131L73232L83232H51224H61204L94242H71221H81218L104747H91209H101217L114040Mean29.843.4SD1.482.70結(jié)果分析：H-L均值43.4L-L均值29.8攜帶污染指標=13.63SD=4.44攜帶污染指標>3SD樣本針存在攜帶污染三、比色杯攜帶污染

以日立7600P模塊為例：P模塊生化分析儀有160個比色杯，根據(jù)P模塊的分析流程，進入開始狀態(tài)，儀器機械部分進行復位后，開始清洗比色杯，之后進入加樣狀態(tài)，首先從1號樣本杯進行加樣，之后按照固定規(guī)律進行加樣。比色杯污染實驗利用比色杯重復使用的特點，即第1個測試和第161個測試的比色杯是同一個比色杯的特點，現(xiàn)在第一圈測試施污染項目，在第二圈即161號測試開始，輸入受污染項目。Mg2+(來自AMYKit)Mg2+(來自樣本)比色杯污染AMY測定Mg2+測定Mg2+來自AMYKit的Mg2+在比色杯中殘留產(chǎn)生正誤差比色杯污染實驗方法以項目A對B、C、D、E4個項目比色杯污染（項目輸入順序）

順序號檢測項目順序號檢測項目1A161B(A→B)2A162B(A→B)3A163B(A→B)4A164B(A→B)5A165C(A→C)6A166C(A→C)7A167C(A→C)8A168C(A→C)9A169D(A→D)10A170D(A→D)11A171D(A→D)12A172D(A→D)順序號檢測項目順序號檢測項目13A173E(A→E)14A174E(A→E)15A175E(A→E)16A176E(A→E)17B177B18B178B19B179B20B180B21C181C22C182C23C183C24C184C

順序號檢測項目順序號檢測項目25D185D26D186D27D187D28D188D29E189E30E190E31E191E32E192E…Water…Water…Water160WaterWater代表可用一個項目試劑盒裝入蒸餾水，按照測試順序填滿第一圈結(jié)果分析各項目比色杯不受影響時測試結(jié)果

測試次數(shù)BCDE118222630219232731320242832417818218619051791831871916180184188192平均值BvCvDvEv結(jié)果分析各項目受A項目比色杯影響時測試結(jié)果

測試次數(shù)BCDE1161165169173216216617017431631671711754164168172176平均值BvACvADvAEvA影響率BvA/Bv*100%CvA/Cv*100%DvA/Dv*100%EvA/Ev*100%四、攪拌棒攜帶污染