微生物學實驗指導書模板

微生物學實驗指導書資料內(nèi)容僅供參考，如有不當或者侵權，請聯(lián)系本人改正或者刪除。微生物學實驗指導書生物技術教學部初立業(yè)編重慶郵電學院生物信息學院12月30日前言一、本課程的性質(zhì)和任務微生物學實驗是生物學重要的基礎課之一,特別是隨著分子生物學的發(fā)展與拓寬,微生物學方法與技術顯得尤為重要。另外,醫(yī)學、農(nóng)學、林學等學科,甚至地質(zhì)學、太空學等也需微生物的方法與技術。因此,熟悉掌握微生物學方法與技術,對其它很多學科的發(fā)展有直接的影響。無菌操作技能和無菌概念的建立是微生物學實驗中最重要的內(nèi)容,微生物學實驗課主要任務是使學生掌握研究與應用微生物的主要方法與技術,包括經(jīng)典的、常規(guī)的、以及現(xiàn)代的方法與技術,使學生具有適應于從事相關學科的基礎理論研究與實際生產(chǎn)應用的微生物學實驗技能。

與微生物學基礎理論課緊密結合,使學生將理性知識與感性認識有機地結合,將書本知識用于實驗,在實驗中更深地理解基礎理論,提高學生的綜合能力與創(chuàng)新意識。提高學生分析問題和解決問題的能力。根據(jù)本學科的特點,逐步使學生認識微生物的基本特性,比較它們與其它生物的相似和不同之處,知道如何研究微生物以及對研究中所出現(xiàn)的問題點樣分析,并加以解決。二、教學要求與教學方法教學要求1)

注重微生物學基礎實驗技能的掌握與提高,克服盲目追求新穎而忽視基礎的傾向;2)

實驗課前要預習,明確每次實驗的目的與基本步驟;在實驗中要有嚴緊的科學態(tài)度,尊重事實與實驗結果,要善于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象;樹立密切合作的風氣,包括學生與老師、班與班、組與組、組長與組員之間的密配合。教學方法1)

以學生自己動手為主,老師在適當時間予以提示;2)

對實驗中所出現(xiàn)的一些現(xiàn)象多向?qū)W生提出問題,使它們學會分析結果,并與理論知識有機結合;3)根據(jù)實驗的進行程度,引導學生更深入思考,逐步樹立她們的創(chuàng)新意思;4)嚴格要求使操作技能規(guī)范化,老師作示范,強調(diào)其要點學生自己練。三.教學學時分配與安排本課程按每周3學時安排,共6個實驗,總學時18。目錄實驗一細菌的革蘭氏染色………3實驗二根霉、酵母菌形態(tài)結構的觀察…………4實驗三培養(yǎng)基制備………………6實驗四滅菌與消毒………………9實驗五微生物的分離和純化……12實驗六微生物的生理生化反應…………………14實驗七水中細菌總數(shù)的測定……19實驗八

放線菌形態(tài)的觀察………21實驗九細菌的芽胞染色…………22實驗十微生物菌種保藏…………24實驗一細菌的革蘭氏染色法實驗目的:1．學習并初步掌握革蘭氏染色法。了解革蘭氏染色的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。實驗原理:革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家ChristainGram氏創(chuàng)立的,而后一些學者在此基礎上作了某些改進。革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法的基本步驟是:先用初染劑結晶紫進行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脫色,最后用復染劑(如番紅)復染。經(jīng)此方法染色后,細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌;如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色),該菌屬于革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性,是由這兩類細菌細胞壁的結構和組成不同決定的。實際上,當用結晶紫初染后,象簡單染色法一樣,所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑,它能與結晶紫結合成結晶紫一碘的復合物,從而增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時,兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結構組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低,用乙醇(或丙酮)脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結構孔徑縮小,透性降低,從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi),經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同,由于其細胞壁肽聚糖層較薄,類脂含量高,因此當脫色處理時,類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解,細胞壁透性增大,使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來,用復染劑復染后,細胞被染上復染劑的紅色。實驗器材:1．菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)12～20h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2．染色劑革蘭氏染色液。3.儀器或其它用具顯微鏡,酒精燈,載玻片,接種環(huán),雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯),擦鏡紙,生理鹽水。實驗內(nèi)容:1．制片取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。*要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色;以免脫色不完全造成假陽性;火焰固定不宜過熱(以玻片不燙手為宜)。2．初染滴加結晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)染色1-2min,水洗。3．媒染用碘液沖去殘水,并用碘液覆蓋約1min,水洗。4．脫色用濾紙吸去玻片上的殘水,將玻片傾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脫色,直至流出的乙醇無紫色時,立即水洗。*革蘭氏染色結果是否正確,乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環(huán)節(jié),脫色不足,陰性菌被誤染成陽性菌,脫色過度,陽性菌被誤染成陰性菌,脫色時間一般約20-30s。5．復染用番紅染液復染約2min,水洗。6．鏡檢干燥后,用油鏡觀察。菌體被染成藍紫色是革蘭氏陽性菌,被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。7．混合涂片染色按上述方法,在同一載玻片上,以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌或大腸桿菌和金黃色葡萄菌作為混合涂片、染色、鏡檢進行比較。實驗報告:1．列表簡述3株細菌的染色觀察結果(說明各菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應)。2．你認為哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色結果的正確性?最關鍵的環(huán)節(jié)是什么?3．現(xiàn)有一株細菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗壯桿菌,請你鑒定其革蘭氏染色反應。你怎樣運用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照菌株進行涂片染色,以證明你的染色結果正確性。4．你的染色結果是否正確?如果不正確,請說明原因。5．進行革蘭氏染色時,為什么特別強調(diào)菌齡不能太老,用老齡細菌染色會出現(xiàn)什么問題?6．革蘭氏染色時,初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復染之前,革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應分別是什么顏色?7．你認為革蘭氏染色中,哪一個步驟能夠省去而不影響最終結果?在什么情況下能夠采用?實驗二根霉、酵母菌形態(tài)結構的觀察實驗目的:1．觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式,掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細菌的區(qū)別。2．學習并掌握觀察霉菌的基本方法,了解四類常見霉菌的基本形態(tài)特征。實驗原理:酵母菌是不運動的單細胞真核微生物,其大小一般比常見細菌大幾倍甚至十幾倍。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進行無性繁殖,有的分裂繁殖;有性繁殖是經(jīng)過接合產(chǎn)生子囊孢子。本實驗經(jīng)過美藍染液水侵片來觀察酵母菌的形態(tài)和發(fā)芽生殖方式。美藍是一種無毒性的染料,它的氧化型呈藍色,還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時,由于細胞的新陳代謝作用,細胞內(nèi)具有較強的還原能力,能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型,因此,具有還原能力的酵母活細胞是無色的、而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞則呈藍色或淡藍色,借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。霉菌可產(chǎn)生分枝的菌絲體,分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲,氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲,由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度一般比細菌和放線菌粗得多,可用低倍顯微鏡觀察。觀察霉菌的形態(tài)主要有三種方法,直接制片觀察法:是將培養(yǎng)物放置于乳酸石炭酸棉藍染色液中,制成霉菌制片鏡檢,其制片的特點是:細胞不變形;具有防腐作用,不易干燥,能保存較長時間;能防止孢子飛散;染液的藍色能增強反差。必要時,還可用樹脂封固,制成永久標本長期保存。載玻片培養(yǎng)觀察法:用無菌操作將培養(yǎng)物瓊脂薄層放置于載玻片上,接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng),霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內(nèi)沿蓋玻片橫向生長。培養(yǎng)一定時間后,將載玻片上的培養(yǎng)物置顯微鏡下觀察。這中方法既能夠保持霉菌自然生長狀態(tài),還便于觀察不同發(fā)育時期的培養(yǎng)物。

玻璃紙培養(yǎng)觀察法:霉菌的玻璃紙培養(yǎng)觀察方法與放線菌玻璃紙培養(yǎng)觀察方法相似。這種方法用于觀察不同生長階段霉菌的形態(tài),也可獲得良好的效果。實驗器材:1.菌種釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)培養(yǎng)約2day的麥芽汁斜面培養(yǎng)物,曲霉(Aspergillussp.),青霉(Pencilliumsp.),根霉(Rhizopussp.)和毛霉(Mucorsp.)培養(yǎng)2-5天的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物。2.溶液或試劑0.05%和0.1%呂氏堿性美藍染色液,革蘭氏染色用碘液,乳酸石炭酸棉藍染色液。3.儀器或其它用具顯微鏡,載玻片,蓋玻片,無菌吸管,平皿,載玻片,蓋玻片,U型玻璃棒,解剖針,鑷子,50%乙醇,20%的甘油等。實驗內(nèi)容:(一)酵母觀察

1.美藍浸片的觀察(1)在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍染色液,然后按無菌操作用接種環(huán)挑取少量酵母菌放在染液中,混合均勻。(2)用鑷子取一塊蓋玻片,先將一邊與菌液接觸,然后慢慢地將蓋玻片放下使其蓋在菌液上。

(3)將制片放置約3min后鏡檢,先用低倍鏡后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況,并根據(jù)顏色區(qū)別死活細胞。(4)染色約0.5h后再次進行觀察,注意死細胞數(shù)量是否增加。(5)用0.05%呂氏堿性美藍染液重復上述操作。2.水—碘液浸片的觀察

在載玻片中央加一小滴革蘭氏染色液用碘液,然后在其上加3小滴水,取少許酵母菌苔放在水—碘液中混勻,蓋上蓋玻片后鏡檢。(二)霉菌觀察1.直接制片觀察法

在載玻片上加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液,用解剖針從霉菌菌落邊緣挑取少量已產(chǎn)孢子的霉菌菌絲,先置于50%乙醇中浸一下以洗去脫落的孢子,再放在載玻片上的染色液中,用解剖針小心地將菌絲分散開。蓋上蓋玻片,放置低倍鏡下觀察,必要時換高倍鏡觀察。2.載玻片培養(yǎng)觀察法(1)培養(yǎng)小室的滅菌在平皿皿底鋪一張略少于皿底的圓濾紙片,再放一U型玻璃棒,其上放一潔凈載玻片和兩塊蓋玻片,蓋上皿蓋。包扎后121°C滅菌30min,烘干備用。(2)瓊脂塊的制作取已經(jīng)滅菌的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基6~7ml注入另一個滅菌平皿中,使之凝固成薄層。解剖刀切成0.5~1cm2的瓊脂塊,并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上。(3)接種用尖細的接種針挑取很少量的孢子接種于瓊脂塊的邊緣上,用無菌鑷子將蓋玻片覆蓋再瓊脂塊上。(4)培養(yǎng)先在平皿的濾紙上加3~5ml滅菌的20%甘油(用于保持平皿內(nèi)的濕度),蓋上蓋,28°C培養(yǎng)。(5)鏡檢根據(jù)需要能夠在不同的培養(yǎng)時間內(nèi)取出載玻片置低倍鏡下觀察,必要時換高倍鏡。實驗報告:1．繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征2．說明觀察到的呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間不同,對酵母菌死細胞數(shù)量有何影響?分析其原因。3．在顯微鏡下,酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細菌?4．你主要根據(jù)哪些形態(tài)特征來區(qū)分所觀察的四種霉菌?5．在顯微鏡下,細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么?實驗三培養(yǎng)基制備實驗目的:了解培養(yǎng)基的制備原理并掌握其制備過程。實驗原理:培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì),用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。由于各種微生物所需要的營養(yǎng)不同,因此培養(yǎng)基的種類很多。能夠根據(jù)微生物種類和實驗目的不同分成若干類型。培養(yǎng)基的類別如下:1.按照培養(yǎng)基的成分來分培養(yǎng)基按其所含成分,可分為合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基三類。(1)合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基的各種成分完全是已知的各種化學物質(zhì)。這種培養(yǎng)基的化學成分清楚,組成成分精確,重復性強,但價格較貴,而且微生物在這類培養(yǎng)基中生長較慢。如高氏一號合成培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基等。(2)天然培養(yǎng)基。由天然物質(zhì)制成,如蒸熟的馬鈴薯和普通牛肉湯,前者用于培養(yǎng)霉菌,后者用于培養(yǎng)細菌。這類培養(yǎng)基的化學成分很不恒定,也難以確定,但配制方便,營養(yǎng)豐富,因此常被采用。(3)半合成培養(yǎng)基。在天然有機物的基礎上適當加入已知成分的無機鹽類,或在合成培養(yǎng)基的基礎上添加某些天然成分,如培養(yǎng)霉菌用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基能更有效地滿足微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需要。2.按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分培養(yǎng)基按其物理狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基三類。(1)固體培養(yǎng)基。是在培養(yǎng)基中加入凝固劑,有瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養(yǎng)基常見于微生物分離、鑒定、計數(shù)和菌種保存等方面。(2)液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基中不加任何凝固劑。這種培養(yǎng)基的成分均勻,微生物能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料,適于作生理等研究,由于發(fā)酵率高,操作方便,也常見于發(fā)酵工業(yè)。(3)半固體培養(yǎng)基。是在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態(tài)。可用于觀察細菌的運動、鑒定菌種和測定噬菌體的效價等方面。3.按照培養(yǎng)基用途分培養(yǎng)基按用途可分為基礎培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。(1)基礎培養(yǎng)基含有一般細菌生長繁殖需要的基本的營養(yǎng)物質(zhì)。最常見的基礎培養(yǎng)基是天然培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。(2)加富培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì),如血、血清、動植物組織提取液,用以培養(yǎng)要求比較苛刻的某些微生物。(3)選擇性培養(yǎng)基是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學抗性而設計的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基能夠?qū)⑺枰奈⑸飶幕祀s的微生物中分離出來。⑷鑒別培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學藥品,使微生物培養(yǎng)后會發(fā)生某種變化,從而區(qū)別不同類型的微生物。實驗器材:1．溶液或試劑牛肉膏,蛋白胨,瓊脂,可溶性淀粉,葡萄糖,孟加拉紅,鏈霉素,1mol/LNaOH,lmol/LHCl,KNO3,NaCl,K2HPO4·3H2O,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O。2．儀器或其它用具試管,三角瓶,燒杯,量筒,玻璃棒,天平,牛角匙,pH試紙,棉花,牛皮紙,記號筆,線繩,紗布,漏斗,漏斗架,膠管,止水夾等。實驗內(nèi)容:(一)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基。其配方如下:牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl5g,瓊脂15～20g,水1000mL,PH7.4～7.61．稱藥品按實際用量計算后,按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量,用熱水溶解后倒入大燒杯;也可放在稱量紙上稱量,隨后放入熱水中,牛肉膏使與稱量紙分離,立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮,故稱量時要迅速。2．加熱溶解在燒杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉網(wǎng)上,小火加熱,并用玻棒攪拌,待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基,則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中,再加熱融化,此過程中,需不斷攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,最后補足所失的水分。3．調(diào)pH檢測培養(yǎng)基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/LNaOH,邊加邊攪拌,并隨時用pH試紙檢測,直至達到所需pH范圍。若偏堿,則用lmol/LHCl進行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)一般放在加瓊脂之前。應注意pH值不要調(diào)過頭,以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4．過濾液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾,固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾,以利培養(yǎng)的觀察?？墒枪┮话闶褂玫呐囵B(yǎng)基,這步可省略。5．分裝按實驗要求,可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量:固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5,滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜,滅菌后垂直待凝。6．加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適,四周緊貼管壁,不留縫隙,才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約2/3塞入試管口或瓶口內(nèi),以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣,則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7．包扎加塞后,將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙,以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中,則應以5支或7支在一起,再于棉塞外包一層牛皮紙,用繩扎好。然后用記號筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8．滅菌將上述培養(yǎng)基于121.3℃濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時滅菌,則應放入冰箱內(nèi)暫存。9．擺斜面滅菌后,如制斜面,則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上,并調(diào)整斜度,使斜面的長度不超過試管總長的1/2。10．無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h,無菌生長即可使用,或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi),備用。(二)高氏Ⅰ號培養(yǎng)基的配制高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下:可溶性淀粉20g,KNO31g,NaCl0.5g,K2HPO4·3H2O0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,瓊脂15～20g,水1000mL,pH7.4～7.6。l．稱量和溶解先計算后稱量,按用量先稱取可溶性淀粉,放入小燒杯中,并用少量冷水將其調(diào)成糊狀,再加入少于所需水量的水,繼續(xù)加熱,邊加熱邊攪拌,至其完全溶解。再加入其它成分依次溶解。對微量成分FeSO4·7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入,方法是先在1000mL水中加入1g的FeSO4·7H2O,配成濃度為0.01g/mL的貯備液,再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。待所有藥品完全溶解后,補充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基,其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2．pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。(三)馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下:KH2PO41g,MgSO4·7H2O0.5g,蛋白胨5g,葡萄糖l0g,瓊脂15～20g,水1000mL,自然pH。1．稱量和溶解先計算后稱量,按用量稱取各成分,并將其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后,補充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液,在1000mL培養(yǎng)液中加入以上孟加拉紅溶液3.3mL,混勻后,加入瓊脂加熱融化,方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2．分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。3．鏈霉素的加入鏈霉素受熱容易分解,因此臨用時,將培養(yǎng)基融化后待溫度降至45℃左右時才能加入。可先將鏈霉素配成1%的溶液(配好的鏈霉素溶液保存于-20℃),在100mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素0.3mL,使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30μg。注意事項:稱藥品用的牛角匙不要混用,稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時要小心操作,避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點,要注意具體操作。實驗報告:l．配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應注意些什么問題?為什么?2．培養(yǎng)基配制完成后,為什么必須立即滅菌?若不能及時滅菌應如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進行無菌檢查?細菌能在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上生長嗎?為了分離放線菌,你認為應該采取什么措施?什么是選擇性培養(yǎng)基?它在微生物學工作中有何重要性?如果在用馬丁氏培養(yǎng)基分離真菌時,發(fā)現(xiàn)有細菌生長,你認為是什么原因?你將如何進一步分離純化得到所需要的真菌?實驗四滅菌與消毒實驗目的:1．了解干熱滅菌的原理和應用范圍。學習干熱滅菌的操作技術。2．了解高壓蒸氣滅菌的基本原理及應用范圍。學習高壓蒸氣滅菌的操作方法。3．了解紫外線滅菌的原理和方法。實驗原理:干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關,在菌體受熱時,當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大,則蛋白蛋凝固就越快,反之含水量越少,凝固緩慢。因此,與濕熱滅菌相比,干熱滅菌所需溫度要高(160～170℃),時間要長(1～2h),但干熱滅菌溫度不能超過180℃,否則,包器皿的紙或棉塞就會燒焦,甚至引起燃燒。高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi),經(jīng)過加熱,使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡,然后關閉排氣閥,繼續(xù)加熱,此時由于蒸氣不能溢出,而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力,從而使沸點增高,得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。在同一溫度下,濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三:一是濕熱中細菌菌體吸收水分,蛋白質(zhì)較易凝固,因蛋白質(zhì)含水量增加,所需凝固溫度降低(表1),,二是濕熱的穿透力比干熱大(表2),,三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。1g水在100℃時,由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱,能迅速提高被滅菌物體的溫度,從而增加滅菌效力。表1蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關系卵白蛋白含水量/%30分鐘內(nèi)凝固所需溫度/℃50562574～801880～9061450160～170表2干熱濕熱穿透力及滅菌效果比較溫度/℃時間/h透過布層的溫度/℃滅菌20層10層100層干熱130-1404867270．5不完全濕熱105.33101101101完全在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時,滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要,因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓,因此,當水蒸氣中含有空氣時,在同一壓力下,含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時,壓力與溫度的關系見(表3)表3滅菌鍋留有不同分量空氣時,壓力與溫度的關系壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度/℃2/3空氣排出時的溫度/℃1/2空氣排出時的溫度/℃1/3空氣排出時的溫度/℃空氣全不排出時的溫度/℃MpaKg/cm2Ib/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.101．0515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121現(xiàn)在法定壓力單位己不用磅和kg/cm2表示,而是用Pa或bar表示,其換算關系為:1kg/cm2=98066.5Pa;1Ib/in2=6894.76Pa.一般培養(yǎng)基用0.1Mpa(相當于15Ib/in2或1.05kg/cm2),121.5℃,15～30min可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.06Mpa(8Ib/in2或0.59kg/cm2)112.6℃滅菌15min,但為了保證效果,可將其它成分先行121.3oC,滅菌20min,然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以0.1Mpa,121.5℃滅菌20min即可,而盛于大瓶內(nèi)的培養(yǎng)基最好以0.1Mpa,122℃滅菌30min。實驗中常見的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式和手提式二種,其結構和工作原理相同,本實驗以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例,介紹其使用方法,有關自控高壓蒸氣滅菌鍋(autoclave)的使用可參照廠家說明書。紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200~300nm的紫外線都有殺菌能力,其中以260nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下,紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機理主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián),從而抑制了DNA的復制。另一方面,由于輻射能使空氣中的氧電離成[O],再使O2氧化生成臭氧(O3)或使水(H2O)氧化生成過氧化氫(H2O2)。O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力不大,因此,只適用于無菌室,接種箱,手術室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2m為宜。另外,為了加強紫外線滅菌效果,在打開紫外燈以前;可在無菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑3%～5%石炭酸溶液,一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落,另一方面也能夠殺死一部分細菌。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%～3%的來蘇爾擦洗,然后再開紫外燈照射,即可增強殺菌效果,達到滅菌目的。實驗器材:1．培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。2．溶液或試劑3%-5%石炭酸或2%-3%來蘇爾溶液。3．儀器或其它用具培養(yǎng)皿,試管,吸管,電烘箱,培養(yǎng)皿(6套一包),手提式高壓蒸氣滅菌鍋,紫外線燈等。實驗內(nèi)容:一、干熱滅菌1．裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品(培養(yǎng)皿、試管,吸管等)放入電烘箱內(nèi),關好箱門。物品不要擺得太擠,以免妨礙空氣流通,滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板,以防包裝紙烤焦起火。2．升溫接通電源,撥動開關,打開電烘箱排氣孔,旋動恒溫調(diào)節(jié)器至綠燈亮,讓溫度逐漸上升。當溫度升至100℃時,關閉排氣孔。在升溫過程中,如果紅燈熄滅,綠燈亮,表示箱內(nèi)停止加溫,此時如果還未達到所需的160—170℃溫度,則需轉(zhuǎn)動調(diào)節(jié)器使紅燈再亮,如此重復調(diào)節(jié),直至達到所需溫度。3．恒溫當溫度升達到160～170℃時,恒溫調(diào)節(jié)器會自動控制調(diào)節(jié)溫度,保持此溫度2h。干熱滅菌過程。嚴防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。4．降溫切斷電源、自然降溫。5．開箱取物待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃以下后,打開箱門,取出滅菌物品。電烘箱內(nèi)溫度末降到70℃,切勿自行打開箱門以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。二高壓蒸氣滅菌1．首先將內(nèi)層鍋取出,再向外層鍋內(nèi)加入適量的水,使水面與三角擱架相平為宜。切勿忘記加水,同時水量不可過少,以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2．放回內(nèi)層鍋,并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠,以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸,以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3．加蓋,并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相正確兩個螺栓,使螺栓松緊一致,勿使漏氣。4．用電爐或煤氣加熱,并同時打開排氣閥,使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后,關上排氣閥,讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。當鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時,控制熱源,維持壓力至所需時間。本實驗用0.1Mpa,121.5℃,20min滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后,才能關上排氣閥,維持所需壓力。5．滅菌所需時間到后,切斷電源或關閉煤氣,讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降,當壓力表的壓力降至”0”時,打開排氣閥,旋松螺栓,打開蓋子,取出滅菌物品。壓力一定要降到”0”時,才能打開排氣閥,開蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力突然下降,使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口,造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染,甚至灼傷操作者。6．將取出的滅菌培養(yǎng)基,需擺斜面的則擺成斜面,然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h,經(jīng)檢查若無雜菌生長,即可待用。三、紫外線滅菌l．單用紫外線照射(1)在無菌室內(nèi)或在接種箱內(nèi)打開紫外線燈開關,照射30min,將開關關閉。(2)將牛肉膏蛋白胨平板蓋打開15min,然后蓋上皿蓋。置37℃培養(yǎng)24h。共做三套。(3)檢查每個平板上生長的菌落數(shù)。如果不超過4個,說明滅菌效果良好,否則,需延長照射時間或同時加強其它措施。2．化學消毒劑與紫外線照射結合使用(1)在無菌室內(nèi),先噴灑3%～5%的石炭酸溶液,再用紫外線燈照射15imn。(2)無菌室內(nèi)的桌面,凳子用2%～3%來蘇爾擦洗,再打開紫外線燈照射15min。(3)檢查滅菌效果。因紫外線對眼結膜及視神經(jīng)有損傷作用,對皮膚有刺激作用,故不能直視紫外線燈光下工作。實驗報告:l．在干熱滅菌操作過程中應注意哪些問題,為什么?2．為什么干熱火菌比濕熱滅菌所需要的溫度要高,時間要長?3．高壓蒸氣滅菌開始之前,為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡?滅菌完畢后,為什么待壓力降低”0”時才能打開排氣閥,開蓋取物?4．在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時,怎樣杜絕一切不安全的因素?5．滅菌在微生物實驗操作中有何重要意義?6．黑曲霉的孢子與芽孢桿菌的孢子對熱的抗性哪個最強?為什么?實驗五微生物的分離和純化實驗目的:掌握倒平板的方法和幾種常見的分離純化微生物的基本操作技術。實驗原理:從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常見的方法有簡易單細胞挑取法;平板分離法。本實驗采用平板分離法:該方法操作簡便,普遍用于微生物的分離與純化,包括兩個方面1．選擇適合于待分離微生物的生長條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長,而抑制其它微生物生長的環(huán)境,從而淘汰一些不需要的微生物;微生物在固體培養(yǎng)基生長形成的單個菌落能夠是一個細胞繁殖而成的集合體,因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單個菌落的方法可經(jīng)過稀釋涂布平板或平板劃線等技術來完成的。單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng),純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外還要結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定。實驗器材:1．菌種米曲霉(Aspergillusoryzae)。2．培養(yǎng)基高氏Ⅰ號培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基,查氏瓊脂培養(yǎng)基。3．溶液或試劑10%酚,盛9ml無菌水的試管,盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶,4%水瓊脂。4．儀器或者其它用具無菌玻璃涂棒,無菌吸管,接種環(huán),無菌培養(yǎng)皿,鏈霉素和土樣,顯微鏡,血細胞計數(shù)板等。實驗內(nèi)容:1．稀釋涂布平板法

(1)倒平板將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基;馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化,待冷至55~60℃,高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基加入10%酚數(shù)滴,馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加入鏈霉素溶液,混勻后分別倒平板,每種培養(yǎng)基倒三皿。(2)制備土壤稀釋溶液稱取土樣10g,放入盛有90ml無菌水并帶入玻璃珠的三角燒瓶,振動約20min,使土樣與水分混合,將細胞分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻,然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一個盛有9ml無菌水的試管中,混合均勻,以此類推制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀釋度的土壤溶液。(3)涂布將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-4,10-5,10-6三種稀釋度,然后用無菌吸管分別由10-4,10-5,10-6三管土壤稀釋液中各取0.1ml對號放入已寫好稀釋度的平板中,用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻,室溫下靜置5~10min,使菌液吸附進培養(yǎng)基;

(4)培養(yǎng)將高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基平板和馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3~5day,肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2~3day;

(5)挑菌落將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上,分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng),待菌苔長出后,檢查其特征是否一致,同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌,需要再一次進行分離、純化,直到獲得純培養(yǎng)。2．平板劃線分離法(1)倒平板按稀釋涂布平板法倒平板,并用記號筆標明培養(yǎng)基名稱,土樣編號和實驗日期;(2)劃線在近火焰處,左手拿皿底,右手拿接種環(huán),挑取上述10-1的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多,但無論采用那種方法,其目的都是經(jīng)過劃線將樣品在平板上進行稀釋,使之形成單個菌落。

(3)挑菌落同稀釋涂布平板法,一直到分離的微生物純化為止。實驗報告:1．

如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)?請寫出實驗的主要步驟。2．為什么高氏Ⅰ號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素?如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對青霉素具有抗性的細菌,你認為應如何做?3．在三種不同的平板上你分離得到哪些類群的微生物?簡述它們的菌落特征。4．如果要分離得到極端嗜鹽細菌,在什么地方取樣品為宜?并說明理由。5．為什么高氏Ⅰ號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素?如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對青霉素具有抗性的細菌,你認為應如何做?實驗六微生物的生理生化反應實驗目的:1．證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同,從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。2．了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細菌鑒定中的重要作用。掌握經(jīng)過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。3．了解IMViC與硫化氫反應的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。實驗原理:微生物對大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用,必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶,經(jīng)過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物,使其能被運輸至細胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖;脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等。這些過程均可經(jīng)過觀察細菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實:淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色,但細菌水解淀粉的區(qū)域,用碘測定不再產(chǎn)生藍色,表明細菌產(chǎn)生淀粉酶。脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養(yǎng)基的pH,使pH降低,加入培養(yǎng)基的中性紅指示劑會使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色,說明胞外存在著脂肪酶。微生物能夠利用各種蛋白質(zhì)和氨基酸作為氮源外,當缺乏糖類物質(zhì)時,亦可用它們作為碳源和能源。明膠是由膠原蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì),在25℃以下可維持凝膠狀態(tài),以固體形式存在。而在25℃以上明膠就會液化。有些微生物可產(chǎn)生一種稱作明膠酶的胞外酶,水解這種蛋白質(zhì),而使明膠液化,甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。還有些微生物能水解牛奶中的蛋白質(zhì)酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶來檢測。石蕊培養(yǎng)基由脫脂牛奶和石蕊組成,是昏濁的藍色。酪素水解成氨基酸和肽后,培養(yǎng)基就會變得透明。石蕊牛奶也常被用來檢測乳糖發(fā)酵,因為在酸存在下,石蕊會轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色,而過量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成)。氨基酸的分解會引起堿性反應,使石蕊變?yōu)樽仙?。另?某些細菌能還原石蕊,使試管底部變?yōu)榘咨?。尿素是由大多?shù)哺乳動物消化蛋白質(zhì)后被分泌在尿中的廢物。尿素酶能分解尿素釋放出氨,這是一個分辨細菌很有用的診斷實驗。盡管許多微生物都能夠產(chǎn)生尿素酶,但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬(Proteus)的細菌要慢,因此尿素酶試驗被用來從其它非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分這個屬的成員。尿素瓊脂含有蛋白胨,葡萄糖,尿素和酚紅。酚紅在pH6.8時為黃色,而在培養(yǎng)過程中,產(chǎn)生尿素酶的細菌將分解尿素產(chǎn)生氨,使培養(yǎng)基的pH升高,在pH升至8.4時,指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。糖發(fā)酵試驗是常見的鑒別微生物的生化反應,在腸道細菌的鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為碳源和能源,可是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異。有些細菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫氣、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,不能分解乳糖。發(fā)酵培養(yǎng)基含有蛋白胨,指示劑(溴甲酚紫),倒置的德漢氏小管和不同的糖類。當發(fā)酵產(chǎn)酸時,溴甲酚紫指示劑可由紫色(pH6.8)變?yōu)辄S色(pH5.2)。氣體的產(chǎn)生可由倒置的德漢氏試管中有無氣泡來證明。IMViC是吲哚(indoltest)、甲基紅(methy1redtest)、伏一普(Voges-Prokauertest)和檸檬酸鹽(citratetest)四個試驗的縮寫,i是在英文中為了發(fā)音方便而加上的。這四個試驗主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes),多用于水的細菌學檢查。大腸桿菌雖非致病菌,但在飲用水中若超過一定數(shù)量,則表示受糞便污染。產(chǎn)氣腸桿菌也廣泛存在于自然界中,因此檢查水時要將兩者分開。硫化氫試驗也是檢查腸道桿菌的生化試驗。吲哚試驗是用來檢測吲哚的產(chǎn)生。有些細菌能產(chǎn)生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結合,形成紅色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力,因此吲哚試驗能夠作為一個生物化學檢測的指標。大腸桿菌吲哚反應陽性,產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機酸,如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產(chǎn)生酸時,培養(yǎng)基就會變酸,使加入培養(yǎng)基的甲基紅指示劑由橘黃色(pH6.3)變?yōu)榧t色(pH4.2),即甲基紅反應。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機酸,但這個試驗在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上依然是有價值的。這兩個細菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機酸,但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4,而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物,如乙醇、丙酮酸等,使pH升至大約6。因此大腸桿菌為陽性反應,產(chǎn)氣腸桿菌為陰性反應。伏-普試驗是用來測定某些細菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力,如丙酮酸。丙酮酸進行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇,此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用,生成紅色化合物,即伏-普反應陽性;不產(chǎn)生紅色化合物者為陰性反應。有時為了使反應更為明顯,可加入少量含胍基的化合物,如肌酸等。其化學反應過程大致如下:C6H12O6—→2CH3COCOOH+4H丙酮酸2CH3COCOOH—→CH3COCHOHCH3+2CO2乙酰甲基甲醇-2HCH3COCHOHCH3———→CH3COCOCH3+NaOH二乙酰胍紅色化合物檸檬酸鹽試驗是用來檢測檸檬酸鹽是否被利用。有些細菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源,如產(chǎn)氣腸桿菌;而另一些細菌則不能利用檸檬酸鹽,如大腸桿菌。細菌在分解檸檬酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸銨后,產(chǎn)生堿性化合物,使培養(yǎng)基的pH升高,當加入1%溴麝香草酚藍指示劑時,培養(yǎng)基就會由綠色變?yōu)樯钏{色。溴麝香草酚藍的指示范圍為:pH小于6.0時呈黃色,pH在6.0-7.0時為綠色,pH大于7.6時呈藍色。硫化氫試驗是檢測硫化氫的產(chǎn)生,也是用于腸道細菌檢查的常見生化試驗。有些細菌能分解含硫的有機物,如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫,硫化氫一遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等,就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物。大腸桿菌為陰性,產(chǎn)氣腸桿菌為陽性。以半胱氨酸為例,其化學反應過程如下:CH2SHCHNH2COOH+H2O→CH3COCOOH+H2S↑+NH3↑H2S+Pb(CH3COO)2→PbS↓+2CH3COOH(黑色)實驗器材:1．菌種枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis),大腸桿菌(Escherichiacoli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),普通變形桿菌(Proteusvularis),產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)。2．培養(yǎng)基固體油脂培養(yǎng)基,固體淀粉培養(yǎng)基,明膠培養(yǎng)基試管,石蕊牛奶試管,尿素瓊脂試管,葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管各3支(內(nèi)裝有倒置的德漢氏小試管),蛋白胨水培養(yǎng)基,葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基,檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基,醋酸鉛培養(yǎng)基。3．溶液或試劑革蘭氏染色用盧戈氏碘液(Lugol’siodinesolution),甲基紅指示劑,40%KOH,5%α-萘酚,乙醚,吲哚試劑等。4．儀器或其它用具無菌平板,無菌試管,接種環(huán),接種針,試管,試管架等。實驗內(nèi)容:一大分子物質(zhì)的水解試驗l．淀粉水解試驗(1)將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50℃左右,無菌操作制成平板。(2)用記號筆在平板底部劃成四部分。(3)將枯草芽孢桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線接種,在平板的反面分別在四部分寫上菌名。(4)將平板倒置在37℃溫箱中培養(yǎng)24h。(5)觀察各種細菌的生長情況,將平板打開蓋子,滴入少量Lugol’s碘液于平皿中,輕輕旋轉(zhuǎn)平板,使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈,說明淀粉己被水解,為陽性。透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱,即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低。2．油脂水解試驗(1)將溶化的固體油脂培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時,充分搖蕩,使油脂均勻分布。無菌操作倒入平板,待凝。(2)用記號筆在平板底部劃成四部分,分別標上菌名。(3)將上述四種菌分別用無菌操作劃十字接種于平板的相對應部分的中心。(4)將平板倒置,于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。(5)取出平板,觀察菌苔顏色,如出現(xiàn)紅色斑點說明脂肪水解,為陽性反應。3．明膠水解試驗(1)取三支明膠培養(yǎng)基試管,用記號筆標明各管欲接種的菌名。(2)用接種針分別穿刺接種枯草芽孢桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌。(3)將接種后的試管置20℃中,培養(yǎng)2～5d。(4)觀察明膠液化情況。4．石蕊牛奶試驗(1)取兩支石蕊牛奶培養(yǎng)基試管,用記號筆標明各管欲接種的菌名。(2)分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。(3)將接種后的試管置35℃中,培養(yǎng)24～48h。(4)觀察培養(yǎng)基顏色變化。石蕊在酸性條件下為粉紅色,堿性條件下為紫色,而被還原時為白色。5．尿素試驗(1)取兩支尿素培養(yǎng)基斜面試管,用記號筆標明各管欲接種的菌名。(2)分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。(3)將接種后的試管置35℃中,培養(yǎng)24-48h。(4)觀察培養(yǎng)基顏色變化。尿素酶存在時為紅色,無尿素酶時應為黃色。二糖發(fā)酵試驗1．用記號筆在各試管外壁上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的細菌菌名。2．取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支,分別接入大腸桿菌,普通變形桿菌,第三支不接種,作為照。另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支,同樣分別接入大腸桿菌,普通變形桿菌,第三支不接種,作為對照。在接種后,輕緩搖動試管,使其均勻,防止倒置的小管進入氣泡。3．將接種過和作為對照的6支試管均置37℃培養(yǎng)24-48h。4．觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。三IMViC與硫化氫試驗l．接種與培養(yǎng)(1)用接種針將大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌分別穿刺接入2支醋酸鉛培養(yǎng)基中(硫化氫試驗),置37℃培養(yǎng)48h。(2)將上述二菌分別接種于2支蛋白胨水培養(yǎng)基(吲哚試驗),2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(甲基紅試驗和伏-普試驗),2支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基和2支醋酸鉛培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng)2d。2．結果觀察(1)硫化氫試驗培養(yǎng)48h后觀察黑色硫化鉛的產(chǎn)生。(2)吲哚試驗于培養(yǎng)2d后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加3-4滴乙醚,搖動數(shù)次,靜置1-3min,待乙醚上升后,沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑,在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性反應。配制蛋白胨水培養(yǎng)基,所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的,如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量較高。(3)甲基紅試驗培養(yǎng)2d后,將l支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入甲基紅試劑2滴,培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性,變黃色者為陰性。注意甲基紅試劑不要加得太多,以免出現(xiàn)假陽性反應。(4)伏-普試驗培養(yǎng)2d后,將另1支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入5-10滴40%KOH,然后加入等量的5%α-萘酚溶液,用力振蕩,再放入37℃溫箱中保溫15-30min,以加快反應速度。若培養(yǎng)物呈紅色者,為伏-普反應陽性。(5)檸檬酸鹽試驗培養(yǎng)培養(yǎng)48h后觀察檸檬酸鹽敘面培養(yǎng)基上有無細菌生長和是否變色。藍色為陽性,綠色為陰性。實驗報告:1．將結果填入下表,”+”表示陽性,”-”表示陰性。菌名淀粉水解試驗脂肪水解試驗明膠液化試驗石蕊牛奶試驗尿素試驗枯草芽孢桿菌大腸桿菌金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌普通變形桿菌

2．你怎樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶?3．不利用碘液,你怎樣證明淀粉水解的存在?4．接種后的明膠試管能夠在35℃培養(yǎng),在培養(yǎng)后你必須做什么才能證明水解的存在?5．解釋在石蕊牛奶中的石蕊為什么能起到氧化還原指示劑的作用?6．為什么尿素試驗可用于鑒定Proteus細菌?7．將結果填入下表?！?”表示產(chǎn)酸或產(chǎn)氣,”-”表示不產(chǎn)酸或不產(chǎn)氣。糖類發(fā)酵大腸桿菌普通變形桿菌對照葡萄糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵8．假如某種微生物能夠有氧代謝葡萄糖,發(fā)酵試驗應該出現(xiàn)什么結果?9．將結果填入下表?！?”表示陽性反應,”-”表示陰性反應。菌名IMViC試驗硫化氫試驗吲哚試驗甲基紅試驗伏一普試驗檸檬酸鹽試驗大腸桿菌產(chǎn)氣腸菌對照

10．解釋在細菌培養(yǎng)中吲哚檢測的化學原理,為什么在這個試驗中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑,而不用丙酮酸?11．為什么大腸桿菌是甲基紅反應陽性,而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性?這個試驗與伏一普試驗最初底物與最終產(chǎn)物有何異同處?為什么會出現(xiàn)不同?12．說明在硫化氫試驗中,醋酸鉛的作用,能夠用哪種化合物代替醋酸鉛?實驗七水中細菌總數(shù)的測定實驗目的:l．學習水樣的采取方法和水樣細菌總數(shù)測定的方法。2．了解水源水的平板菌落計數(shù)的原則。實驗原理:本實驗應用平板菌落計數(shù)技術測定水中細菌總數(shù)。由于水中細菌種類繁多,它們對營養(yǎng)和其它生長條件的要求差別很大,不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下,使水中所有的細菌均能生長繁殖,因此,以一定的培養(yǎng)基平板上生長出來的菌落,計算出來的水中細菌總數(shù)僅是一種近似值。當前一般是采用普通肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。實驗器材:l．培養(yǎng)基肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,無菌水。2.儀器或其它用具滅菌三角燒瓶,滅菌的帶玻璃塞瓶,滅菌培養(yǎng)皿,滅菌吸管,滅菌試管等。實驗內(nèi)容:水中細菌總數(shù)的測定l．水樣的采取(1)自來水先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌,再開放水龍頭使水流5min后,以滅菌三角燒瓶接取水樣,以待分析。(2)池水、河水或湖水應取距水面l0～15cm的深層水樣,先將滅菌的帶玻璃塞瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻轉(zhuǎn)過來,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛滿后,將瓶塞蓋好,再從水中取出,最好立即檢查,否則需放入冰箱中保存。2．細菌總數(shù)測定(1)自來水①用滅菌吸管吸取lml水樣,注入滅菌培養(yǎng)皿中。共做兩個平皿。②分別傾注約15mL己溶化并冷卻到45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,并立即在桌上作平面旋搖,使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。③另取一空的滅菌培養(yǎng)皿,傾注肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15mL作空自對照。④培養(yǎng)基凝固后,倒置于37℃溫箱中,培養(yǎng)24h,進行菌落計數(shù)。⑤兩個平板的平均菌落數(shù)即為lml水樣的細菌總數(shù)。(2)池水、河水或湖水等①稀釋水樣取3個滅菌空試管,分別加入9ml滅菌水。取lml水樣注入第一管9ml滅菌水內(nèi)、搖勻,再自第一管取1ml至下一管滅菌水內(nèi),如此稀釋到第三管,稀釋度分別為10-1、10-2與10-3。稀釋倍數(shù)看水樣污濁程度而定,以培養(yǎng)后平板的菌落數(shù)在30～300個之間的稀釋度最為合適,若三個稀釋度的菌數(shù)均多到無法計數(shù)或少到無法計數(shù),則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數(shù)。一般中等污穢水樣,取10-1、10-2、10-3三個連續(xù)稀釋度,污穢嚴重的取10-2、10-3、10-4三個連續(xù)稀釋度。②自最后三個稀釋度的試管中各取lmL稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中,每一稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。③各傾注15ml已溶化并冷卻至45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,立即放在桌上搖勻。④凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。3．菌落計數(shù)方法(1)先計算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個平板有較大片狀菌苔生長時,則不應采用,而應以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到平板的一半,而其余的一半菌落分布又很均勻時,則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù),然后再計算該稀釋度的平均菌落數(shù)。(2)首先選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的,當只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時,則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細菌總數(shù)(見表)。(3)若有兩個稀釋度的平均菌落數(shù)均在30～300之間,則按兩者菌落總數(shù)之比值來決定。若其比值小于2,應采取兩者的平均數(shù);若大于2,則取其中較小的菌落總數(shù)(見表)。(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)(見表)。(5)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)(見表)。(6)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間,則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)(見表)。表計算菌落總數(shù)方法舉例例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)(個／ml)備注10-110-210-31136516420-16400或1.6×104兩位以后的數(shù)字采取四舍五入的方式去掉22760295461.637750或3.8×10432890271602.227100或2.7×1044無法計數(shù)1650513-513000或5.1×105527115-270或2.7×1026無法計數(shù)30512-30500或3.1×104實驗報告:1從自來水的細菌總數(shù)結果來看,是否合乎飲用水的標準?2你所測的水源水的污穢程度如何?3國家對自來水的細菌總數(shù)有一標準,那么各地能否自行設計其測定條件(諸如培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)時間等)來測定水樣總數(shù)呢?為什么?實驗八

放線菌形態(tài)的觀察實驗目的:

掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法,并觀察放線菌的形態(tài)特征。實驗原理:放線菌是指能形成分枝絲狀體或者菌絲體的一類革蘭氏陽性菌,常見的放線菌大多能形成菌絲體,緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長的叫基內(nèi)菌絲(簡稱基絲),基絲長到一定程度還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱氣絲),并進一步分化產(chǎn)生孢子絲以及孢子。有的放線菌只產(chǎn)生基絲而無氣絲。能否產(chǎn)生菌絲體及由菌絲體分化產(chǎn)生的各種形態(tài)特征是放線菌分類鑒定的重要依據(jù)觀察放線菌的形態(tài)特征常見扦片法、玻璃紙法、印片法。實驗器材:1.菌種細黃鏈霉菌(Streptomycesmicroflavus)或青色鏈霉菌(Streptomycesglaucus),弗氏鏈霉菌(S.glaucus)。2.培養(yǎng)基菌的高氏Ⅰ號瓊脂3.儀器或其它用具滅菌的平皿,玻璃管,蓋玻片,玻璃棒,以及載玻片,接種環(huán),接種鏟,鑷子,顯微鏡等。

實驗內(nèi)容:1.

放線菌自然生長狀態(tài)的觀察(1)

將滅菌后的高氏1號培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,每皿倒15ml左右,凝固后備用。(2)

用經(jīng)火焰滅過菌的小鑷子將滅菌過的優(yōu)質(zhì)玻璃紙平鋪在平皿培養(yǎng)基上,如果瓊脂培養(yǎng)基和玻璃紙之間有氣泡,能夠用滅過菌的玻璃棒將氣泡除去。(3)

將3～5ml無菌水倒入鏈霉菌的斜面培養(yǎng)物里,制成菌懸液,再適當稀釋。(4)

用無菌吸管取0.1ml的孢子懸液稀釋液,接種在玻璃紙上,并用無菌玻璃棒涂勻后,置28℃培養(yǎng),直到菌長好,備用。(5)

在潔凈的載玻片上滴一小滴水,稍涂布。取出培養(yǎng)皿,打開皿蓋,用鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分開,再用剪刀剪取小片長有菌的玻璃紙,菌面朝上放在載玻片的水面上,使紙平貼在載玻片上。(6)將載玻片置顯微鏡下觀察。附:玻璃紙滅菌方法

在玻璃紙滅菌時,若直接將干燥的玻璃紙滅菌,它會縮小,發(fā)皺,不便使用。故需作如下處理:將玻璃紙和濾紙剪成培養(yǎng)皿大小的圓形紙片,用水浸泡后把濕濾紙和玻璃紙交互重疊地放在培養(yǎng)皿中,借濾紙將玻璃紙隔開。然后進行濕熱滅菌,備用。2.

營養(yǎng)菌絲的觀察(1)用接種鏟連同培養(yǎng)基挑取細黃鏈霉菌菌苔置載玻片中央。(2)

用另一載玻片將其壓碎,棄去培養(yǎng)基,制成涂片,干燥,固定。(3)

用呂氏堿性美藍染液或石炭酸復紅染液染0.5-1分鐘,水洗。(4)

干燥后,用油鏡觀察營養(yǎng)菌絲的形態(tài)。3.

氣生菌絲與營養(yǎng)菌絲的比較觀察。(1)

將高氏Ⅰ號培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿,制成4mm左右的培養(yǎng)基平板,經(jīng)培養(yǎng)后無菌,備用。(2)

用火焰滅菌的鑷子將無菌蓋玻片以45度傾斜角插入平皿培養(yǎng)基瓊脂內(nèi),然后將細黃鏈霉菌的孢子懸液(濃度以稀釋10-2～10-3為好),接種在蓋玻片與平皿培養(yǎng)基的界面上。(3)

倒置于28℃培養(yǎng)4～5天后,小心的將蓋玻片取出,把有菌的一面朝上,放在載玻片上,置顯微鏡下進行觀察。一般情況是氣生菌絲顏色較深,并比營養(yǎng)菌絲粗二倍左右。4.

孢子絲及孢子的觀察(1)

將培養(yǎng)3～4天的細黃鏈霉菌的培養(yǎng)皿打開,放在顯微鏡低倍鏡下尋找菌落的邊緣,直接觀察氣生菌絲和孢子絲的形態(tài),注意分枝情況、卷曲情況等。(2)

取清潔的蓋玻片一塊,在菌落上面輕輕的按壓一下,然后將印有痕跡的一面朝下放在有一滴呂氏堿性美藍染液的載玻片上,將孢子等印浸在染液中,制成印片。用油鏡觀察孢子的形態(tài),孢子絲等。(3)

用小刀切取細黃鏈霉菌培養(yǎng)物一塊(帶培養(yǎng)基切下)。菌面朝上放在一載玻片上,另取一潔凈載玻片置火焰上微熱后,蓋在菌苔上,輕輕按壓,使培養(yǎng)物(氣絲、孢子絲或孢子)印在后一塊載玻片的中央,注意不要使培養(yǎng)物在玻片上滑動,否則印痕模糊不清。將制好的印片經(jīng)過火焰2-3次固定,用石炭酸復紅染色1min,水洗,晾干。用油鏡觀察孢子絲的形態(tài)及孢子排列情況。實驗報告:1．在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?2．玻璃紙培養(yǎng)和觀察法是否還可用于其它類型微生物的培養(yǎng)和觀察?為什么?繪圖說明你觀察到的放線菌的主要形態(tài)特征。實驗九細菌的芽胞染色實驗目的:學習細菌的芽胞染色法,初步了解芽孢桿菌的形態(tài)特征。實驗原理:細菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易著色,若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽胞呈無色透明狀)。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽胞染色法都基于同一個原則:除了用著色力強的染料外,還需要加熱,以促進芽胞著色。當染芽胞時,菌體也會著色,然后水洗,芽胞染上的顏色難以滲出,而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復染,使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色,因而能更明顯地襯托出芽胞,便于觀察。實驗器材1.菌種:培養(yǎng)36小時的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或者蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。2.溶液和試劑:5%孔雀綠水溶液,0.5%番紅水溶液。3.儀器或其它用具:小試管(75mm×10mm),燒杯(300mL),滴管,接種環(huán),擦鏡紙,鑷子,顯微鏡等。實驗內(nèi)容:1.改良的Schaeffer-Fulton氏染色法(1)制備菌懸液:加1—2滴無菌水于小試管中,用接種環(huán)從斜面上挑取2—3環(huán)的菌體于試管中并充分打勻,制成濃稠的菌液。(2)加染色液:加5%孔雀綠水溶液2—3滴于小試管中,用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。(3)加熱:將此試管浸于沸水浴的燒杯中,加熱15—20min。(4)涂片:用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上,做成涂面,晾干。(5)固定:將涂片經(jīng)過酒精燈火焰3次固定。(6)脫色:用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。(7)復染:加番紅染液染色2-3min后,傾去染色液,不用水洗,直接用吸水紙吸干。(8)鏡檢:先低倍,再高倍,最后用油鏡觀察。結果:芽胞呈綠色,芽胞囊和菌體為紅色。2.Schaeffer-Fulton氏染色法(1)涂片:按常規(guī)方法將待檢細菌制成涂片。(2)晾干固定:待涂片晾干后在酒精燈火焰上經(jīng)過2—3次固定。(3)染色:加數(shù)滴5%孔雀綠染液于涂片處,用木夾夾住載玻片一端,在微火上加熱至染液冒蒸汽并開始計算時間,維持5min。加熱過程中要隨時添加染色液,切勿讓標本干涸。待玻片冷卻后,用水輕輕地沖洗,直至流出的水無色為止。用番紅染液復染2min。(4)水洗:用緩水流洗后,吸干。(5)鏡檢:先低倍,再高倍,最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。。結果:芽胞呈綠色,芽胞囊和菌體為紅色。注意事項1.供芽胞染色用的菌種應控制菌齡。2.改良法在節(jié)約染料、簡化操作及提高標本質(zhì)量等方面都較常規(guī)涂片法優(yōu)越,可優(yōu)先使用。用改良法時,欲得到好的涂片,首先要制備濃稠的菌液,其次是從小試管中取染色的菌液時,應先用接種環(huán)充分攪拌,然后再挑取菌液,否則菌體沉于管底,涂片時菌體太少。實驗報告:1．繪出所用材料的芽胞和菌體的形態(tài)圖。2．說明芽胞染色法的原理。用簡單染色法能否觀察到細菌的芽孢?3．用Schaeffer-Fulton氏染色法加熱染色時,若因一時疏忽玻片上的染液被烘干,此時是否立即補加染液?為什么?4．若涂片上所觀察到的只是大量游離芽孢,很少看到芽孢囊及營養(yǎng)細胞,你認為這是什么原因?實驗十微生物菌種保藏實驗目的:1．了解菌種常規(guī)保藏方法的基本原理,掌握幾種常見的菌種保藏方法。2．理解冷凍干燥保藏菌種的原理,掌握冷凍干燥保藏菌種的方法。實驗原理:菌種是一種重要的生物資源,菌種保藏是重要的微生物基礎工作。菌種保藏就是利用一切條件使菌種不死、不衰、不變,以便于研究與應用。菌種保藏的方法很多,其原理卻大同小異,不外乎為優(yōu)良菌株創(chuàng)造一個適合長期休眠的環(huán)境,即干燥、低溫、缺乏氧氣和養(yǎng)料等。使微生物的代謝活動處于最低的狀態(tài),但又不至于死亡,從而達到保藏的目的。依據(jù)不同的菌種或不同的需求,應該選用不同的保藏方法。一般情況下,斜面保藏、半固體穿刺,石蠟油封存和砂土管保藏法較為常見,也比較容易制作。實驗器材:1.菌種:細菌、酵母菌、放線菌和霉菌。2．培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面(培養(yǎng)細菌),麥芽汁培養(yǎng)基斜面(培養(yǎng)酵母菌),高氏1號培養(yǎng)基斜面(培養(yǎng)放線菌),馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基斜面(培養(yǎng)絲狀真菌)。3.溶液或試劑:無菌水,液體石蠟,P2O5,脫脂奶,10%HCl,干冰,95%乙醇。4.儀器或其它用具:無菌試管,無菌吸管(1mL及5mL),無菌滴管,接種環(huán),40目及100目篩子,干燥器,安瓿管,冰箱,冷凍真空干燥裝置,酒精噴燈,三角燒瓶(250mL),瘦黃土(有機物含量少的黃土),食鹽、河沙。實驗內(nèi)容:下列各方法可根據(jù)實驗室具體條件與需要選做。(一)斜面?zhèn)鞔２胤╨