核酸印跡與分子雜交

分子生物學技術

高穎gaoying822@

核酸印跡技術與分子雜交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization

核酸分子雜交（nucleotidemolecularhybridization）以DNA的變性、復性為理論基礎；指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經(jīng)過復性處理后，形成異源雙鏈的過程。

Southern印跡（Southernblot）基本操作過程待測DNA樣品制備、基因探針標記；待測DNA樣品的電泳分離；電泳分離的DNA經(jīng)變性、轉移、固定到合適的固相支持物；特異性核酸探針與膜上DNA片段雜交，放射自顯影或顯色檢測目的DNA的存在。

Southernblot基本流程電泳 轉移雜交，顯影酶切DNA樣品上樣 DNA印跡重物Southern

blot關鍵步驟

待測DNA樣品的酶切消化基因組DNA進行消化，才能在電泳過程中將不同長短的DNA片段分離開。

基因探針的標記

探針序列和探針信號的選擇。要考慮特定基因的重復性、保守性和穩(wěn)定性?？捎猛凰睾头峭凰貥擞?。

Northern印跡（Northernblot）是將RNA從凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上，定性分析mRNA的常用方法。注意事項：RNA易被酶降解?？捎糜诜治龌蜣D錄水平的變化。Westernblot（蛋白免疫印跡）技術

是將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠中轉印到化學合成膜的支撐物上，利用特異性抗體進行反應，定性分析蛋白質。

用于分析基因表達(蛋白水平）的變化。原位分子雜交技術利用分子雜交技術來進行基因及其表達產(chǎn)物定位分析的一種技術。

組織、細胞或染色體的固定；探針；與探針結合的標記物；

可用于基因及其表達產(chǎn)物的定位分析。

聚合酶鏈式反應PolymeraseChainReaction

聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）是一種在體外特異地擴增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；1999年獲諾貝爾化學獎?？捎糜诜治龌蚣捌洚a(chǎn)物的水平變化；可進行實時、定量分析；

PCR體系模板引物耐熱DNA聚合酶dNTPs含Mg2+的緩沖液

PCR的過程變性(Denaturing)

95℃DNA模板變性成為單鏈，引物自身和引物間的局部雙鏈消除退火(Annealing)

引物與模板DNA雜交，Tm值減5℃延伸(Extension)

DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成ingPCR技術的工作原理17PC借R技術PC兵R分析灰已知講基因遠；反轉罷錄PC差R（re館ve謝rs歲e趴tr磁an泛sc選ri崇pt華io豆n隔PC捷R，RT翅-P賢CR）是將RN置A的反歪轉錄餅和PC晚R聯(lián)合切應用征的一堵種技燒術。RT牽-P憐CR是從涂組織把或細籃胞中烤獲得梯目的蛙基因甚及對畫已知陷序列墨的RN盞A進行黑定性代及半弦定量諒分析進的有脖效方偽法。RT協(xié)-P渡CR與PC延R區(qū)別模板少為mR扇NA需逆拜轉錄蠶酶產(chǎn)物部為cD喚NA19mRNA5AAAAAA(n)3mRNA5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5mRNA5cDNA3AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5oligo(dT)12-18反轉錄酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3cDNATTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5反轉桶錄合睡成cD訓NA實時損、定香量PC立R技術在PC揪R反應漁體系浙中加迷入熒光沙基團，利璃用熒日光信執(zhí)號積每累實谷時檢都測整屆個PC陽R進程曠。通辛過標猛準曲桿線對僚樣品堪中的DN陷A的起千始濃深度進予行定衡量的御方法午。特點掉：對DN忽A/奇RN怖A模板葵定量姿，靈策敏度代強，怕特異臭性高姻。21實時嫁、定懶量PC乳R技術QR3'3'5'5'上游居引物下游裹引物熒光蝦標記干引物RQ3'3'5'5'DN煮A序列醉測定DN包A盼Se范qu劈燕en劍ci承ngDN攔A序列塌分析頃方法雙脫耍氧鏈匯終止洗法利用2′，3省′-雙脫非氧核綢苷酸閉摻入勻中，終止媽化學焰反應化學紐奉裂解切法利用乞化學胃試劑巧裂解服修飾曬堿基招終止聚桌合反騎應戊羊糖（RNA）1′2′3′4′5′核糖(ribose)（DNA）脫氧核糖(deoxyribose)DN罪A的序胃列測濤定5′端3′端CGA26雙脫州氧鏈雁終止題法dADN以A自動浸測序用不注同熒光充分子箏標記局四種節(jié)雙脫即氧核農(nóng)苷酸，然蝕后進主行Sa纏ng胖er測序被反應出，反索應產(chǎn)寨物經(jīng)性電泳防分離漏后，巨通過蠅四種披激光酷激發(fā)個不同柜大小DN膜A片段控上的寇熒光淺分子獲使之潑發(fā)射炎出四貢種不妖同波哲長熒疫光，聲檢測宜器采尾集熒裁光信圣號，甩并依牲此確江定DN繼A堿基篩的排建列順辭序。DN滲A序列鮮自動療分析dd貿G紅dd叼Tdd舉A綠dd導C藍橙毛細墊管電雅泳熒光由標記DN憤A合成測序眼結果撕展示DN木A自動愈測序化結果嫁舉例DN櫻A序列堡分析纏可以抄揭示債基因太和基因測組一級飄結構變化通過DN泊A序列下分析酸可以車鑒定區(qū)基因澡和基可因組采的變話異通過DN賠A序列檢測定里分析拴人工腫重組魚的基燙因通過DN景A序列本測定鼠對定后點突筍變進葛行確柜認DN墾A芯片職技術DN期A范Ch有ip何T左ec嚼hn乳ol佩og賀ie婆sDN醉A芯片（DN莫A沉ch信ip）也稱DN芝A微陣執(zhí)列(D葡NAmi匪cr練oa螺rr勤ay)在固妻相支傾持物下上有翠序固貧化寡狂核苷藝酸或DN黑A探針開，與傲待測從熒光趟標記恭樣品鄙進行肚雜交烤；通過好對雜亮交信渣號的勵檢測強、比層較和澡分析肅，得憂出樣嗚品的進遺傳諒信息運；包括cD睡NA芯片秀和寡剪核苷燃酸微侍陣列基因賺芯片府工作傭流程DN掛A芯片裁技術cD訊NA芯片探針軋是cD臭NA片段胡，可旺以同濱任何預具有扎同源細序列章的樣泥品形筑成雜旬交體封，同吐時定捎量監(jiān)逢測大貍量基脫因的鍬表達誘。寡核役苷酸砍芯片基因哨特異鞋的寡影核苷冤酸片欠段為探探針窗，對胡低豐肝度基陸因表民達水裕平變替化的狗檢測抖具有便高度雙靈敏任性。可進因行高負通量員基因男轉錄石活性移的分倚析DN要A芯片協(xié)技術筐的特帶點快速、高效、敏感、平行絹化、自動立化。通過檔芯片伐技術同篩選緞得到束的表造達信散息還燒要用Nor芽th蝕er朱n數(shù)bl墾ot或定水量RT激-P俯CR進行易驗證DN陶A芯片眼技術臂的應化用腫瘤爆基因努表達邁譜的拒差異繞研究適；基因芒多態(tài)何性分頸析；微生鋤物篩稅選鑒丸定；遺傳早病產(chǎn)峽前診膝斷等蛋白俊質芯疏片和幫組織跟芯片蛋白套質芯倉片蛋白歇質檢售測芯群片蛋白車質功辦能芯批片組織姨芯片是以柔形態(tài)沙學為暗基礎育進行學高通椅量檢撞測基誦因表圓達信埋息的零芯片捕技術蛋白藏質芯湖片技術獄優(yōu)勢在蛋脊白質村結構、功能岔和相響互作筑用，收以及疾病衫發(fā)展丘過程件中蛋溪白表艘達譜坐差異錄研究旋等方面。在臨要床醫(yī)撈學研錫究中從，利阻用蛋攻白質變芯片柱技術尋撕找新咳的腫瘤泰標記蹈物，各霸種