細(xì)胞生物學(xué)課件 3 細(xì)胞生物學(xué)的研究方法-2014

2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity第三章細(xì)胞生物學(xué)的研究方法王紅勝

副教授中山大學(xué)藥學(xué)院,212室Tel-mail:whongsh@本章內(nèi)容顯微鏡技術(shù)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)細(xì)胞組分的分離和純化技術(shù)(自學(xué)）細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞內(nèi)分子示蹤技術(shù)(自學(xué)）細(xì)胞功能基因組學(xué)研究技術(shù)(自學(xué)）生物大分子結(jié)構(gòu)測定(自學(xué)）第一節(jié)、顯微鏡技術(shù)2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity細(xì)胞的大小和計量單位鴕鳥卵=12-15cm人卵細(xì)胞=0.1mm多數(shù)細(xì)胞=10-30μm血細(xì)胞=7μm

顯微鏡觀察范圍肉眼觀察范圍

（一）普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)(lightmicroscopy,LM)1.構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡放大成虛像一、分辨率可達0.2μm的光學(xué)顯微鏡技術(shù)2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity1.分辨率(resolusion)：區(qū)分兩個質(zhì)點間的最小距離。其中:N=標(biāo)本和物鏡之間介質(zhì)折射率;λ=入射光線波長；

α=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）nsinα/2稱為物鏡的數(shù)值孔徑(numericalaperature,NA)R=0.61λ/NA思考題：如何提高顯微鏡的分辨能力？0.61λ分辨率DN.sinα/2=顯微鏡的幾個光學(xué)特點：制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長為400~700nm，分辨力數(shù)值不會小于0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大設(shè)計倍數(shù)為1000X。3.組織切片的制備固定(fixation)：使大分子交聯(lián)而保持在原有的位置上，防止移位或信息丟失。常用的固定劑：戊二醛、甲醛包埋(embedding):

使組織形成硬塊，便于切片。常用的包埋劑：石蠟、樹脂切片(section)：切片厚度：1~10μm染色(staining)：增大反差。2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity正置光學(xué)顯微鏡倒置顯微鏡光路系統(tǒng)（二）熒光顯微鏡技術(shù)1.熒光和熒光染料熒光：熒光分子可在吸收特定波長的光后，發(fā)射出更長波長的可見光，稱為熒光。前者稱激發(fā)光(excitationlight)，后者稱發(fā)射光(emmissionlight)。熒光染料：由于熒光分子可以使被檢樣品呈現(xiàn)不同的顏色，因此也稱熒光染料。細(xì)胞內(nèi)某些天然物質(zhì)，如葉綠素就是熒光分子一些細(xì)胞成分雖不是熒光分子，但可用熒光分子對其進行染色或標(biāo)記，應(yīng)用廣：吖啶橙能對DNA和RNA同時染色，顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色，RNA呈紅色與抗體共價結(jié)合的熒光分子，可用來特異性檢測細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)特定的抗原熒光染料2.熒光顯微鏡的工作原理結(jié)構(gòu)特點：光源：高壓汞燈和弧光兩組濾光片(右圖)1.第一個濾光片：僅讓波長在450~490nm的藍光通過；2.分光鏡：510nm以下的光反射，510nm以上的光通過；3.第二個濾光片：阻斷不需要的熒光信號，使波長在520~560nm特異的綠色熒光通過。光源熒光顯微鏡在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）相差顯微鏡技術(shù)把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處：環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。與普通顯微鏡的差別在于：用環(huán)形光闌替代可變光闌，用帶相位板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。直接觀測活細(xì)胞活細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)清晰可見的明暗對比，如觀測培養(yǎng)的細(xì)胞的倒置相差顯微鏡。（四）暗視野顯微鏡技術(shù)

darkfieldmicroscope原理：通過散射光成像聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的?？捎^察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。適合觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體，液體介質(zhì)中的細(xì)菌、真菌等觀察物體輪廓（五）顯微電影攝影技術(shù)計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下記錄活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運動過程。

（六）激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM

排除焦平面以外光的干擾，只有從標(biāo)本焦面發(fā)出的光線聚焦成像。增強圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。原理：用單色激光作光源；共聚焦：物鏡和激光鏡相互共焦點，只有從標(biāo)本焦面發(fā)出的光線可以聚焦成像，而焦面以外的漫射光不參加成像；逐點、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)激光共聚焦掃描顯微鏡光源：電子束：10萬伏特電壓加速);波長短：0.004nm。分辨率：理論值：0.002nm實際值：0.1nm。金屬材料可達0.2nm生物樣品：2nm(樣本制備、反差、照相損傷)電子顯微鏡下觀察到的結(jié)構(gòu)——超微結(jié)構(gòu)

二、電子顯微鏡技術(shù)2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity

分辨率

D=0.61λ/N.Sin(/2)N=1,Sin180/2=1

λ越小分辨率越高

人們尋找更短波長的照明物質(zhì)以提高分辨率

光學(xué)顯微鏡的分辨率在理論上不能小于0.2nm,這是因為受光波波長的局限,即可見光的波長不能小400nm。

電鏡是利用電子束對樣品放大成像的顯微鏡，電子束波長為0.01-0.9nm，因而分辨率大大提高。

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電鏡與光鏡的比較2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity電鏡的類型透射電鏡TEM（TransmissionElectronMicroscope）：內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察掃描電鏡SEM（ScanningElectronMicroscope）：外部形態(tài)觀察掃描透射電鏡STEM（ScanningTransmissionElectronMicroscope）外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察超高壓透射電鏡（Ultra-voltageTransmissionElectronMicroscope）：活體觀察(一）透射電子顯微鏡

transmissionelectronmicroscope,TEM

原理以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2μm）。2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity不同光線的波長電鏡與光鏡光路圖比較2010-11中山大學(xué)藥學(xué)院鐘翎362、制樣技術(shù)雙重固定：通常以鋨酸(脂類)和戊二醛(蛋白)固定樣品；脫水：丙酮逐級脫水，含水標(biāo)本干擾觀察；包埋：環(huán)氧樹脂包埋；切片：超薄切片，僅50nm，用超薄切片機（ultramicrotome）制作，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片；染色：重金屬（鈾、鉛）鹽染色。2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity2.負(fù)染色(negativeStaining)和投影(shadowcasting)技術(shù)

2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity(1)負(fù)染色:使整個載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽,而凸出的樣品則沒有染料.(2)投影技術(shù):又叫噴鍍技術(shù),增強背景和待觀察樣品反差.2010-11中山大學(xué)藥學(xué)院鐘翎39透射電鏡借助金屬投影、冰凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)獲取三維圖像金屬投影法(metalshadowing)原理：以一定的傾斜角度向樣品表面噴射重金屬，顯示投影效果，給出樣品表面三維結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用：觀察核酸、蛋白質(zhì)大分子，病毒顆粒及細(xì)胞壁。NegativeStainedArchaebacteria冰凍斷裂freeze-fracture樣品制備：標(biāo)本快速冷凍→冰刀從脂雙層疏水部分撬開→暴露膜內(nèi)部構(gòu)造斷面結(jié)構(gòu)。應(yīng)用：觀察細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的內(nèi)部構(gòu)造冰凍蝕刻(freeze-etch)樣品制備：冰凍組織→冰刀撬組織→真空升華→暴露膜結(jié)構(gòu)應(yīng)用：觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)斷面的三種處理方法：蝕刻（etching）、不蝕刻（noetching）、深度蝕刻（deepetching）培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示網(wǎng)格蛋白(Clathrin)衣被

（二）掃描電子顯微鏡

Scanningelectronmicroscope（SEM）20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。觀察標(biāo)本表面分辯率3－10nm，用于細(xì)胞整體或組織的觀察。電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。Scanningelectronmicroscope（SEM）是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。工作原理SEMLightPathway2010-11中山大學(xué)藥學(xué)院鐘翎49人類紅細(xì)胞三、納米顯微技術(shù)納米尺度：1~100nm生命是納米尺度的分子活動，細(xì)胞是納米組裝機的集合體掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡的分辨率和可操控的顆粒再納米水平，被稱為納米顯微技術(shù)1.掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscaope,STM)原理：使用原子尺度的探針，在標(biāo)本的表面進行掃描，在探針針尖和樣品間施加一定電壓，產(chǎn)生隨標(biāo)本表面形貌變化的隧道電流特點：分辨率高，可在大氣和液態(tài)等非真空狀態(tài)下工作應(yīng)用：直接觀察大分子的三維結(jié)構(gòu)，如DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)2.原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)原理：通過分析探針針尖與樣品間原子間作用力，來獲取觀察表面的微觀信息特點：可以在固態(tài)，液態(tài)和氣態(tài)下工作應(yīng)用：活細(xì)胞表面和生物大分子空間伸展及其晶體表面觀測，進行單個分子操作。2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的接觸式AFM形貌圖未加入TNFα20ng/mLTNFα第二節(jié)、細(xì)胞的分離與培養(yǎng)2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity離心(差速，密度梯度)流式細(xì)胞術(shù)免疫磁珠法激光捕獲顯微切割技術(shù)一、分離不同類型細(xì)胞(一)離心技術(shù)是分離細(xì)胞器及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機稱為高速離心機。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機。超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg。從組織中分離細(xì)胞的第一步：將組織制備成游離的細(xì)胞懸液胰蛋白酶，膠原酶

EDTA消除細(xì)胞間的連接和細(xì)胞外基質(zhì)1.差速離心Differentialcentrifugation特點：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核→線粒體→溶酶體與過氧化物酶體→內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體→核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。2010-11中山大學(xué)藥學(xué)院鐘翎58LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation2.密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）pH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細(xì)胞無毒。(二)流式細(xì)胞術(shù)用途：流式細(xì)胞儀(flowcytometer)：從多細(xì)胞懸液中分離目的細(xì)胞的精密儀器對單個細(xì)胞進行快速定量分析與分選

的一門技術(shù)。61原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群;樣品處理：用帶有熒光的抗體標(biāo)記待分離的細(xì)胞；分離速度：2萬個細(xì)胞/s；分離純度：>95%。(三)免疫磁珠法原理：帶有特定抗體的免疫磁珠(immunomagneticmicrosphere)與靶細(xì)胞的特異結(jié)合，快速地從多細(xì)胞懸液中將目的細(xì)胞分離出來。分離純度：95~99%(四)激光捕獲顯微切割技術(shù)(LaserCaptureMicrodissection,LCM)原理：在載玻片上制作冰凍或石蠟切片并染色，在顯微鏡下將切片覆以特制的透明薄膜，用能量較低的紅外激光切割所需要的組織細(xì)胞，甚至單個細(xì)胞，覆膜在激光束經(jīng)過的地方被融化，并與下面的細(xì)胞結(jié)合，再用另一束激光束將其彈出到細(xì)胞收集管。應(yīng)用：可用于生化與基因組分析研究；該方法將形態(tài)學(xué)觀察與分子水平研究結(jié)合起來，特別適用于數(shù)量少或散在分布的細(xì)胞的分類研究二、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)：從機體中取出組織或細(xì)胞，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存、生長和增殖的方法1.條件

(1)營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：RPMI-1640，DMEM血清

(2)5%CO2(3)無菌環(huán)境培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備原代培養(yǎng)(primaryculture)：直接取材于有機體組織的培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)(secondaryculture)：原代培養(yǎng)的細(xì)胞，再經(jīng)1：2以上的比例的擴大培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞常表現(xiàn)出其來源組織的分化特性Hela細(xì)胞CHO細(xì)胞2.原代和傳代培養(yǎng)3.細(xì)胞系細(xì)胞系(cellline)：在培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生不死的變異細(xì)胞，這種細(xì)胞可以無限地繁殖、傳代來源：包括培養(yǎng)過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞和取材于腫瘤組織的原代培養(yǎng)細(xì)胞；細(xì)胞株(cellstrain)：用細(xì)胞克隆化的方法進一步改善細(xì)胞的均一性，即分離出單個細(xì)胞使其增殖形成的細(xì)胞群細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞HenriettaLacksBHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國地鼠實驗室中常用的幾種細(xì)胞系4.細(xì)胞融合細(xì)胞融合(cellfusion)：在自然或人工條件下，使兩個或兩個以上的細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞的過程；誘導(dǎo)方法：生物法：滅火的仙臺病毒化學(xué)法：聚乙二醇PEG物理法：電融法細(xì)胞融合時首先形成雙核或多核的異核體(heterokaryon)，通過有絲分裂，形成雜交細(xì)胞

(hybridcell);應(yīng)用：單克隆抗體制備5.胚胎干細(xì)胞干細(xì)胞(embryonicstemcell,ES細(xì)胞)：具有自我更新和分化潛能的未成熟的細(xì)胞。培養(yǎng)條件：常用培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞層：阻斷有絲分裂后的單層成纖維細(xì)胞。分泌各種因子促ES細(xì)胞增殖、抑制ES細(xì)胞分化。條件培養(yǎng)基生長特點：克隆狀生長，細(xì)胞界限不清細(xì)胞鑒定：細(xì)胞形態(tài)特征不明顯。標(biāo)志酶(堿性磷酸酶)、抗原或分化能力干細(xì)胞的類型干細(xì)胞來源分化潛能全能干細(xì)胞totipotent多能干細(xì)胞Multipotent/pluripotent專能干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞embryonicstemcell成體干細(xì)胞adultstemcell2010-11中山大學(xué)藥學(xué)院鐘翎74第三節(jié)、細(xì)胞組分的分離和純化技術(shù)2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity

原理：利用顆粒大小的不同:差速離心法速度區(qū)帶離心法利用顆粒密度的不同:等密度離心法一、細(xì)胞組分的分級分離1、差速離心法：用于分離大小、形狀不同顯著的組分，根據(jù)顆粒沉降速度不同得以分離2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity2、速度沉降分離沉降系數(shù)不同的顆粒：用于分離大小差別不顯著的組分2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity3平衡沉降分離密度不同的顆粒：根據(jù)被分離物質(zhì)的浮力密度差別進行分離，所用的介質(zhì)起始密度約等于被分離物質(zhì)的密度，介質(zhì)在離心過程中形成密度梯度，被分離物質(zhì)沉降或上浮到達與之密度相等的介質(zhì)區(qū)域中停留并形成區(qū)帶。2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity二、層析1、紙層析二、層析2、柱層析2、柱層析常用方法：離子交換層析凝膠過濾層析親和層析三、蛋白質(zhì)電泳1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）電泳（electrophoresis）:在含有蛋白質(zhì)分子的溶液里加上電場，蛋白質(zhì)就會按照它的凈電荷、大小和形狀，以一定的速度在電場中移動，這一技術(shù)叫電泳。2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity三、蛋白質(zhì)電泳2、

雙向電泳目的：單向SDS－PAGE電泳分辨力差，只能分開50左右種的蛋白。雙向電泳可分辨1000種以上的蛋白質(zhì)，一般為2000～15000種。2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity以下材料課后自學(xué)基因研究的各種方法王紅勝,講師中山大學(xué)藥學(xué)院,212室Tel-mail:whongsh@Northernblotting

關(guān)鍵點：DNA探針，

標(biāo)記試劑盒（同位素和

非同位素）；設(shè)內(nèi)標(biāo)；

優(yōu)點：特異性和敏感性高

缺點：實驗繁瑣，同位素

基因水平的檢測同位素標(biāo)記細(xì)胞中的受體基因表達水平RT-PCR：（reversetranscription-polymerase

chainreaction)

RT-PCR主要由兩大步驟組成，一是反轉(zhuǎn)錄（RT），二是PCR。它與普通PCR的區(qū)別就在于它是以mRNA為最初始的模板。RT-PCR的用途很廣泛，既可以用來構(gòu)建cDNA文庫，也可以獲得感興趣的基因的cDNA序列。如果以內(nèi)源的一些參照為標(biāo)準(zhǔn)，還可以用于研究細(xì)胞內(nèi)特定基因的mRNA的表達水平。關(guān)鍵點：mRNA，相關(guān)引物，

PCR儀不足：只能相對定量，不能絕對定量Real-timePCR

實時定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的基因定量檢測技術(shù)，它通過PCR擴增中Tag酶的5’－3’的核酸外切酶活性，可以將標(biāo)記在探針上的熒光基團一淬滅基團分離，使熒光基團脫離淬滅基團的控制，從而產(chǎn)生熒光發(fā)射。通過熒光吸收裝置檢測發(fā)出熒光的多少來反映模板量的高低，從而達到實時定量的目的。關(guān)鍵點：引物設(shè)計，real-timePCR儀倍數(shù)差2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity原位雜交定位基因的表達1，組織/細(xì)胞固定脫水石蠟包埋切片2，DNA探針的制備（地高辛或同位素標(biāo)記）3，探針標(biāo)記mRNA顯示mRNA4，顯微鏡觀察關(guān)鍵點：相應(yīng)的DNA探針；地高辛試劑盒或同位素，切片機；對照組的設(shè)置對照組實驗組KAI1RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)者獲得諾貝爾獎；RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是一種可以在細(xì)胞內(nèi)抑制特定基因表達的現(xiàn)象。它由雙鏈RNA產(chǎn)生，可以特異性地降解具有相同或者相似序列的RNA（包括mRNA）。它是一種比反義技術(shù)更為有效的方法，具有更高的特異性。關(guān)鍵點：確定19－21寡核苷酸（一條基因上有許多條候選寡核苷酸），cDNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的試劑盒（效果好但價格貴），或表達載體p-Super,轉(zhuǎn)染試劑盒；要設(shè)置好對照（不相關(guān)的序列）不足：干擾不夠穩(wěn)定、不完全，不能長時間作用熒光酶基因（Luc）是從螢火蟲cDNA文庫中克隆的哺乳動物細(xì)胞和組織沒有任何內(nèi)源性熒光素酶活力，所以Luc可作為非常靈敏的遺傳報告基因熒光酶報告基因具有檢測速度快、靈敏度高、費用低、用途廣、可定量等優(yōu)點基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測

（熒光素酶檢測方法）基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測

（熒光素酶檢測方法）關(guān)鍵點：Luciferase-報告基因，表達載體，-gal,轉(zhuǎn)染效率，熒光檢測儀基因芯片分析設(shè)置好對照組，取樣（mRNA）由公司測定，提供基因檢測結(jié)果（根據(jù)細(xì)胞功能分類）排除變化相同的基因確定變化差異的基因選擇感興趣的基因進一步證實它們的變化該方法特別適合用于信號通路中新的下游靶基因的發(fā)現(xiàn)蛋白研究的各種方法

Westernblotting

關(guān)鍵點：相應(yīng)的抗體；ECL顯示試劑；設(shè)內(nèi)標(biāo)；

不同抗體差別很大：用量、效果、特異性

使用的電泳膠的濃度與蛋白的分子量密切相關(guān)

（反比關(guān)系）

優(yōu)點：可用于定量分析蛋白表達水平的檢測蛋白半衰期CHX(cycloheximide)放線菌酮有的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短CHX的作用是抑制新蛋白的合成2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity免疫組織化學(xué)方法顯示蛋白1，組織/細(xì)胞固定脫水石蠟包埋切片2，免疫組化染色3，顯微鏡觀察關(guān)鍵點：相應(yīng)的抗體；切片機；對照組的設(shè)置對照組實驗組蛋白的相互作用和

蛋白與DNA的結(jié)合分析免疫沉淀/免疫印跡(Co-IP)

Immunoprecipitation/Westernblot用特異性抗體結(jié)合細(xì)胞裂解液中的某個目的蛋白質(zhì)（即免疫沉淀），洗滌后解離特異性抗體和目的蛋白質(zhì)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），最后用Westernblot分析顯示另一個目的蛋白質(zhì)。這種方法可以分析溶液中、細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白，但只能是定性或半定量的實驗。BIAcore生物分子相互作用分析（BiomolecularInteractionAnalysis）

基于表面等離子體共振（SPR）來實時跟蹤生物分子間的相互作用的技術(shù)。被廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞。具有高天然性、高效率、高靈敏度、樣品量少、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點，但儀器昂貴、不易操作、價格高。凝膠阻抑實驗

（Gelretardationassay）

當(dāng)DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)的DNA片段或寡核苷酸結(jié)合而形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物后，使DNA片段的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常較游離的DNA片段的泳動速率慢得多，在X光膠片上形成一較游離DNA片段滯后的帶型。

實驗過程：DNA片段(probe)進行末端標(biāo)記（同位素、生物素或熒光）probe與核蛋白孵育電泳干膠曝光染色質(zhì)免疫共沉淀

（ChIP）利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測體內(nèi)蛋白與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。ChIP與其他方法的結(jié)合，擴大了其應(yīng)用范圍：

CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip

方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達調(diào)控中的作用。DNAaffinitypurificationassay（DAPA）合成擬分析的DNA片段，在DNA片段的末端接上biotin作為探針與核蛋白孵育，再與能耦合生物素的瓊脂糖珠子免疫沉淀，最后利用westernblot的方式分析，從而獲得與DNA探針相互作用的蛋白質(zhì)信息。蛋白標(biāo)記和定位熒光顯微鏡技術(shù)不同熒光素的激發(fā)光波長范圍是不同的，所以同一樣品可以同時用兩種以上的熒光素標(biāo)記。標(biāo)記熒光素的樣品在熒光顯微鏡下經(jīng)過不同波長的激發(fā)光激發(fā)，可以發(fā)射出不同顏色的熒光。熒光顯微鏡中只有激發(fā)熒光可以成象，因為產(chǎn)生激發(fā)光的光全被樣品與照相機之間的濾光片吸收。關(guān)鍵點：相應(yīng)的抗體；熒光染料；熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡技術(shù)

采用激光做光源,激光束經(jīng)照明針孔,由分光鏡反射至物鏡并聚焦于樣品上,對標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點進行掃描,然后,激發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡,通過探測針孔時先聚焦,聚焦后的光被光電倍增管探測收集,并將信號輸送到計算機,在顯示屏上顯示圖像。優(yōu)點：分辨率高，可以實時跟蹤觀察光漂白后熒光恢復(fù)(FRAP)光漂白后熒光恢復(fù):就是在光漂白后對樣本確定區(qū)中的熒光恢復(fù)。FRAP是由沒有漂白的熒光團從周圍進入漂白區(qū)的運動引起的。FRAP用于測量2-維或3-維分子運動的力度。分子運動包括膜或活細(xì)胞內(nèi)用熒光標(biāo)明的分子的擴散、轉(zhuǎn)移或其他類型的運動。光漂白中的熒光損失(FLIP)光漂白中的熒光損失：是一個鄰近重復(fù)漂白區(qū)的被定義區(qū)域內(nèi)熒光的減少或消失。與FRAP一樣，F(xiàn)LIP被用來測量膜或活細(xì)胞內(nèi)分子運動的力度。細(xì)胞異體融合通過誘導(dǎo)融合劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合。目前比較有效的融合劑是高pH，高Ca，和聚乙二醇PEG。最常用的兩種細(xì)胞融合：NIH3T3,HeLa研究過程需要用CHX，以抑制新的蛋白合成小鼠成纖維細(xì)胞:NIH3T3人宮頸癌細(xì)胞:HeLa相差顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡最主要的不同點是在物鏡后面安裝一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起了放大的作用。最后，這兩組光線經(jīng)過透鏡又會聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象，從而表現(xiàn)出肉眼明顯可見的明暗區(qū)別。最大優(yōu)點：樣品無需染色，可以觀察活細(xì)胞流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用

細(xì)胞分選

周期、凋亡測定

細(xì)胞表面蛋白定量

DNA滲入量測定

線粒體膜電位測定

流式細(xì)胞術(shù)定量分析

細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期DAPI染色細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析可用于分選細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)直接定量分析

細(xì)胞存活率PI（碘化丙啶）染色細(xì)胞，不能透過活細(xì)胞膜，但可以結(jié)合到死細(xì)胞的DNA碎片上。所以細(xì)胞表現(xiàn)出不同的熒光值。流式細(xì)胞術(shù)定量蛋白表達量限制：僅用于膜蛋白含量的檢測。關(guān)鍵點：抗體，相應(yīng)的熒光素標(biāo)記的二抗；流式細(xì)胞儀。蛋白表達量以面積表示。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中

DNA合成量(BrdU法)JC－1是一種碳氰化合物類陽離子熒光染料，具有電勢依賴性積聚于線粒體內(nèi)膜的特性。它在線粒體上以單體和聚合體兩種不同的物理形式存在。JC－1特異地與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，只在線粒體膜電位崩解的時候才釋放出來，因此，檢驗結(jié)果可靠，敏感性高。熒光探針JC-1檢測線粒體膜電位蛋白結(jié)構(gòu)的分析利用Edman降解法直接測定蛋白質(zhì)分子中的肽段序列，并拼接出蛋白質(zhì)分子的全序列。根據(jù)蛋白質(zhì)的cDNA序列的測定，推斷出蛋白質(zhì)分子的序列。質(zhì)譜分析：通過酶解產(chǎn)生肽段片段，通過質(zhì)譜儀分析肽指紋圖譜，從而獲得氨基酸序列，再與網(wǎng)上蛋白庫匹配，來確定是已知還是未知蛋白。

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定方法生物質(zhì)譜檢測制備技術(shù)2D膠電泳－切膠－脫色－脫水－還原－烷基化－洗膠－脫水－泡漲－脫水－重泡漲－酶切－萃取－干燥－質(zhì)譜分析主要國際互聯(lián)網(wǎng)上的免費蛋白數(shù)據(jù)庫檢索程序，網(wǎng)址如下:

MascotMS-Fit:/htmlucsf3.0/msfit.htmPeptident:http://wwww.expasy.ch/tools/peptidennt.htmlPeptideSearch:

http://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch

數(shù)據(jù)庫檢索網(wǎng)址

蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定方法

X射線衍射方法測定蛋白質(zhì)分子的晶體結(jié)構(gòu)。二維核磁共振技術(shù)測定蛋白質(zhì)分子在溶液中的結(jié)構(gòu)。用于測定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)相對變化和變化速度的方法有：熒光滴定技術(shù)，紫外差吸收，園二色光譜，紅外光譜，Raman光譜，脲梯度電泳，各種反應(yīng)基團的暴露。核磁共振儀分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

核磁共振圖譜2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity計算方程：

lg(Fo/F-1)=lgKA+nlg[Q]；其中：

Fo，F(xiàn)分別為蛋白質(zhì)與藥物作用前后的熒光強度；

[Q]為藥物濃度；KA為結(jié)合常數(shù)。以lg(Fo/F-1)對lg[Q]作圖，可求得藥物與蛋白分子的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。熒光滴定方法分析小分子化合物

與蛋白的結(jié)合關(guān)鍵點：熒光分光光度計純化蛋白（能夠自發(fā)熒光，脯氨酸、色氨酸基團）蛋白質(zhì)相互作用儀Cell,virus,bacteria,protein,DNAandsmallmolecular;antibody-antigen,receptor-ligand,DNA-DNA,DNA-protein,protein-smallmolecularetc.

全自動，高通量，實時檢測，快速分析生物分子之間的相互作用;相互作用分析包括：分子結(jié)合定量分析,動力學(xué)和親和性分析，結(jié)合能力和協(xié)同性分析（結(jié)合速率Ka，解離速率Kd，結(jié)合常數(shù)KD）不用對樣品作任何標(biāo)記和修飾

圓二色譜分析蛋白構(gòu)象改變

旋光值計算：分子對接模擬預(yù)測化合物與蛋白結(jié)合的模型Kd=1.68MKd:ND分析超離方法檢測化合物與蛋白的相互作用原子力顯微鏡(AFM)優(yōu)點：1)原子力顯微鏡作為掃描探針顯微鏡的一種，可觀察生物形態(tài)結(jié)構(gòu)。2）利用AFM,可使得細(xì)胞及生物大分子在生理溶液的條件下成像。AFM對于生物系統(tǒng)的成像分析比光學(xué)顯微鏡具有更高的分辨率（大約可以到1nm），比電鏡觀察所需要的樣品處理更接近于生理條件，并且比光譜學(xué)技術(shù)（通常需要從大量光譜信號中間接推導(dǎo)出結(jié)構(gòu)信息）更直觀。而相對于晶體學(xué)方法來說，AFM分析不需要依靠于晶體樣品，這非常有利于研究天然狀態(tài)下的生物樣品。蛋白修飾泛素化(ubiquitination)類泛素化(sumoylation)甲基化(methylation)乙酰化(acetylation)磷酸化(phosphorylation)……………研究的必要性和重要性

蛋白質(zhì)是基因功能的實施者，蛋白質(zhì)的定位、翻譯后修飾及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用決定了蛋白質(zhì)的功能，也為研究細(xì)胞生長，分化和凋亡及重大疾病發(fā)生和發(fā)展提供了基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的功能與其空間定位有著密切的相關(guān)，且通過在不同亞細(xì)胞環(huán)境里的轉(zhuǎn)位而發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對蛋白質(zhì)發(fā)揮正常功能具有重要作用，經(jīng)過特殊修飾的蛋白質(zhì)通?？啥ㄎ辉谔囟ǖ奈恢?，與特異的蛋白質(zhì)相互作用，行使特殊的功能。蛋白質(zhì)通過動態(tài)相互作用，形成大的復(fù)合體，在特定的時間和空間中完成特定的功能，這其中也發(fā)生特定的蛋白質(zhì)修飾。因此，只有系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的定位、翻譯后修飾及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的規(guī)律，才能從真正意義上闡明一個蛋白質(zhì)的功能，才有可能研究細(xì)胞中某一生理活動中相關(guān)功能蛋白質(zhì)的作用及機制。泛素化蛋白降解的系統(tǒng)

溶酶體蛋白溶解系統(tǒng)非溶酶體蛋白溶解系統(tǒng)

泛素—蛋白酶系統(tǒng)鈣依賴性的蛋白溶解系統(tǒng)

泛素、26s蛋白酶體、酶系統(tǒng)(E1、E2、E3、E4、泛素C—末端水解酶)

普遍存在于原核生物和真核生物細(xì)胞中，是真核細(xì)胞內(nèi)最重要的非溶酶體性的蛋白溶解系統(tǒng)主要功能是降解機體正常情況下特別是應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的異常細(xì)胞漿內(nèi)短壽命蛋白質(zhì)，包括一些重要的調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和信號轉(zhuǎn)錄因子等。

（特異性低）（特異性高）泛素

泛素是一種小蛋白，只有76個氨基酸（MW8.6KD）。目前發(fā)現(xiàn)所有生物的泛素都是由氨基酸編碼的，而且序列相當(dāng)保守。比較人與酵母的泛素序列，只有3個氨基酸不同。泛素的二級結(jié)構(gòu)包括了5個β-折疊，3-5個α螺旋及7個反螺旋，其外觀是一個緊密壓縮的球狀蛋白質(zhì)，從球體的表面伸出4個C-末端殘基，作為泛素化蛋白質(zhì)的結(jié)合位點.

泛素肽鏈中約70%由氫鍵組成，決定了它的熱穩(wěn)定特性及耐受寬范圍的pH值。泛素的功能位點是C-末端，用以結(jié)合蛋白質(zhì)，而其Lys-48則作為其它泛素的結(jié)合位點，用以形成泛素鏈。

甘氨酸殘基C-末端殘基Positivecharged酶系統(tǒng)

泛素-激活酶（Ubiquitin-ActivatingEnzyme,E1）：在人類僅發(fā)現(xiàn)一種，主要功能是激活泛素;

泛素-結(jié)合酶(Ubiquitin-ConjugatingEnzyme,E2)：分子量較小，都有一個UBC結(jié)構(gòu)域，可特異識別泛素，并與泛素結(jié)合，同時還具有識別E3的功能;

泛素-蛋白連接酶(Ubiquitin-ProtinLigases,E3)：一類大分子蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要作用是特異識別靶蛋白，并將其傳遞給蛋白酶體降解;

泛素鏈組裝因子(UbiquitinChian-AssemblyFactor,E4)：結(jié)合泛素并催化E1、E2、和E3的組裝,對多聚泛素鏈的延長起重要作用。

2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity泛素C末端水解酶（UCHs）UCHs多為含巰基蛋白酶，分子量大小不等，能特異識別泛素C末端區(qū)域，解離泛素與靶蛋白的結(jié)合,促進泛素再循環(huán)，所以對泛素系統(tǒng)的正常運行很必要。

蛋白酶體（26s）包括一個20s的中心顆粒和一個19s的調(diào)節(jié)顆粒，在20s顆粒中心由七個亞基的四個環(huán)組成一個中空室。α亞基主要用于底物識別，β亞基主要參與底物降解。蛋白酶體泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用途徑

Westernblotting

顯示泛素化帶型類泛素化Sumoylation2023/5/22WanghsSunYat-senUniversitySUMO化蛋白

SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)是一種小的泛素相關(guān)修飾蛋白，它與泛素在序列上雖只有18％相同，但在二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)上有驚人的相似。

SUMO化（sumoylation）的功能與泛素化(ubiquitination)不同，它并不使蛋白降解，反而加強它們的穩(wěn)定性或調(diào)節(jié)它們在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布.SUMO家族成員包括SUMO-1，SUMO-2，SUMO-3。它們廣泛存在于原生動物、后生動物、植物和真菌中，顯示了SUMO在進化上的保守性。

SUMO家族成員都有獨特的N端氨基酸序列和碳端外延序列。在所有的SUMO家族成員中，甘氨酸－甘氨酸殘基對SUMO結(jié)合是必須的。

2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity

SUMO-1的三級結(jié)構(gòu)包括一個與泛素同源區(qū)域（氨基酸序列22－97）。這段序列緊緊的塞在泛素的一個superfold中，還有一個高度靈活的N端在類似泛素的中心突出。形成異肽鍵所需的甘氨酸殘基在泛素和SUMO-1中是保守的。在體內(nèi)，甘氨酸殘基很容易被C－端水解酶分解。甘氨酸殘基PositivechargedNegativechargedN-terminalPositivecharged甘氨酸殘基C-末端殘基C-末端殘基2023/5/22WanghsSunYat-senUniversity

當(dāng)SUMO被E1活化酶活化時，其碳端的苷氨酸殘基發(fā)生ATP供能的腺甘酸化；隨后，在SUMO的碳端和E1的絲氨酸殘基形成一個硫脂的結(jié)合，并釋放出AMP。在這一酯基反應(yīng)中，SUMO被轉(zhuǎn)移到E2連接酶UBC9上；UBC9與SUMO硫脂的結(jié)合促進SUMO的碳端和底物蛋白的Lys殘基形成一個牢固的異肽結(jié)合。有的SUMO底物蛋白需要E3聯(lián)接酶來促進它們的SUMO化,有的不需要E3。一般E3酶都不直接與SUMO結(jié)合，它只結(jié)合UBC9和底物蛋白，從而促進SUMO與底物蛋白結(jié)合，完成SUMO化。2023/5/22WanghsSunYat-senUniversitySUMO的生物學(xué)功能

1,調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用2,調(diào)節(jié)蛋白在核漿間的轉(zhuǎn)運3,調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性4,拮抗泛素化，使蛋白穩(wěn)定2023/5/22WanghsSunYat-senUniversityI-κB是SUMO的一個底物蛋白，它既能發(fā)生SUMO化，又能發(fā)生泛素化，而且由于SUMO化和泛素化的位點都是K21,SUMO會和泛素競爭結(jié)合位點。I-κB是NF-κB的抑制因子，NF-κB在胞漿中由于和I-κB結(jié)合呈現(xiàn)無活性的狀態(tài)。I-κB經(jīng)腫瘤壞死因子TNF的刺激，在S32和S36發(fā)生磷酸化，進而被泛素化。I-κB的降解使得NF-κB的入核序列暴露，從而進入細(xì)胞核激活NF-κB的靶基因。但是當(dāng)I-κB被SUMO修飾后卻能免受TNF誘導(dǎo)的降解，使NF-κB－I-κB－SUMO復(fù)合體繼續(xù)穩(wěn)定的存在于胞漿中，進而抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。I-κBNF-κBSUMOUbiquitinationTNFNF-κBI-κBThree磷酸化在許多蛋白特別是轉(zhuǎn)錄因子中都存在磷酸化和去磷酸化作用。

轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化、去磷酸化可能影響：

1）轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運或相反。

2）轉(zhuǎn)錄因子與特異DNA序列的結(jié)合。

3）調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)與其他因子的作用。

機理：

1，磷酸化增加了反式作用因子的反式激活結(jié)構(gòu)域與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件或轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物之間的親和力。

2，磷酸化改變了轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象。

3，磷酸化促使反式激活結(jié)構(gòu)域與阻遏蛋白解離，或促進其與DNA結(jié)合。

4，增加蛋白質(zhì)分子表面的負(fù)電荷。蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)控機理和特點

特點：

1，迅速。

2，激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆轉(zhuǎn)。

3，能夠有效地整合來自不同轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號。

4，同一種激酶或磷酸酶都是多底物的，對不同轉(zhuǎn)錄因子的影響不同。

5，蛋白因子上被修飾的氨基酸殘基不同，對轉(zhuǎn)錄因子功能的影響也不同。

磷酸化研究方法特異性磷酸化抗體直接證明CIAP或OA間接證明片段缺失突變和點突變直接證明同位素標(biāo)記質(zhì)譜分析CIAP或OA處理細(xì)胞證明蛋白磷酸化

CIAP：牛小腸堿性磷酸酶，能夠?qū)NA以及蛋白上的磷酸根基團去除（孵育蛋白）；OA：岡田酸，磷酸酶抑制劑（細(xì)胞處理）片段缺失突變確定磷酸化的初步位點點突變確定磷酸化的精確位點(ForErk/MAPK)AKT:RXRXXS

TR3:RDHLAS

Motif

原理：將未被磷酸化的蛋白與被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水解后，進行MS/MS分析，到數(shù)據(jù)庫進行比對。由于磷酸化的片段上多了磷酸基團，因此其分子量將比為被磷酸化的片段要大，由此可分析出磷酸化的位置。質(zhì)譜分析蛋白磷酸化乙?；阴；惓Ｅc疾病CBP/p300的突變導(dǎo)致RubinsteinTaybi綜合征，患者智力低下、面部畸形、姆指和拇趾粗大、身材矮小。CBP/p300可抑制腫瘤的形成，在小鼠瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CBP突變，在結(jié)腸和乳房瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)p300突變。如果突變導(dǎo)致錯誤的激活去乙?；富蝈e誤的和去乙酰化酶相互作用，將可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。甲基化CpG-結(jié)合蛋白-2(MeCP2)可募集去乙?；傅郊谆腄NA區(qū)域，使組蛋白去乙?；瘜?dǎo)致染色質(zhì)濃縮。MeCP2突變導(dǎo)致Rett綜合征，患者出生即發(fā)病、智力發(fā)育遲緩、伴孤獨癥。阻礙去乙?；傅墓δ?，則可抑制癌細(xì)胞的增殖和分化，可用于急性早幼粒細(xì)胞性白血病,急性淋巴細(xì)胞性白血病和非何杰金氏淋巴瘤的治療。蛋白乙?；淖饔檬蔷S持染色質(zhì)的開放結(jié)構(gòu)，因而有利于轉(zhuǎn)錄因子與靶DNA結(jié)合，進而促使基因的轉(zhuǎn)錄。蛋白去乙?；窰DACs可移去H3H4賴氨酸上的乙酰基，使帶正電荷的賴氨酸殘基暴露，從而增強與DNA的相互作用。而帶正電荷的賴氨酸殘基與DNA之間的相互作用可限制核小體在DNA之間的移動，使啟動子接近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，組蛋白低乙?；谷旧|(zhì)失去轉(zhuǎn)錄活性。蛋白乙?；淖饔肕otif:GK,SK蛋白轉(zhuǎn)運和分布研究

Proteintranslocation

Proteinshuttling

Proteintraffic

蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程

靶向(targeting)

去折疊分子識別跨膜轉(zhuǎn)運分選和定位(sortingandlocalization)

重折疊組裝（在去折疊和重折疊中還有分子伴侶

(molecularchaperone)的參與)靶向運送的信息來自于：1,信號肽(也包括靶向線粒體的導(dǎo)肽leadersequence)2,運送蛋白質(zhì)分子本身的某些片段如nuclareexportsequencenuclearlocationsequence3,分泌蛋白自身的信息

蛋白質(zhì)

細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核

蛋白質(zhì)的合成是在核糖體上進行的，但是合成后的蛋白質(zhì)必須定向的、準(zhǔn)確無誤地運送到特定的細(xì)胞器和細(xì)胞核中，才能保證細(xì)胞活動的正常進行。

蛋白入核轉(zhuǎn)運

分子量小于45-50KD的蛋白：在不需要外界能量供應(yīng)的前提下可以通過核孔自由進出（被動擴散）；分子量大于50KD的蛋白：①依賴于能量和溫度；②需要胞漿運輸因子；③需要核孔復(fù)合體蛋白（主動運輸）；核定位序列

（nuclearlocalizationsequence,NLS）

①單一型NLS，由一段連續(xù)的堿性氨基酸順序排列而成（RKKKRKV）②雙分型NLS，由兩簇堿性氨基酸被中間10－12個非保守性氨基酸所分隔而形成（KRPAATKKAGQAKKKKLDK）

proteinimportin-proteinimportin-

importin-proteinimportin-importin-cytoplasmNPCimportin-proteinimportin-NucleusnucleoprotinIBBIBBGTPaseR