質(zhì)粒提取及酶切鑒定

實(shí)驗(yàn)一

質(zhì)粒提取及酶切鑒定P158

基因工程（geneticengineering）是指采用人工方法將不同來(lái)源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過(guò)程。相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)目的基因工具酶載體基因工程相關(guān)物質(zhì)質(zhì)粒

存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)、染色體外、共價(jià)閉合的小型環(huán)狀DNA分子(covalentclosedcircularDNA)。具有自我復(fù)制功能。帶有抗性基因及表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記物經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn)。

質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)

能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀限制性核酸內(nèi)切酶：

------基因工程的手術(shù)刀是分子生物學(xué)研究中的一種工具酶，能識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。如：EcoRⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTT概念與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)（restriction-modificationsystem），限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。作用分類酶結(jié)構(gòu)、作用、識(shí)別及切割特異性的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型Ⅰ型酶具有限制和DNA修飾作用，且識(shí)別及切割位點(diǎn)不同（下游100-1000bp）Ⅲ型酶具有限制和DNA修飾作用，識(shí)別及切割位點(diǎn)不同（相距較近）（1）識(shí)別及切割位點(diǎn)相同（2）識(shí)別序列通常為4～8bp的回文結(jié)構(gòu)；（3）切割可產(chǎn)生兩類切口，三種末端。

Ⅱ型限制酶特點(diǎn)Ⅱ型酶識(shí)別序列特點(diǎn)—

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口鈍性末端粘性末端掌握質(zhì)粒DNA提取的原理與方法

了解DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定原理

質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒的提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異：在堿性環(huán)境中，線性的大分子細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)；溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使細(xì)胞壁裂解。細(xì)菌經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細(xì)菌DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來(lái)，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。再經(jīng)酒精沉淀、洗滌處理，可得到質(zhì)粒DNA。由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開(kāi)環(huán)、閉環(huán)超螺旋。Re共la存xe察d鋒ci斑rc饞leLi運(yùn)ne恒ar暖iz米ed穗f俊or傻mSu柏pe尚r-歇co嬸il艱ed鼓f間or芬m與DN古A分子龍量標(biāo)中準(zhǔn)物刊（Ma唐rk嶄er）比紡較能暮大概跑判斷狗未知DN字A的分銜子量質(zhì)粒DN部A為環(huán)遲狀，伴在酶嘗切徹荒底的鋤情況詞下，DN它A片段序數(shù)與慕酶切你位點(diǎn)炎數(shù)目渾相同質(zhì)粒DN大A酶切堤鑒定短的原軍理Ma營(yíng)rk既er質(zhì)粒DN膀A過(guò)夜吉酶切操作技步驟(M史et懷ho缸ds老)分組陪：4人/組，貝每組屠提取原兩種損質(zhì)粒拳（空模載及弓重組蘇質(zhì)粒候）1.質(zhì)粒趙的提疲?。?）接種艷一個(gè)闊單菌編落（si是ng瀉le銷c領(lǐng)ol棒on占y）于5植mL含相攏應(yīng)抗仆生素畝的LB培養(yǎng)怖基中敬，37冊(cè)℃振蕩榮培養(yǎng)卸至飽鋤和狀培態(tài)（A60樂(lè)0=量0.勁4）或載過(guò)夜蜂。（教著師準(zhǔn)昆備）（2）取1.辜5板mL離心感管一治支，船加入1.澇4礦mL菌液小，1300坐0錢r/境mi嚴(yán)n離心1即mi永n去掉臨上清午液。茶加入15野0廈μL的溶新液Ⅰ，充蒙分混普懸細(xì)逮菌，史在室爽溫下得放置10楚m劍in。（3）加入20率0得μL新配谷制的亭溶液Ⅱ。加溝蓋，萬(wàn)顛倒5次使株之混監(jiān)勻。肚冰上角放置5欺mi習(xí)n。（4）加15贈(zèng)0敏μL預(yù)冷籠的溶圖液Ⅲ，加努蓋后綿顛倒5次混暗勻，便冰上聲放置15脹m瞇in。1300斗0托r/紙mi脾n離心5憤mi礦n，取40競(jìng)0μL上清卵液移星入另跟一離螺心管烤中。（5）向上朱清液潔中加惰入等并體積失苯酚/氯仿腹，震耐蕩混描勻，1300銹0拖r/轟mi炎n離心2漂mi半n，30秀0μL上清紙液轉(zhuǎn)梳移至鄙新的損離心凱管中煤。（6）向上喜清液幕中加蛇入等伴體積爺無(wú)水厲乙醇判，混椅勻，挖室溫房誠(chéng)放置2語(yǔ)mi脖n。離預(yù)心5統(tǒng)mi北n，倒欲去上導(dǎo)清乙?guī)么既苌硪?，船將離狗心管鄭倒扣足在吸做水紙趙上，模吸干順液體劃。（7）加入1檔mL餃7艦0匠%乙醇嘗，震忌蕩并南離心中，1300究0密r/疊mi抬n離心2番mi哀n，倒技去上禮清液劣，晾囑干，慣加入20漁μ座L的TE緩沖芬液，瞎使DN傻A(chǔ)完全傾溶解解，待棄用。2.質(zhì)粒DN格