質(zhì)粒提取定量與酶切鑒定

質(zhì)粒DNA的提取、定量

與酶切鑒定ExtractionandIdentificationofPlasmidDNA實(shí)驗(yàn)流程圖一、堿裂解法提取質(zhì)粒三、質(zhì)粒酶切二、質(zhì)粒定量四、酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)最后做

掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法掌握紫外吸收測(cè)定DNA的方法了解質(zhì)粒酶切鑒定原理掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)材料大腸桿菌DH5a菌株pMD18-T載體易瑞質(zhì)粒小量提取試劑盒TakaraEcoRI限制性內(nèi)切酶TakaraHindIII限制性內(nèi)切酶Takara10×M酶切緩沖液BioWest電泳瓊脂糖干粉0.5×TBE核酸電泳緩沖液EB核酸熒光染料Takara6×電泳上樣緩沖液實(shí)驗(yàn)儀器微量移液器離心機(jī)恒溫水浴箱紫外檢測(cè)儀電泳儀水平電泳槽獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外，能獨(dú)立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子基因工程常采用的載體一、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法；質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等質(zhì)粒提取方法：堿裂解法基本原理

基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。染色體DNA：氫鍵斷裂，變性。質(zhì)粒DNA：大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。（不完全變性）質(zhì)粒DNA：復(fù)性，溶于溶液中染色體DNA：不能復(fù)性；形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。pH=12.6（堿性）NaAc溶液（pH4.8）pH=中性染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)離心pMD18-T溶液S1（細(xì)菌懸浮液）裂解液S2中和液S3洗滌液W洗脫液RNaseA(100mg/ml)DNA吸附柱試劑盒的組成：溶液S1：

50mmol/L葡萄糖

10mmol/L

EDTA 25mmol/LTris-HCl(pH8.0) 2毫克/毫升溶菌酶裂解液S2：200mmol/LNaOH 1%SDS中和液S3：3mol/LNaAc(pH4.8)溶液1,取1.5ml培養(yǎng)物加入Eppendorf管中，室溫離心12000rpm×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。2,加入250μl溶液S1中，旋渦振蕩，使細(xì)菌沉淀分散，徹底懸浮。3,加入250μl裂解液S2，顛倒4～6次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲覝仂o置3min（不超過(guò)5min）。4,加入350μl中和液S3，立即溫和顛倒6~8次混勻，至出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5，室溫12000rpm離心10min。6,分次小心取上清液轉(zhuǎn)至吸附柱中（帶收集管），每次600μl，室溫12000rpm離心30s，棄濾液，將吸附柱重新放回收集管中。7,向吸附柱中加入600μl洗滌液W，12000rpm離心30s，棄濾液。8,重復(fù)步驟7一次。9,空柱10000rpm離心2min。10,取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加50μl56℃預(yù)熱的洗脫液，室溫放置1min，12000rpm離心1min，收集洗脫液（即純化的質(zhì)粒DNA），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)流程1.5mL菌液12000rpm1min菌體沉淀溶液S1250μl劇烈震蕩裂解液S2250μl顛倒混勻4-6次中和液S3350μl溫和地顛倒混勻6-8次12，000rpm10min室溫靜置3~5min至出現(xiàn)白色絮狀沉淀取600μl上清至吸附柱管12，000rpm30s12，000rpm30s洗滌液W600μl12，000rpm30s12，000rpm2min取吸附柱至另一新EP管洗脫液50μl12，000rpm1min室溫靜置1min棄濾液空柱收集洗脫液備用洗滌液W600μl棄濾液棄濾液2.懸浮細(xì)胞1.收集細(xì)胞3.裂解細(xì)胞4.中和6.洗柱7.洗脫5.過(guò)柱分離加入洗脫液加入洗滌液W二、質(zhì)粒DNA定量測(cè)定利用核酸在260nm處有紫外吸收的特性基本原理紫外分光光度計(jì)操作補(bǔ)步驟取5l提取有的質(zhì)蛙粒DN然A，加芳入95l蒸餾吩水混合速均勻3.用紫愧外分躲光光移度計(jì)蜂測(cè)定A26足0DN屆A或RN士A的定縮慧量A26傾0=1改.0相當(dāng)扛于50μg/團(tuán)ml雙鏈DN未A40μg/社ml單鏈DN女A（或RN狠A）20μg/診ml寡核裂苷酸紫外零光吸蹦收法：DN藝A純品:OD26錫0/O涼D28印0=刑1.民8RN墊A純品:OD26勢(shì)0/O餡D28部0=孤2.摔0DN乘A或RN煩A的純宅度判劫定三、調(diào)質(zhì)粒DN桌A的酶揚(yáng)切分梢析質(zhì)粒DN恰A:～3噴kb載體:謊pM弱D1探8-春T2.淚7k報(bào)b基因:脹CH翼D51.幫4杠kb限制簽酶特荒異性女地結(jié)置合于己一段始被稱飲為限制關(guān)酶識(shí)儲(chǔ)別序制列的特布殊DN僻A序列另之內(nèi)收或其改附近宴的特異想位點(diǎn)上，鬧并在列此切割堤雙鏈DN廊A。分子歲克隆脖中常易用的撤為II型限曠制酶似，其圈識(shí)別蔽位點(diǎn)喘長(zhǎng)度閑為4～6個(gè)核掛苷酸走的反向橋重復(fù)象序列。限制場(chǎng)性內(nèi)怨切酶GGATCCCCTAGGEc替oRⅠ和Hi擴(kuò)nd纖Ⅲ的識(shí)賞別序放列和襖切口患是：Ec輛oRⅠ：G↓議AA史TT鬼CHi抹nd驢Ⅲ：A↓丹AG先CT朽TpM緞D1蠶8-豬T反應(yīng)物

體積（μl)10×M酶切緩沖液2質(zhì)粒DNA10HindIII1EcoRI1H2O

6在一剪個(gè)潔代凈的1.接5獄ml離心促管中壤混勻姐下列槽反應(yīng)振物：混合扒后37隆℃水浴1～2h質(zhì)粒DN代A的酶蔥切分季析操貪作1234影響旅酶切拘反應(yīng)檢的因露素底物DN蛋A的純?cè)V度反應(yīng)鋪系統(tǒng)景：(反應(yīng)頌緩沖飯液)反應(yīng)增體積榮：甘油炎濃度<5亭%保溫衣時(shí)間威與溫肯度四、蔑瓊脂怕糖凝輝膠電換泳電泳音：帶電多粒子燭在電袋場(chǎng)中蝦泳動(dòng)勾的現(xiàn)葉象影響浸遷移大率的忙因素亦？電場(chǎng)樣品蘿：大小局（分劃子量社）形狀虜（構(gòu)叔型）電荷共價(jià)揭閉環(huán)育超螺獎(jiǎng)旋DN壇A＞線性DN欄A＞開(kāi)答環(huán)的輝雙鏈謹(jǐn)環(huán)狀DN箭A質(zhì)粒DN心A三種棗構(gòu)型披：共價(jià)夢(mèng)閉環(huán)散超螺橫旋線性開(kāi)環(huán)貨的雙熟鏈環(huán)勺狀瓊脂渾糖凝木膠瓊脂歌糖（Ag戒ar如os標(biāo)e）是哪一種天多聚淹糖，美由半店乳糖賤及其該衍生腎物構(gòu)久成的彼中性蜓物質(zhì)常，不才帶電怎荷。槍瓊脂餐糖透塘明無(wú)沈紫外柔吸收，因此番，目迎前多危用瓊徒脂糖尿?yàn)殡娙居局煶治锞尺M(jìn)行謎平板戰(zhàn)電泳宅。膠濃度（％）線性DNA分子大?。╧b）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3本次冠電泳姜使用1.棄0%瓊脂禍糖凝譽(yù)膠瓊脂盡糖凝件膠濃廈度與DN親A分子嗚的有斷效分獄離范桃圍瓊脂老糖凝神膠的猴制備上樣壇：加樣日前，授樣品趴先與6×上樣污緩沖擁液混之勻電泳：電壓10嘆0v；30慘mi美n結(jié)果嫩觀察煙：凝膠邪成像盜儀瓊脂喬糖凝翠膠電悔泳操調(diào)作瓊脂胡糖凝追膠電浸泳1.凝膠宋準(zhǔn)備①趴稱1g瓊脂批糖置正三角窯瓶中里，加0.粘5×拆TB鬼E序10缸0m棚l；②沒(méi)微馳波爐屑加熱瞞大約2分鐘喊，熔嗎化瓊聯(lián)脂糖涌；2.膠床骨準(zhǔn)備①武將為梳子既垂直俯插入胸到膠杜床的叉小凹贊槽內(nèi)在，梳咸齒底膨端和騾床面根有1m否m的間碌隙；②粉將秀膠床蓮放在接調(diào)整賞好的插水平封臺(tái)上凱；鋪膠芬：將貸冷卻籮至60位℃的凝北膠倒魔入準(zhǔn)織備好送的膠抗床內(nèi)昂，凝匹膠厚塔度約5握mm；室溫雪下靜畝置凝趕膠固門化。朋將帶剃凝膠廊的膠現(xiàn)床置膀于電口泳槽害中，朝并使樣品廳孔位籠于電可場(chǎng)負(fù)爸極；向電思泳槽我中加閣入0.德5×塞TB完E電泳計(jì)緩沖傻液，輸越過(guò)極凝膠天表面法即可外；輕輕悟拔出斯固定鋪在凝引膠中冰的梳好子；樣品消準(zhǔn)備前：向文核酸援樣品宣中加搜入約擴(kuò)為樣讓品體艱積1/猾6的上盤樣緩臘沖液土，用趨加樣萬(wàn)器輕吩輕混窯勻；上樣死：用老加樣逆器吸設(shè)取樣花品，偉輕輕攏的加驢入到眠凝膠河的樣老品孔截中，加樣陜量為6μl；蓋上忘電泳錢槽，考接通據(jù)電源爭(zhēng)，開(kāi)頌始電蓮泳；電泳與條件耀：電洽壓80郵v；時(shí)激間25～30分鐘中；電泳陷結(jié)束帶后，沉切斷鮮電源與，取鳥(niǎo)出凝掌膠。電泳拼結(jié)果拾分析述：紫峽外檢金測(cè)儀惰直接果觀察阻電泳扔條帶13傻.取出窗凝膠鑰，置被于凝膠在成像挽儀中觀磨察結(jié)田果，稍并拍漢照記蹤蝶錄。瓊脂盞糖凝撒膠電礙泳上績(jī)樣1：DN餡A銳Ma耳rk跪er（5l）2：提貝取的球質(zhì)粒DN秘A（5l）3：質(zhì)萍粒DN光A酶切關(guān)產(chǎn)物（10l）+-1234每組察上2個(gè)樣販品DN榴A能Ma錦rk羽er暮(la晶dd降er普)Lo樂(lè)ad呀in效g肢Bu氣ff濤er上樣遙緩沖枕液ED丈TA甘油……肅……碑…增大編溶液田密度溴酚擁藍(lán)……晉……指示吼劑二甲漲苯胺著藍(lán)……指示抹劑組成0.噸5T璃BE憂,籌0.閣5-糊1.細(xì)4%濃度怒的膠愈中，遷移青率溴酚框藍(lán)=3看00惕bp二甲辟苯胺闖藍(lán)=4嫌kb擦p染色溴化疾乙錠(Et苦hi畏di耳um則B予ro葵mi叔de繡，EB):3枝,8吃-二氨睜基-5晉-乙基-6苯基牽菲啶腔溴鹽聞，能釣插入DN沾A分子糞堿基混對(duì)之驅(qū)間并枝與之壘結(jié)合,在紫囑外光錢照射心下呈妹現(xiàn)紅掘橙