細胞生物學 4第四次實驗

第四次實驗實驗九植物細胞骨架的制片技術及形態(tài)觀察實驗十細胞有絲分裂標本的制備與形態(tài)觀察實驗九植物細胞骨架的制片技術及形態(tài)觀察實驗目的1.掌握光鏡下細胞骨架的基本形態(tài)結構。

2.了解微絲的顯示方法。細胞骨架細胞質骨架（cytoskeleton）指真核細胞中的蛋白纖維的網(wǎng)絡結構。細胞質骨架包括微絲（microfilament）、微管（microtubule）和中間纖維（intemediatefilament）。微絲確定細胞表面特征，使細胞能夠運動和收縮。微管確定膜性細胞器的位置和作為膜泡運輸?shù)膶к?。中間纖維使細胞具有張力和抗剪切力。其它骨架成分：細胞核骨架、細胞膜骨架、細胞外基質。細胞核（紫色）與細胞骨架

細胞骨架是由微管蛋白（黃色）形成的微管和由肌動蛋白（藍色）形成的微絲等組成。實驗原理

用TritonX-100溶液處理細胞時，可使細胞質膜中和細胞質中的全部脂質和部分蛋白質被溶解抽提，但細胞骨架蛋白質不受破壞而被保存。經(jīng)固定和考馬斯亮蘭（非特異性蛋白質染料）染色后，可在光鏡下觀察到由微絲組成的纖維束（藍色）。實驗用品1.材料：洋蔥2.藥品：

0.2MpH7.3磷酸緩沖液（PB）

0.01M磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.2MPB50ml加0.15M氯化鈉50ml雙蒸水定至1LM-緩沖液：50mM

咪唑，0.5mM

氯化鎂，50mM

氯化鉀，1mMEGTA[乙二醇-雙-（2-氨基乙基醚）四乙酸]，0.1mMEDTA（乙二胺四乙酸），1mMDTT（二硫蘇糖醇），4mM

甘油

1%TritonX-100（用M-緩沖液配制）

3%戊二醛（用0.01MPBS配制）

0.2%考馬斯亮藍R250（用少許無水乙醇溶解，然后用12.5%三氯醋酸定容，裝瓶備用）3.用具：燒杯、剪刀、鑷子、手術刀、滴管、稱量瓶、顯微鏡、載玻片等實驗方法1.用鑷子撕取若干片洋蔥鱗片的內表皮（不要用靠近鱗片邊緣的表皮），剪成0.5×0.5cm大小，放入容器中，加入PBS，浸泡3min；2.吸去磷酸鹽緩沖液，加入1%TritonX-100，處理30min（28℃恒溫箱）。然后用M-緩沖液洗3～5次，每次5min；3.再加入3%戊二醛液，固定20min（28℃恒溫箱）；然后用PBS洗3～5次，每次5min；4.然后用0.2%考馬斯亮藍染色20min（在載玻片上進行）；之后用PBS沖洗至水無色；5.制片，并觀察實驗結果。

取內表皮，置于載玻片上，加PBS浸2min

吸去PBS，加2~3滴1%TritonX-100，處理25min

吸去TritonX-100，用M-緩沖液洗3次，每次2min

吸去M-緩沖液，加2~3滴3%戊二醛，固定15min

用PBS洗3次，每次2min

吸去PBS，加2~3滴0.2%考馬斯亮藍，染色15min

用PBS洗2次，每次2min，吸干，鏡檢細胞骨架標本觀察作業(yè)在顯微鏡下截取細胞骨架的圖片，并加以標注。原理有絲分裂是真核生物體細胞的基本增殖方式。通過DNA的復制，以及染色體的分裂，實現(xiàn)遺傳物質平均分配到兩個新的子細胞。實驗十細胞有絲分裂標本的制備與形態(tài)觀察有絲分裂的特點和意義

特點：染色體復制一次，細胞分裂一次，結果1個細胞變?yōu)?/p>

2

個細胞，且兩個子細胞與母細胞遺傳物質在質量上和數(shù)量上完全一致。

意義：保證了物種遺傳的連續(xù)性和穩(wěn)定性。

維持了個體的正常生長和發(fā)育。細胞有絲分裂為了便于描述人為地劃分為六個時期：間期（interphase）；前期(prophase)；前中期(premetaphase);中期(metaphase)；后期(anaphase)；末期(telophase)。間期

包括G1期、S期和G2期。

G1期：

是從細胞分裂完成到DNA開始復制的時期，有大量RNA和蛋白質形成；S期：

是DNA進行復制階段，DNA含量加倍；G2期：

合成與有絲分裂有關的物質。前期①染色質凝縮，②分裂極確立與紡錘體開始形成，③核仁解體，④核膜消失。前期開始的標志：第一個特征：染色質開始濃縮、凝集形成染色體。第二個特征：細胞骨架解聚，有絲分裂紡錘體開始裝配。前期中期所有染色體排列到赤道板上，標志著細胞分裂已進入中期。后期2條姐妹染色體單體分開并移向兩極。末期

從染色單體到達兩極，至形成兩個新細胞為止的時期。涉及子核的形成和胞質分裂兩個方面。細胞有絲分裂周期植物細胞的細胞周期1.植物細胞的細胞周期與動物細胞的標準細胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四個時期。2.植物細胞不含中心體，但在細胞分裂時可以正常組裝紡錘體。3.植物細胞以形成中板的形式進行胞質分裂。植物細胞有絲分裂實驗用品1.材料洋蔥根尖2.器材顯微鏡、解剖針、鑷子、蓋玻片、載玻片、培養(yǎng)皿等3.試劑

70%乙醇、45%醋酸、改良堿性品紅染液實驗方法1.取材：將洋蔥置于盛有水的小燒杯上，使其鱗莖浸入水中，室溫培養(yǎng)3～5d，每天換水。待其根尖長到2～3cm時，切取1cm左右的根尖。2.預處理：將根尖浸入蒸餾水中，放置冰箱（4℃）中處理24h。減緩細胞的有絲分裂，使處在分裂期的細胞數(shù)量增多，便于觀察。也可用秋水仙素進行處理。3.固定：取出材料，放入卡諾氏固定液中固定3h左右。固定液用量約為材料體積的15倍以上，若固定不好，會影響以后的步驟。實驗方法4.解離：將固定的根尖用清水漂洗幾次，然后用1mol/L的HCl

在60℃處理30min左右。或用6mol/L的HCl

室溫處理5～10min。5.染色和制片：將解離后的根尖用水漂洗3次，放在載玻片上，用鑷子輕輕搗碎。用堿性品紅染色5～10min后，用吸水紙吸去多余的染料，蓋上蓋玻片，用鉛筆或橡皮頭輕輕敲打，使細胞彼此離散。6.鏡檢：在顯微鏡下觀察根尖細胞，如果細胞染色過深，可加上45%的醋酸（或95%乙醇），進行分色處理。分色時，一般是在蓋玻片的一邊滴加45%的醋酸，另一邊用吸水紙吸去多余的液體。如果細胞重疊比較嚴重，可用橡皮頭再次輕輕敲打，直至細胞在玻片上呈淡淡的云霧狀為止。

注意：敲打時不要使細胞在玻片上發(fā)生扭動，而使細胞形態(tài)發(fā)生變化。根尖分區(qū)示意圖

roottip.Examinethesquarecellsjustinsidetherootcap.Thisistherootmeristem(embryonictissue)wheremitosisisoccurring.Fartheruptherootistheelongationzone,wherecellsarelongrectangles;thesecellsarenotundergoingmitosis.顯微觀察低倍鏡下