免疫原和抗血清的制備

免疫原和抗血清的制備第一頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、可溶性抗原的制備：組織和細(xì)胞粗抗原的制備：

1.組織和細(xì)胞混合抗原的制備：

組織勻漿制備：

標(biāo)本要求：新鮮或低溫（＜-40℃）保存的去除表面包膜或結(jié)締組織或一些大血管，臟器應(yīng)進(jìn)行

灌注，除去血管內(nèi)殘留血液

制備

處理好組織→0.05％NaN3生理鹽水洗凈→剪成小塊

粉碎→高速組織搗碎機(jī)法→2000-3000rpm離心10min

研磨法：玻璃勻漿器,乳缽研磨

→上清10000-20000rpm20-30min高速離心

第二頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.細(xì)胞抗原的制備：

細(xì)胞抗原細(xì)胞膜蛋白抗原

細(xì)胞漿抗原

細(xì)胞核及核膜抗原

粉碎：

（1）反復(fù)凍融法

（2）冷熱交替法：適合細(xì)菌，病毒蛋白質(zhì)及核酸

（3）超聲破碎法：適合于微生物和組織細(xì)胞

細(xì)菌，尤其真菌厚膜孢子難破壞

（4）自溶法：利用組織和微生物的自身酶系

需一定PH和溫度動(dòng)物組織cell

0-4℃

微生物室溫

（5）溶菌酶法：一定PH（PH8.0），溶菌酶可專(zhuān)一破壞菌胞。蝸牛酶，纖維素酶消化細(xì)菌和組織cell

（6）表面活性劑處理法

第三頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五

蛋白質(zhì)抗原的制備和純化：可溶性抗原絕大部分為蛋白質(zhì)

1.超速離心和梯度密度離心法：

用來(lái)分離亞細(xì)胞部分及大分子蛋白質(zhì)

1）差速離心：高低速交替進(jìn)行。將大分子物質(zhì)分離

2）梯度密度離心：區(qū)帶分離法，通過(guò)梯度密度來(lái)維持重力的穩(wěn)定性，通常分離的懸液中的顆粒比液體重，要使之上浮，必須加入第三種成份，其密度連續(xù)或不連續(xù)升高，即所謂梯度

3）第三種成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化銣

適合于少部分大分子抗原，對(duì)于大量的中、小分子量的蛋白質(zhì)抗原不適用此法

第四頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.選擇性沉淀法：用沉淀劑或改變某些條件促使抗原成分沉淀

1）核酸除去法：

（1）提取沉淀劑：

（2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶與提取液作用30-60min（4℃），即可除去核酸

2）鹽析沉淀法：

（1）抗原的粗篩33-50％飽和度的硫酸銨

（2）提取丙種球蛋白主要為IgG

33-40％飽和度的硫酸銨

（3）抗原的濃縮

3）有機(jī)溶劑沉淀法：

有機(jī)溶劑多為酒精和丙酮

4）水溶性非離子型聚合物沉淀法：

PEG+蛋白質(zhì)顆粒→沉淀、復(fù)合物、蛋白質(zhì)發(fā)生水的重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG濃度不同可沉淀不同pro3-4％沉淀免疫復(fù)合物6-7％沉淀IgM

8-12％沉淀IgG

12-15%沉淀其他球蛋白

25％沉淀白蛋白第五頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五3.凝膠過(guò)濾和離子交換層析：

1）分析篩層析又名凝膠過(guò)濾，將Ag分成大、中、小三種

大分子較快出來(lái)，小分子因被阻留，出來(lái)較慢。根據(jù)分子量不同

2）離子交換層析：離用帶離子基因的纖維素

流動(dòng)相逐步增加離子強(qiáng)度，蛋白質(zhì)按電荷不同或量的差異分組常用DEAE纖維素（二乙基氨基乙基纖維素）

根據(jù)pro攜帶電荷不同（溶液中等電點(diǎn)不同）

常用于分離IgM

因?yàn)镮gM分子量大

凝膠過(guò)濾洗脫曲線(xiàn)

第六頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五4.親和層析：

利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間的具有的專(zhuān)一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。

eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制劑，酶蛋白和輔酶，激素和激素受體等其之間有特殊親和力，可緊密結(jié)合成復(fù)合物.

1）親和層析支持物的選擇：

常用：瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）

第七頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五

2）配體的選擇：

3）抗原或抗體與支持物的結(jié)合：

步驟：

（1）活化支持物上的功能基因

溴化氛PH11與支持物上的羥基形成氨基形成氨基甲酸酯基因

（2）交聯(lián)（聯(lián)接）

（3）清洗：除去未結(jié)合的pro

（4）親和層析條件的選擇：原理：一定條件下，Ag和Ab能可逆性地結(jié)合成復(fù)合物，當(dāng)條件改變（如稀酸、稀堿、濃鹽、加溫等）時(shí)又可將抗原抗體解離。如果將抗原或抗體固定在不溶性的載體上能從液相中專(zhuān)一性分出抗體或抗原。根據(jù)這一原理，將可溶性抗原（或抗體）用化學(xué)方法偶聯(lián)到不溶性載體上，當(dāng)將相應(yīng)的抗血清（或抗原）按層析方法加入柱中，抗血清中的相應(yīng)的抗體與抗原特異性結(jié)合。其他蛋白成分隨洗脫液流出。再改變緩沖液的PH值和離子強(qiáng)度，則可以使抗體和偶聯(lián)在載體上的Ag解離（加入解脫劑），經(jīng)洗脫，從而得到純化的Ab。

第八頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五2）配體的選擇：抗原或抗體與支持物的結(jié)合：

步驟：

（1）活化支持物上的功能基團(tuán)

溴化氰PH11與支持物上的羥基形成氨基甲酸酯基團(tuán)

（2）交聯(lián)（聯(lián)接）

（3）清洗：除去未結(jié)合的pro

（4）親和層析條件的選擇：原理：在一定條件下，Ag和Ab能可逆性地結(jié)合成復(fù)合物，當(dāng)條件改變（如稀酸、稀堿、濃鹽、加溫等）時(shí)又可將抗原抗體解離。如果將抗原或抗體固定在不溶性的載體上就能從液相中專(zhuān)一性地

分出抗體或抗原。根據(jù)這一原理，將可溶性抗原（或抗體）用化學(xué)方法偶聯(lián)到不溶性載體上，當(dāng)將相應(yīng)的抗血清（或抗原）按層析方法加入柱中，抗血清中的相應(yīng)的抗體與抗原特異性結(jié)合。其他蛋白成分隨洗脫液流出。再改變緩沖液的PH值和離子強(qiáng)度，則可以使抗體和偶聯(lián)在載體上的Ag解離（加入解脫劑），經(jīng)洗脫，從而得到純化的Ab。第九頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五以免疫親和層析為例

（三）免疫球蛋白片段的制備：

1）溫和分離亞單位：

（1）改變PH值PH＜3或＞10，Ig亞單位自動(dòng)解離

（2）利用強(qiáng)度性劑

適合載脂蛋白Ag和膠原肽的提取

2）二硫鍵的解離：

適合于將輕、重鏈分開(kāi)

3）溴化氰裂解法：

與蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸側(cè)鏈的硫醚基起反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯

4）酶法裂解：

木瓜酶將IgG分解為Fc和Fab（×2）三個(gè)片段

胃蛋白酶IgG分解為（Fab）2和幾個(gè)小肽段

胰蛋白酶IgG切成不規(guī)則肽鏈

應(yīng)用：木瓜酶切斷，得Fc段，制備抗重鏈血清

胃蛋白酶切取，得F（ab）2，用于診斷（用Ab鑒別Ag）

第十頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五（四）純化抗原的鑒定：1.含量鑒定：

生化方法酚試劑法

雙縮脲法可見(jiàn)光吸收法

紫外吸收法Ag寶貴，少

2純度的鑒定：醋酸纖維薄膜電泳法－－經(jīng)典常用

聚丙烯酰胺凝膠電泳法

免疫電泳法

免疫雙擴(kuò)散法

ELISA或RIA（放免）－－

不純，也可能是同一物質(zhì)的聚合體或降解物

較純，也不能排除在這條帶中有其他成分

所以單一方法，可信度差。因而幾種方法聯(lián)用較可靠第十一頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、半抗原免疫原的制備

半抗原：只有反應(yīng)原性，沒(méi)有免疫原性的小分子物質(zhì)

半抗原+載體→大分子物質(zhì)-------Ab

人工抗原

結(jié)合方法物理法：利用電荷和微孔

化學(xué)法

（一）載體的選擇：

1.蛋白質(zhì)：常用牛血清白蛋白

2.多肽類(lèi)聚合物：常用多聚賴(lài)aa

3.大分子的聚合物和某些顆粒：加入福氏佐劑可產(chǎn)生良好Ab

（二）聯(lián)接的方法：

三個(gè)基本條件：

1.碳化二亞胺法;

2.二醛法：

3.混合酸酐法（氯甲酸異丁酯法）

三）無(wú)羧基和氨基半抗原衍生物的制備：

1.琥珀酸酐法

2.O-（羧甲基）羥胺法

3.一氯醋酸鈉法，適用于帶酚基的半抗原

4.重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法：適于帶酚基的半抗原第十二頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五四.佐劑：（一）使用佐劑的目的為提高免疫原性

佐劑本身可有或無(wú)免疫原性

（二）機(jī)理：

1.可直接或參與cell免疫反應(yīng)

2.佐劑與Ag混合，可以使Ag在局部組織的存留時(shí)間長(zhǎng)，延長(zhǎng)Ag的局部吸收?？沙掷m(xù)刺激機(jī)體，產(chǎn)生高滴度Ab

3.佐劑可增加Ag表面積，并改變Ag的活性基因構(gòu)型，從而增加Ag的免疫原性。

第十三頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五常用的佐劑和制備方法：

1.應(yīng)用最多的為福氏佐劑不完全：石蠟油+羊毛脂

完全：石蠟油+羊毛脂+卡介苗

2.乳劑的制備：

乳劑：Ag和佐劑的混合物

Ag與佐劑比例為1：1，注射前要充分乳化

乳化方法研磨法

攪拌混合法旋渦混合第十四頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五抗體的制備多克隆抗體的制備單克隆抗體的制備第十五頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二節(jié)抗血清的制備

免疫原+佐劑→刺激動(dòng)物機(jī)體→獲得抗血清

一.動(dòng)物的選擇

1.種屬差異越遠(yuǎn)越好，太近不易產(chǎn)生良好的抗體，甚至不產(chǎn)生

2.抗血清量的要求：量大，選大動(dòng)物

量少，選小動(dòng)物

3.抗血清的要求：R型（兔型）H型（馬型）

4.抗原的選擇：蛋白質(zhì)Ag大部分動(dòng)物皆適合，常用家兔、山羊

IgE對(duì)綿羊，胰島素對(duì)家兔，酶對(duì)山羊免疫時(shí)不產(chǎn)生Ab

5.甾體激素多用兔，酶多用豚鼠

6.對(duì)動(dòng)物個(gè)體的要求：雄性稚齡、健康、正常、無(wú)感染

第十六頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、免疫前準(zhǔn)備1.正常飼養(yǎng)：3d，觀(guān)察是否健康、正常、無(wú)感染2.取陰性血清：耳靜脈取血

第十七頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、免疫劑量、時(shí)間和途徑選擇原則：

1.劑量：大動(dòng)物0.5-1mg/只

小動(dòng)物0.1-0.6mg/只

1）免疫劑量不要過(guò)大，Ag過(guò)量，易產(chǎn)生免疫抑制

2）第一次免疫劑量要小，多次免疫后可加大劑量

3）選擇合適的免疫劑量，要根據(jù)Ag性強(qiáng)弱，分子量大小，動(dòng)物大小，免疫時(shí)間而定。

2.時(shí)間：1）間隔時(shí)間短，易產(chǎn)生免疫抑制

一般第1、2次間要有10-20d，2次以后7-10d

2）半抗原間隔時(shí)間長(zhǎng)3.途徑：多點(diǎn)注射，（足掌、腋窩L結(jié)周?chē)?，背部?jī)蓚?cè)，頜下，耳后皮內(nèi)或皮下注射）

Ag寶貴，采取微量注射法

第十八頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五免疫程序：1.背部皮下多點(diǎn)注射2.淋巴結(jié)內(nèi)注射第十九頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五試血1.根據(jù)免疫程序末次免疫，從耳靜脈取血分離血清2.瓊脂雙擴(kuò)散測(cè)效價(jià)第二十頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五三.動(dòng)物采血法：

抗血清鑒定

采血前，禁食動(dòng)物24h，防止血脂過(guò)高

末次免疫后，5-7d之內(nèi)采血。否則抗血清效價(jià)↓

1.頸動(dòng)脈放血法：適于兔、羊

2.心臟采血法：適于小動(dòng)物

3.靜脈多次采血清免：耳中央V

100ML

羊：頸V

1500-2000ML

小鼠：斷尾或摘除眼球2ML

抗血清分離，滅活56℃30min

第二十一頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五第三節(jié)抗血清的鑒定和保存

一、抗血清的鑒定：

免疫成功，Ab較純，含有雜Ab免疫不成功

1.特異性鑒定：免疫雙擴(kuò)散法

2.效價(jià)的鑒定：免疫雙擴(kuò)散法

Ab稀釋法：不稀釋1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

Ag∴1/32作為Ag效價(jià)

3.AgAb的親和力的鑒定

Ag+AbAgAbK值109-1011L/mol之間

K值大，AgAb結(jié)合力大

K值小，AgAb結(jié)合力小

第二十二頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、抗血清其他鑒定方法：三、抗血清的保存：

1.4℃無(wú)菌處理，防腐液體狀態(tài)3-6月

2.-20℃--40℃度冰凍保存5年小包裝

3.干燥冰凍5-10年

第二十三頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五第四節(jié)抗血清中抗體的純化

目的：除去雜Ab

1.Ab特異性的純化

除去雜Ab1）吸附劑法

2）親和層析

2.特異性IgG抗體的制備：

1）鹽析法粗提V－球蛋白

不同飽和度的（NH4）2SO4或Na2SO4

2）離子交換層析法提取IgG：

常用DEAE纖維素IgG帶正電荷，其他pro帶負(fù)電荷

3）親和層析法提取特異性IgG

4）酶解法制備F（ab）2片段第二十四頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五第五節(jié)單克隆抗體及基因工程抗體一、單克隆抗體：

1、淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)

2、單克隆抗體

3、單克隆與多克隆抗體比較

4、用途二、基因工程抗體第二十五頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五一、單克隆抗體

1、淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kohlermilstein)

淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)：75年才創(chuàng)立的技術(shù)，將在體外不能長(zhǎng)期生存的免疫細(xì)胞與在體外能迅速增殖的骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇的作用下融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，所得雜交瘤細(xì)胞繼承了兩種細(xì)胞的能力，即保存了瘤細(xì)胞在體外迅速增殖傳代的能力，又繼承了免疫細(xì)胞合成與分化的能力，淋巴細(xì)胞主要T細(xì)胞、B細(xì)胞(T細(xì)胞與胸腺瘤細(xì)胞融合，可產(chǎn)生分泌淋巴因子的T細(xì)胞雜交瘤)B細(xì)胞與瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生能分泌特異抗體的B細(xì)胞雜交瘤。

第二十六頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、單克隆抗體：通過(guò)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，把產(chǎn)生特定抗體的B細(xì)胞與能無(wú)限生長(zhǎng)的骨髓瘤的細(xì)胞融合，形成的B細(xì)胞雜交瘤，由這克隆化B的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體。純度高，專(zhuān)一性強(qiáng)，重復(fù)性好，且能持續(xù)在動(dòng)物體外或體內(nèi)產(chǎn)生固體性抗體。第二十七頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、單、多克隆抗體比較：多克隆抗體—：是由多個(gè)淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的(抗原分子量大，表面決定簇多產(chǎn)生不抗體)是高度異質(zhì)性，特異性低，純度差，反應(yīng)不夠靈敏，限制免疫學(xué)血清學(xué)的發(fā)展，影響診斷準(zhǔn)確性和治療效果。單克隆抗體—：特異性強(qiáng)，體外產(chǎn)生，質(zhì)地均一，反應(yīng)靈敏，工業(yè)化生產(chǎn)任何多肽蛋白質(zhì)特別是半抗原均可用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)來(lái)制備單克隆抗體。第二十八頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二十九頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五

4、單克隆抗體的應(yīng)用：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)被譽(yù)為免疫學(xué)的一次革命，是20世紀(jì)后20年內(nèi)最為重要的生物高技術(shù)之一。1984年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)。從醫(yī)、農(nóng)、食品等給人帶來(lái)新的希望。多克隆抗體特異性低，純度差，反應(yīng)不夠靈敏，影響診斷的準(zhǔn)確性，及治療效果，以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高，還出現(xiàn)血清病，過(guò)敏性休克，含量不一，無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化。單克隆抗體特異性高，滴度高，質(zhì)地均一，反應(yīng)靈敏，可標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，單克隆產(chǎn)品診斷試劑投資少，收效快，產(chǎn)值高。任何多肽與蛋白如病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)，正常細(xì)胞及惡化細(xì)胞，各種因子受體與介質(zhì)、激素、酶類(lèi)和血液成份，食物品與環(huán)境的有害物，甚至一段氨基酸、核苷酸DNAorRNA順序化合物半抗原，都可通過(guò)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備出相應(yīng)單克隆抗體。第三十頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五開(kāi)發(fā)癌瘤、病毒性疾病、化膿性疾病、自身免疫疾病和移植排斥反應(yīng)的單抗新藥，廣泛應(yīng)用基礎(chǔ)研究、疾病診斷、環(huán)境、食品監(jiān)測(cè)，治療、預(yù)防提純蛋白，優(yōu)生優(yōu)育等，主要應(yīng)用以下幾方面：（1）疾病診斷（2）體內(nèi)顯象定位檢查（3）體內(nèi)治療和導(dǎo)向治療（4）食品環(huán)境監(jiān)測(cè)（5）提純蛋白與基因工程產(chǎn)品，用于人、動(dòng)、植物各學(xué)科的分子生物學(xué)研究第三十一頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五5.單克隆抗體的制備單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）

抗原決定簇：Ag上特異的化學(xué)基因稱(chēng)Ag決定簇。

當(dāng)Ag免疫動(dòng)物時(shí)，Ag的每個(gè)抗原決定簇可分別刺激相應(yīng)Bcell，因?yàn)槊總€(gè)Bcell表面的Ag受體只針對(duì)一個(gè)Ag決定簇，并產(chǎn)生針對(duì)該Ag決定簇的Ab。一個(gè)Bcell只識(shí)別一個(gè)Ag決定簇，并產(chǎn)生該Ag決定簇的Ab，稱(chēng)為單克隆Ab。這種Ab是均一的，且是單一特異性的。

1種Ag可有多個(gè)抗原決定簇

第三十二頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五第一節(jié)B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的原理B淋巴細(xì)胞雜交瘤：

用人工方法使Ab產(chǎn)生cell與骨髓瘤cell融合而成，產(chǎn)生的一類(lèi)特殊cell。

Ab產(chǎn)生cell來(lái)源于小鼠脾cell（B細(xì)胞）

骨髓瘤cell來(lái)源于同系小鼠?？纱罅矿w外增殖，長(zhǎng)期培養(yǎng)

雜交瘤cell兼有兩種親本cell特性，既能分泌A(yíng)b，又能大量增殖

第三十三頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五一、Bcell雜交瘤技術(shù)的原理：二、小鼠骨髓瘤cell的篩選：三、細(xì)胞融合劑：PEG多選分子量1000-2000

PEG的作用基理：PEG可改變cell膜脂類(lèi)分子排布，使cell膜易脂類(lèi)分子排布，使cell膜易被打開(kāi)，最終引起cell融合

第三十四頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五HAT培養(yǎng)基的選擇作用：

HAT

次黃嘌呤（H）核苷酸前體，使cell通過(guò)替代途徑合成DNA

氨基蝶呤（A）葉酸拮抗物，阻斷cell合成DNA的主要途徑

胸腺嘧啶核苷（T）使cell通過(guò)替代途徑合成DNA

第三十五頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五cell合成DNA有兩種途徑：主要途徑：糖、aa、合成核苷酸合成DNA

需葉酸參與氨基蝶呤（A）可阻替代途徑：次黃嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）

HGPRT

TK催化

小鼠骨髓瘤cell都缺乏HGPRT，在HAT培養(yǎng)基中，不能完成完整DNA合成過(guò)程∴易死亡

雜交瘤cell可利用脾C的HGPRT，通過(guò)替代途徑合成DNA

第三十六頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五雜交瘤cell的篩選和克隆化

1.篩選目的：Ab陽(yáng)性分泌的雜交瘤細(xì)胞，ELISA：檢測(cè)Ab→Ab陽(yáng)性細(xì)胞

純化好的單一性可溶性Ag，包被到微孔上2.雜交瘤的克隆化：2.1定義：用一定方法使混合的cell分離成單個(gè)cell獨(dú)立狀態(tài)，再經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)形成的各個(gè)cell群，就分別是一個(gè)克隆，這種方法稱(chēng)為克隆化2.2目的：獲得目的Ab陽(yáng)性，Ab分泌旺盛的雜交瘤cell株2.3克隆化方法：有限稀釋法將融合cell用培養(yǎng)液充分稀釋?zhuān)敝撩靠字挥?個(gè)cell

顯微操作法

瓊脂平板法

細(xì)胞選分代法2.4再次克隆化：初次及再次克隆化之前均要檢測(cè)Ab多次傳代，冰凍復(fù)蘇的雜交瘤cell均要再次克隆化

第三十七頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二節(jié)制備McAb的技術(shù)要點(diǎn)一、免疫小鼠：

為防止免疫反應(yīng)不佳或中途死亡，應(yīng)同時(shí)免疫3-4只小鼠

Ag純選用與骨髓瘤cell同源的BALB/C小鼠二、培養(yǎng)骨髓瘤cell：

與待融合脾cell同源

選生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的cell以供融合用

避免cell反祖，用8-AG處理cell

切忌過(guò)多傳代三、收集脾cell

分離脾之前，要檢測(cè)Ab。采脾，制成懸液四、采取飼養(yǎng)