微生物檢驗(yàn)學(xué)之衣原體及檢驗(yàn)

微生物檢驗(yàn)學(xué)之衣原體及檢驗(yàn)微生物檢驗(yàn)學(xué)之衣原體及檢驗(yàn)/NUMPAGES10微生物檢驗(yàn)學(xué)之衣原體及檢驗(yàn)微生物檢驗(yàn)學(xué)之衣原體及檢驗(yàn)衣原體及檢驗(yàn)一、概述

（一）概念衣原體是一群體積較小，能通過細(xì)菌濾器，細(xì)胞內(nèi)專性寄生，并有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物。由于它具有一些與細(xì)菌類似的生物學(xué)特性，現(xiàn)歸屬于廣義的細(xì)菌范疇。（二）分類與命名

1.傳統(tǒng)分類法按第九版Bergey細(xì)菌學(xué)分類手冊(cè)，衣原體屬于衣原體目、衣原體科、衣原體屬。根據(jù)衣原體的抗原構(gòu)造和DNA同源性的特點(diǎn)，將衣原體屬分為四個(gè)種，包括沙眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體和家畜衣原體。能引起人類致病的主要是前三種。

沙眼衣原體可分三個(gè)生物亞種，即沙眼生物亞種、性病淋巴肉芽腫生物亞種（LGV）及鼠生物亞種。其中沙眼亞種又分A～K14個(gè)血清型；LGV生物亞種又分4個(gè)血清型L1、L2、L2a和L3。前兩個(gè)亞種對(duì)人類有致病性，鼠亞種則不侵犯人類。

肺炎衣原體是衣原體屬中的一個(gè)新種。只有一個(gè)血清型，即TWAR組。

2.分子生物學(xué)特性分類法該法主要是從衣原體種系發(fā)生上分析和評(píng)價(jià)傳統(tǒng)分類法。

二、生物學(xué)性狀

1.發(fā)育繁殖周期與形態(tài)染色衣原體在宿主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖有獨(dú)特的發(fā)育周期，可見到兩種形態(tài)結(jié)構(gòu)不同的顆粒。

（1）原體：呈球形或橢圓形，直徑約0.3μm，外有胞壁，內(nèi)含致密的核質(zhì)，為成熟的衣原體。吉姆薩染色呈紫色，Macchiavello染色呈紅色。在細(xì)胞外較為穩(wěn)定，無(wú)繁殖能力，但有高度的感染性。（2）網(wǎng)狀體又稱始體：呈球形或橢圓形，直徑0.5～1μm，無(wú)胞壁，胞漿內(nèi)無(wú)致密的核質(zhì)，而有纖細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。吉姆薩染色和Macchiavello染色均呈藍(lán)色。為衣原體發(fā)育周期中的繁殖型，代謝活潑，不能自胞外存活，無(wú)感染性。

衣原體的發(fā)育周期：原體當(dāng)與易感細(xì)胞表面的特異受體吸附后，通過細(xì)胞的吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，形成吞噬小泡。原體在泡內(nèi)變軟，增大為網(wǎng)狀體。約8小時(shí)后，網(wǎng)狀體在空泡內(nèi)以二分裂方式繁殖、聚集，構(gòu)成各種形狀的包涵體。感染18～24小時(shí)后，網(wǎng)狀體濃縮形成具有堅(jiān)韌細(xì)胞壁的原體，最后隨宿主細(xì)胞破裂而釋出，再感染新的易感細(xì)胞，開始新的發(fā)育周期。每個(gè)發(fā)育周期約需40～72小時(shí)。2.抗原成分衣原體的抗原性相當(dāng)復(fù)雜，有屬、種、型等特異性抗原。

（1）屬特異性抗原：衣原體細(xì)胞壁LPS為屬特異性補(bǔ)體結(jié)合抗原。其與革蘭陰性菌LPS結(jié)構(gòu)不同，缺乏O-多糖和部分核心多糖，無(wú)典型內(nèi)毒素生物學(xué)活性。長(zhǎng)期應(yīng)用于衣原體血清學(xué)診斷。

（2）種特異性抗原：主要位于外膜蛋白（MOMP）上。

（3）型特異性抗原：也位于MOMP上，用單克隆抗體作微量免疫熒光試驗(yàn)可識(shí)別衣原體各血清型。3.分離培養(yǎng)特性衣原體專性細(xì)胞內(nèi)寄生。絕大多數(shù)能在6～8日齡雞胚卵黃囊中生長(zhǎng)繁殖，并可在卵黃囊膜中找到包涵體、原體和始體顆粒，也可在傳代細(xì)胞（如HeLa-299和Mc-Coy等細(xì)胞株）中培養(yǎng)。

4.抵抗力衣原體抵抗力弱，沙眼衣原體感染材料在35～37℃條件下，經(jīng)48小時(shí)左右即失去活性。不耐熱，加熱50℃經(jīng)30分鐘或56～60℃5～10分鐘可殺死，但耐寒，在冰凍條件下可存活數(shù)年。鸚鵡熱衣原體比沙眼衣原體穩(wěn)定。對(duì)四環(huán)素、青霉素、紅霉素、螺旋霉素、利福平較敏感。

三、臨床意義

人類衣原體病主要包括：

（一）沙眼衣原體

1.沙眼由沙眼生物亞種A、B、Ba和C四個(gè)血清型引起。主要通過眼-眼或眼-手-眼（常通過公用毛巾等媒介）的途徑進(jìn)行直接或間接接觸傳播。

2.包涵體結(jié)膜炎由沙眼生物亞種B、Ba、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K血清型引起。包括嬰兒及成人兩類。嬰兒經(jīng)產(chǎn)道時(shí)該亞種可致包涵體結(jié)膜炎和嬰幼兒肺炎。3.泌尿生殖道感染主要由沙眼生物亞種D-K血清型引起，是經(jīng)性接觸傳播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染的主要病原。衣原體感染是男性尿道炎最常見的病因之一。未經(jīng)治療者多數(shù)轉(zhuǎn)為慢性，周期性加重，或可合并附睪炎、前列腺炎等。在女性可引起尿道炎、宮頸炎、陰道炎、盆腔炎，也可與婦女不孕癥有關(guān)。衣原體常與淋病奈瑟菌混合感染，淋病奈瑟菌對(duì)衣原體的繁殖起激活和促進(jìn)作用。

4.性病淋巴肉芽腫由沙眼衣原體LGV生物亞種（L1、L2、L2a、L3）血清型引起，主要通過性接觸傳播。引起以化膿性腹股溝淋巴結(jié)炎為特征的性病，又稱第四性病。

主要侵犯淋巴組織，女性以累及會(huì)陰、肛門、直腸及盆腔淋巴結(jié)多見，男性以累及腹股溝淋巴結(jié)為常見，發(fā)生化膿性炎癥和慢性肉芽腫，有些可形成瘺管。（二）鸚鵡熱衣原體主要引起鳥類或家禽感染，由感染該衣原體的鳥類等動(dòng)物的糞便污染環(huán)境，以氣溶膠形式傳給人類。使人類發(fā)生上呼吸道感染、肺炎和毒血癥。典型臨床表現(xiàn)為非典型肺炎。也有引起心內(nèi)膜炎的報(bào)道。

（三）肺炎衣原體其傳播方式主要是人與人之間經(jīng)飛沫或呼吸道分泌物傳播。引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎為主，?？沙实胤叫?、散發(fā)性流行，也可引起支氣管炎、咽炎等。該衣原體也可引起慢性感染，其與急性心肌梗死和慢性冠心病的關(guān)系越來(lái)越引起注意。

四、微生物檢驗(yàn)

1.標(biāo)本采集與處理

（1）沙眼衣原體：沙眼和包涵體結(jié)膜炎的患者，取眼穹隆部及瞼結(jié)膜病灶作刮片。子宮頸炎取子宮頸刮片上皮細(xì)胞或分泌物作涂片。標(biāo)本置于運(yùn)送培養(yǎng)基中送檢，常用的運(yùn)送培養(yǎng)基為2SP培養(yǎng)基。

性病淋巴肉芽腫患者可取腹股溝淋巴結(jié)膿液，也可取直腸拭子或活檢材料送檢。（2）鸚鵡熱衣原體：采取患者血液、痰液或咽喉含漱液，痰標(biāo)本用約2～10倍的滅菌肉湯或組織培養(yǎng)液洗脫附著在標(biāo)本上的病原體，用力振搖，制成懸液，置室溫1～2小時(shí)后，低速離心取上清液接種。尸檢材料取肝、脾、肺等組織，也可采腹腔和心包滲出液。

（3）肺炎衣原體：一般利用拭子經(jīng)鼻前庭插入鼻咽部，旋轉(zhuǎn)后取出，利用轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，冷藏送檢。也可采集氣管內(nèi)痰液或肺泡灌洗液。要求24小時(shí)內(nèi)接種或置-70℃保存。2.直接顯微鏡檢查染色鏡檢，尋找上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的包涵體。包涵體即指在易感細(xì)胞內(nèi)含增殖的始體和子代原體的空泡。根據(jù)包涵體的形態(tài)、在細(xì)胞內(nèi)的位置及染色性等特性，對(duì)鑒別衣原體有意義。

（1）吉姆薩（Giemsa）染色：原體呈紫紅色，始體呈藍(lán)色，包涵體呈深紫色。沙眼衣原體包涵體密度低，呈空泡形。鸚鵡熱衣原體和肺炎衣原體包涵體呈深密度的卵圓形，肺炎衣原體在HeLa細(xì)胞中的包涵體形態(tài)與鸚鵡熱衣原體十分相似，但不像鸚鵡熱衣原體具有多形性。

（2）碘液染色：標(biāo)本經(jīng)甲醛固定后，用Lugol碘液染10分鐘，水洗后鏡檢。因包涵體的基質(zhì)含有豐富的糖原，可被碘液染成深褐色，而細(xì)胞的其他部分呈黃色。沙眼衣原體含糖原，碘液染色陽(yáng)性。鸚鵡熱衣原體和肺炎衣原體碘液染色陰性。

（3）可利用抗LPS單抗進(jìn)行直接法熒光抗體染色檢測(cè)上皮細(xì)胞內(nèi)的衣原體抗原。3.酶免法檢測(cè)抗原可檢測(cè)臨床標(biāo)本中的可溶性抗原。

4.核酸檢測(cè)按MOPO基因序列或其他具有種、型特異性的核酸片段，構(gòu)建特異性引物或探針，利用PCR、核酸探針技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。按16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)引物一般具有屬特異性。

5.分離培養(yǎng)各種衣原體均可在雞胚卵黃囊和組織細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，鸚鵡熱衣原體常用小鼠分離。

（1）雞胚卵黃囊接種：將檢查標(biāo)本加適當(dāng)抗生素（如鏈霉素等）處理后接種于雞胚卵黃囊分離培養(yǎng)。（2）細(xì)胞培養(yǎng)：目前常用的細(xì)胞有兩種：即經(jīng)X線照射的McCoy細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。不同種的衣原體有各自最適合的培養(yǎng)細(xì)胞系。沙眼衣原體多用McCoy細(xì)胞，鸚鵡熱衣原體適合用Hela229細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。肺炎衣原體適合用HEP-2和HL細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。為了達(dá)到較好的培養(yǎng)效果，可對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行一定處理，可以用DEAE葡聚糖預(yù)處理，以便增加分離率，也可以用細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，抑制宿主細(xì)胞生長(zhǎng)，以利于衣原體的分離培養(yǎng)。

（3）小白鼠接種：小白鼠對(duì)不同種衣原體的敏感性不同，對(duì)沙眼衣原體不敏感，主要用于鸚鵡熱衣原體的分離。用小鼠腹腔、顱內(nèi)或滴鼻接種。

6.檢測(cè)抗體用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、微量免疫熒光法、酶免法檢測(cè)抗體。

五、治療原則

四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酯類對(duì)衣原體有較高的活性，青霉素類、磺胺、氧氟沙星以及利福平等也有一定的活性，磺胺對(duì)肺炎衣原體無(wú)效。孕婦、哺乳期婦女以及兒童禁用四環(huán)素而首選紅霉素?！纠}】下列何種微生物能通過濾器

A.軍團(tuán)菌

B.分枝結(jié)核桿菌

C.衣原體

D.肺炎克雷伯桿菌

E.流感嗜血桿菌

『正確答案』C

『答案解析』衣原體是一群體積較小，能通過細(xì)菌濾器，細(xì)胞內(nèi)專性寄生，并有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物。【例題】下列說(shuō)法正確的是

A.衣原體與病毒結(jié)構(gòu)相似

B.衣原體可引起非典型肺炎

C.衣原體對(duì)抗生素不敏感

D.衣原體無(wú)自己的酶系統(tǒng)

E.衣原體不能通過濾器

『正確答案』B

『答案解析』人類衣原體病主要包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和肺炎衣原體。其中，鸚鵡熱衣原體主要引起鳥類或家禽感染，由感染該衣原體的鳥類等動(dòng)物的糞便污染環(huán)境，以氣溶膠形式傳給人。使人發(fā)生上呼吸道感染、肺炎和毒血癥。典型臨床表現(xiàn)為非典型肺炎。