六味地黃丸對自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細胞增效作用的量效關系

六味地黃丸對自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細胞增效作用的量效關系【摘要】【目的】觀測六味地黃丸含藥血清對自殺基因HSVtk/GCV系統(tǒng)殺傷大鼠肝癌CBRH7919細胞的增效作用，探討建立自殺基因聯(lián)合中藥方藥的腫瘤基因治療聯(lián)合方案的可行性?！痉椒ā繕嫿℉SVtk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)，并確定丙氧鳥苷的工作濃度;制備SD大鼠4d和8d六味地黃丸灌胃含藥血清和生理鹽水灌胃空白血清；用大鼠肝癌細胞CBRH7919/tk-或tk+與tk-1∶9比例混合細胞按3×103個/孔鋪96孔板，分為空白血清組、GCV加空白血清組、10%tk+/GCV加空白血清組、含藥血清組、GCV加含藥血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合含藥血清組；含藥血清又再分為低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組6個復孔，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，各組分別加入相應空白血清或含藥血清，孵育12h，加入終濃度392μmol/L的GCV，培養(yǎng)60h，采用四甲基偶氮唑鹽法檢測細胞活性，Q值法分析自殺基因系統(tǒng)與含藥血清聯(lián)合的相互作用是否具有協(xié)同性?！窘Y果】空白血清組、含藥血清組、GCV加空白血清組、GCV加含藥血清組細胞均未顯示明顯的細胞毒性。10%tk+/GCV加空白血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合不同濃度的含藥血清組均具有顯著殺傷作用，聯(lián)合組存活率顯著低于10%tk+/GCV加空白血清組；含藥血清中劑量和高劑量組的聯(lián)合作用具有協(xié)同性，且有濃度依賴性。給藥4d血清和給藥8d血清結果無顯著性差異?！窘Y論】六味地黃丸含藥血清對自殺基因系統(tǒng)10%tk+/GCV殺傷大鼠肝癌CBRH7919細胞具有協(xié)同增效作用，且有一定的量效關系。

【關鍵詞】六味地黃丸/藥理學；肝腫瘤/中西醫(yī)結合療法；基因治療；腫瘤細胞，培養(yǎng)

自殺基因療法由于存在旁殺傷效應的獨特機制已成為惡性腫瘤基因治療的研究熱點和最有應用前景的腫瘤基因治療方法，目前已在臨床病人及實驗動物中廣泛用于惡性腫瘤試驗性治療，并已觀察到較好的效果［1-4］。但體內自殺基因治療仍存在載體轉染效率低、靶向性不夠、治療載體的毒副作用等問題，嚴重制約了其臨床應用。進一步提高療效和減少毒副作用是研究熱點之一，聯(lián)合治療則能在一定程度上達到上述目的［5］。中醫(yī)藥是一個偉大寶庫，許多中藥方藥具有肯定的藥理效應［6-8］，聯(lián)合中醫(yī)藥也可能是一種可行的方案。我們已有的初步研究結果表明［9-10］，自殺基因治療聯(lián)合補腎方藥六味地黃丸在體內和體外均能起到協(xié)同增效的作用。本研究擬在細胞水平上對其量效關系作進一步地論證，現(xiàn)將結果報道如下。

1材料和方法

11主要試劑與儀器RPMI1640為Gibco公司產品；新生牛血清為TBD公司產品；四甲基偶氮唑鹽、丙氧鳥苷、二甲基亞砜均為美國Sigma公司產品；細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、凍存管、濾膜等均為美國Corning公司或丹麥MUNC公司產品；BNA3210型CO2培養(yǎng)箱；5WCJ1F超凈工作臺；3K18型高速冷凍離心機;3169型倒置顯微鏡；ALG1104型電子天平；CDBERSCAN510型pH儀；NEXPOWER1000型純水器等。

12細胞株病毒包裝細胞PT67購自美國Clontech公司，已于前期將重組pLXSNtk質粒轉染入PT67細胞內構建了重組病毒包裝細胞，記為PT67tk［11］。大鼠肝癌CBRH7919細胞購自中山大學動物中心細胞庫。前期已用PT67/tk的含病毒上清培養(yǎng)液感染大鼠肝癌CBRH7919細胞，篩選獲得穩(wěn)定整合、表達tk基因的重組大鼠肝癌CBRH7919/tk+細胞［12］。

13實驗動物SD大鼠，體質量180~230g，雄性，健康，清潔級［動物合格證號SCXK2003~0001，粵監(jiān)證字2006A014；環(huán)境合格證號NO0010470］，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

14GCV殺傷敏感性及GCV工作濃度的確定［10］大鼠肝癌細胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+鋪96孔培養(yǎng)板；在鋪板24h后加入梯度濃度GCV，MTT法測定細胞對GCV的敏感性，確定GCV的工作濃度為392μmol/L。

15六味地黃丸含藥血清和空白血清的制備及血清對細胞生長的影響［10］16只SD大鼠隨機分為2組，空白血清組灌胃生理鹽水，六味地黃丸含藥血清組灌胃六味地黃丸，制備4d和8d血清，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。觀測空白血清和含藥血清對細胞生長的影響，結果表明血清能在一定程度上促進細胞增殖，但當血清濃度高于體積分數(shù)20%時細胞形態(tài)出現(xiàn)變化，故實驗時采用對細胞生長影響較小的體積分數(shù)10%以下的血清濃度。

16自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對肝癌細胞的殺傷效應將大鼠肝癌細胞CBRH7919/tk+和CBRH7919/tk-按1∶9的細胞數(shù)混合，作為自殺基因tk/GCV系統(tǒng)作用的細胞；沒有自殺基因系統(tǒng)的實驗組，其作用細胞均為tk-細胞，按3×103個/孔鋪96孔板，分為空白血清組、GCV加空白血清組、10%tk+/GCV加空白血清組、含藥血清組、GCV加含藥血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合含藥血清組；灌胃8d含藥血清又再分為低劑量組、中劑量組和高劑量組，共設12組，每組6個復孔；灌胃4d含藥血清則分為低劑量組和高劑量組，共設9組，每組6個復孔；血清濃度均為體積分數(shù)。用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，加入相應空白血清和含藥血清，孵育12h，再加入終濃度392μmol/L的GCV，培養(yǎng)60h后，以MTT法檢測細胞活性。

17統(tǒng)計學分析和協(xié)同性分析采用SPSS115統(tǒng)計軟件，多組間兩兩比較用OneWayANOVA,LSD法。協(xié)同性分析用金正均Q值法判斷［13］，Q=實驗聯(lián)合藥效R’/理論聯(lián)合藥效R，理論聯(lián)合藥效R=RA+RB-RA×RB，RA、RB為單獨用藥藥效。Q＜085則判斷為拮抗作用；085≤Q＜115則判斷為相加作用；Q≥115則判斷為協(xié)同作用。

2結果

21自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對肝癌細胞的殺傷效應空白血清組、含藥血清組、GCV加空白血清組、GCV加含藥血清組細胞均未顯示明顯的細胞毒性，表明在實驗條件下血清和GCV對腫瘤細胞的生長無明顯影響。自殺基因系統(tǒng)10%tk+/GCV加空白血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合不同濃度的含藥血清組均具有顯著殺傷作用，表明自殺基因系統(tǒng)具有生物學功能；10%tk+/GCV系統(tǒng)聯(lián)合5%、10%含藥血清組的細胞存活率均顯著低于10%tk+/GCV加空白血清組及相對應的含藥血清組，聯(lián)合組的實際抑制率均顯著高于理論抑制率，Q值分別為116、149，均大于115，說明其相互作用具有協(xié)同性，且隨著含藥血清濃度的增高Q值增大，協(xié)同作用增強。結果見表1。

22自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對肝癌細胞的殺傷效應10%tk+/GCV自殺基因治療系統(tǒng)聯(lián)合25%、5%、10%濃度的含藥血清，細胞存活率均顯著低于含藥血清組與10%tk+/GCV加空白血清組。聯(lián)合組的實際抑制率均顯著高于理論抑制率，Q值分別為086、120、142。但25%的含藥血清聯(lián)合組的Q值在085~115之間，為相加作用；而5%、10%濃度聯(lián)合組均Q＞115，說明其增效作用具有協(xié)同性，且隨著含藥血清濃度的增高協(xié)同作用增加。結果見表2。表1自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對肝癌細胞的殺傷效應表2六味地黃丸含藥血清聯(lián)合10%tk+/GCV系統(tǒng)對CBRH7919作用的殺傷效應

3討論

自殺基因治療之所以能成為惡性腫瘤基因治療的研究熱點和最有應用前景的腫瘤基因治療方法，是由于自殺基因治療存在旁殺傷效應的獨特機制。所謂旁殺傷效應是指導入了自殺基因的腫瘤細胞加入前體藥物后，不僅自身被殺死，其鄰近未導入自殺基因的細胞也被殺死的現(xiàn)象［1-2］。旁殺傷效應形成機制的假說主要包括［14］：“縫隙連接”機制；免疫介導機制；“細胞凋亡”機制；介質機制；抗腫瘤血管生成等。由于在整體水平基因轉染效率很低，同時病毒載體的使用也帶來了一定的毒副作用，故自殺基因療法存在旁殺傷效應這一獨特的作用機制具有許多優(yōu)勢，如能減少對高轉染率的要求，減少載體過量引起的毒副作用等。但在目前的情況下，由于體內轉染效率較低等原因，使腫瘤自殺基因治療的效果仍不十分令人滿意。以增強旁殺傷效應為目標的聯(lián)合治療是目前腫瘤自殺基因治療的研究熱點之一?，F(xiàn)有中藥方藥藥理作用的研究結果提示：中藥方藥有可能針對自殺基因旁殺傷效應的機制，通過增強自殺基因旁殺傷效應對腫瘤自殺基因療法產生協(xié)同作用。我們前期的動物在體實驗研究表明，自殺基因療法聯(lián)合滋陰補腎中藥名方六味地黃丸能更有效地抑制小鼠移植性肝癌的生長［9］。初步的體外實驗結果也表明，自殺基因療法聯(lián)合滋陰補腎中藥名方六味地黃丸含藥血清在自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細胞時發(fā)揮協(xié)同作用［10］。本實驗結果顯示：在大鼠血清總濃度為10%的條件下，六味地黃丸灌胃4d的含藥血清在50%、10%含藥血清濃度下，與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合作用的抑制率為2151%、2878%，較單純自殺基因系統(tǒng)的抑制率1449%分別提高了702%、1429%；六味地黃丸灌胃8d的含藥血清，在25%、50%、10%濃度下，與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合作用的抑制率為2666%、3214%、3089%，較單純自殺基因系統(tǒng)的抑制率2193%分別提高了47%、102%、90%，呈現(xiàn)劑量依賴關系。結果表明六味地黃丸能增強自殺基因療法對肝癌細胞的殺傷效應。我們還比較了4d含藥血清和8d含藥血清的增效作用效果，結果顯示無顯著性差異，提示灌胃4d含藥血清即可滿足實驗要求。

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