特異性沉默Eca109細(xì)胞系stathmin基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

特異性沉默Eca109細(xì)胞系stathmin基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建【摘要】目的構(gòu)建并篩選特異性沉默stathmin基因的pSUPERS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆。方法用DNA重組技術(shù)，將64nt能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向stathmin小發(fā)夾RNA的寡核苷酸序列，定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPEREGFP，應(yīng)用脂質(zhì)體將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPERS轉(zhuǎn)染細(xì)胞系Eca109，G418篩選建立穩(wěn)定產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞克隆，RTPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞stathminmRNA的表達(dá)。結(jié)果重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，可見4692nt和285nt條帶；測(cè)序結(jié)果表明插入序列正確；重組載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，可表達(dá)綠色熒光蛋白，經(jīng)G418篩選得到抗性細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)染細(xì)胞stathminmRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯減弱。結(jié)論特異性沉默stathmin基因的pSUPERS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系構(gòu)建和篩選成功。

【關(guān)鍵詞】小干擾RNA；stathmin基因；pSUPEREGFP載體；Eca109細(xì)胞

Abstract：ObjectiveToconstructandidentifyarecombinantretroviralvectorpSUPERSthattargetstathmingeneandastablevirusproducingcell64ntencodedtargetingstathmingeneshRNAsequencewasclonedintoaretroviralvectorpSUPEREGFPwithDNArecombinanttechnique.TherecombinantvectorwasidentifiedbytheelectrophoresisanalysisofrestrictionenzymedigestionandDNAsequencing.ThepackagingcellEca109wastransfectedwiththisrecombinantplasmidusingliposomebasedtransfectionandthestableintergrantwasselectedbyusingG418expressionofstathminmRNAwasdetectedbyRTPCRintransfectedEca109cellelectrophoresisofEcoRⅠandHindⅢdigestedproductsshowedtwoDNAfragments,4692ntand285nt,respectively.Theresultofsequencedemonstratedthat64nthadbeeninsertedintothevector.Greenfluorescentproteinwasobservedaftertransfection.G418resistantcloneswerealsoselected.ComparingwithcontrolgroupstheexpressionofstathmingenewasinhibitedobviouslyintreatedgroupswithpSUPERrecombinantretroviralvectorpSUPERSthatspecificsilencestathmingeneandastablevirusproducingpackagingcelllineweresuccessfullyconstructedandidentified.

Keywords：SmallinterferingRNA;stathmingene;pSUPEREGFPvector;Eca109cells

0引言

食管癌是常見的惡性腫瘤之一。某些基因的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Stathmin為一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)蛋白，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，研究表明[1,2]通過(guò)應(yīng)用反義核酸、單克隆抗體、核酶、stathmin蛋白抑制劑及絲氨酸位點(diǎn)突變體等方法封閉該基因表達(dá)，可使細(xì)胞受阻于G2／M期，同時(shí)使惡性腫瘤表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)。stathmin成為惡性腫瘤生物治療的新靶點(diǎn)。RNA干擾是最新的基因敲除技術(shù)，具有高效性和特異性，能夠降解相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)mRNA，使基因轉(zhuǎn)錄后沉默。本研究應(yīng)用含H1啟動(dòng)子的逆轉(zhuǎn)錄載體pSUPEREGFP構(gòu)建了stathmin基因的siRNA表達(dá)載體pSUPERS，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，以特異性沉默目的基因的表達(dá)，觀察小干擾RNA對(duì)靶基因表達(dá)的抑制作用，探討腫瘤基因治療的新模式。

1材料與方法

材料

細(xì)胞系和質(zhì)粒人食管癌細(xì)胞Eca109、大腸桿菌JM109為鄭州大學(xué)腫瘤中心保存;pSUPEREGFP質(zhì)粒由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院丁一教授惠贈(zèng)，靶向stathmin的64ntoligos由上海生物工程公司合成。

試劑限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶和Trizol試劑購(gòu)自Promega公司;DNAMarker、DNAPurificationkit和RTPCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連寶信生物工程公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectine2000和G418購(gòu)自美國(guó)Invitrogene公司。

方法

靶向stathmin基因寡核苷酸的設(shè)計(jì)應(yīng)用美國(guó)OligoEngine公司提供的雙鏈RNA設(shè)計(jì)軟件，選擇合適的19nt靶序列，通過(guò)Blast搜索確認(rèn)與人的其他基因序列無(wú)同源性。該19nt的序列分別為：5′GAAAGACGCAAGTCCCATG3′，5′ACGAGAGCACGAGAAAGAA3′，由上海生物工程公司合成兩條64nt的互補(bǔ)單鏈，序列見表1。

表1兩條64nt的互補(bǔ)單鏈序列

載體的選擇選用pSUPEREGFP質(zhì)粒為載體，經(jīng)BglⅡ和HindⅢ兩酶切后與合成的64nt的寡核苷酸雙鏈連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSUPERS。該質(zhì)粒含有H1啟動(dòng)子，可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA;質(zhì)粒的報(bào)告基因綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因用于陽(yáng)性克隆的篩選。

寡核苷酸與pSUPEREGFP載體的連接將合成的64nt正義和反義鏈分別溶于三蒸水中，終濃度為3μg/μl;各取1μl，加入48μl退火緩沖液，依次94℃4min，80℃4min，70℃10min，37℃20min，最終緩慢冷卻至室溫進(jìn)行退火反應(yīng)。用BglⅡ和HindⅢ雙酶切pSUPEREGFP載體8h。酶切產(chǎn)物于8g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，用DNAPurificationkit回收4913nt的大片段，得到線性化載體。用T4DNA連接酶分別進(jìn)行連接反應(yīng)，重組載體分別命名為pSUPERS1、pSUPERS2。

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化應(yīng)用1×TSS兩步法，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至新鮮制備的JM109感受態(tài)細(xì)菌中，LB平板上培養(yǎng)10~14h，選取10~20個(gè)中等大小菌落，在含LB液體培養(yǎng)基中37℃振搖10h，堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA。

重組載體的酶切鑒定用EcoRⅠ和HindⅢ酶切重組質(zhì)粒及對(duì)照空質(zhì)粒，各取10μl酶切產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)照空質(zhì)粒雙酶切后應(yīng)觀察到227nt條帶，插入64nt寡核苷酸鏈，陽(yáng)性克隆酶切后應(yīng)觀察到285nt條帶。

測(cè)序鑒定為進(jìn)一步驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性，采用推薦的載體測(cè)序引物送北京三博生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)包括64nt的插入序列，引物序列為:5′GCGTGAATTCGAACGCTGAC3′。

重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系Eca109Eca109細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫孵箱中貼壁培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底70%時(shí)，利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒pSUPERS導(dǎo)入Eca109細(xì)胞，48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。使用g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1∶5傳代培養(yǎng)，24h后換含G418的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，2~3d后改用G418培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，直至陽(yáng)性克隆形成。成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)呈綠色熒光。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞stathminmRNA表達(dá)的檢測(cè)收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的不同處理組Eca109細(xì)胞3×106個(gè)，以Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。采用AMV一步法RTPCR試劑盒檢測(cè)stathminmRNA的表達(dá)。stathmin上游引物：5′ATGGCTTCTTCTGATATCCA3′，stathmin下游引物:5′GTTCACTTCTATTGCCTTCT3′；以βactin為內(nèi)參照，上游引物：5′CCGAGCGCGGCTACAGCTTCA3′，下游引物：5′GAAGCATTTGCGGTGGACGAT3′。產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并攝像。

2結(jié)果

EGFP載體的酶切pSUPEREGFP空載體經(jīng)BglⅡ單酶切后載體線性化，大小為4919nt；EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，觀察到4692nt和227nt的線性片段；BglⅡ和HindⅢ雙酶切，觀察到4913nt線性片段，切出的另一6nt片段未能顯示。結(jié)果與理論值一致，見圖1。

M:DL15000分子量標(biāo)準(zhǔn);A:pSUPEREGFP載體BglⅡ單酶切;B:pSUPEREGFP載體EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切;C:pSUPEREGFP載體BglⅡ、HindⅢ雙酶切

圖1pSUPEREGFP載體酶切鑒定

S重組載體的酶切鑒定隨機(jī)挑取LB平板上的菌落搖菌后提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定。重組質(zhì)粒pSUPERS用HindⅢ單酶切后線性化，觀察到4977nt大小的片段；重組質(zhì)粒pSUPERS雙酶切后觀察到4692nt和285nt的線性片段。結(jié)果與理論值一致，見圖2。

M:DL15000分子量標(biāo)準(zhǔn);A:pSUPERS載體HindⅢ單酶切;B,C:pSUPERS1,pSUPERS2載體EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切

圖2pSUPERS重組載體酶切鑒定

靶序列測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒pSUPERS1、pSUPERS2的測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)合成的靶向stathmin的64nt寡核苷酸序列完全一致，表明靶向stathmin基因的pSUPERS1、pSUPERS2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功。

S重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選重組質(zhì)粒pSUPERS經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到有綠色熒光出現(xiàn)。經(jīng)G418篩選，獲得陽(yáng)性細(xì)胞克隆，見圖3。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞stathminmRNA表達(dá)的檢測(cè)經(jīng)RTPCR擴(kuò)增后，凝膠成像可見內(nèi)參βactin擴(kuò)增片段為545nt，各組電泳條帶無(wú)明顯變化。stathmin擴(kuò)增片段為270nt，pSUPERS穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞stathminmRNA的相對(duì)表達(dá)量較pSUPEREGFP空載體對(duì)照組、空白對(duì)照組明顯減弱，見圖4。

M:DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn);A:空白對(duì)照組;B:pSUPEREGFP空載體對(duì)照組;C,D:pSUPERS1、pSUPERS2載體轉(zhuǎn)染組

圖4轉(zhuǎn)染細(xì)胞stathminmRNA表達(dá)的檢測(cè)

3討論

基因沉默是目前腫瘤基因治療的一個(gè)重要方法，它是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷基因的異常表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入正常分化軌道或引起細(xì)胞凋亡。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，采用合成的1923ntsiRNA直接轉(zhuǎn)染或shRNA經(jīng)載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞可誘導(dǎo)RNAi，對(duì)靶基因mRNA產(chǎn)生特異性降解作用[4,5]。制備siRNA的方法主要有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、制備siRNA混合物、siRNA表達(dá)盒子和siRNA表達(dá)載體法。前三種方法的作用時(shí)間都比較短。siRNA表達(dá)盒子是PCR引發(fā)siRNA表達(dá)模板，SECs依次包含RNA聚合酶啟動(dòng)子、編碼shRNA的模板和RNA聚合酶終止點(diǎn)。將帶有RNA聚合酶啟動(dòng)子和終止子的PCR引物與合成的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可得到大量SECs。siRNA表達(dá)載體法是由polⅢ啟動(dòng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，另有4~5個(gè)T組成的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。polⅢ總是在距啟動(dòng)子固定的位置開始轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)的第2個(gè)U處終止，非常精確。由于質(zhì)粒可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增，這種抑制基因表達(dá)的效果可持續(xù)幾周甚至更長(zhǎng)，適用于較長(zhǎng)周期的研究。食管癌是常見的惡性腫瘤、預(yù)后較差，目前對(duì)于食管癌的基礎(chǔ)研究及臨床治療仍是醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)之一。stathmin基因是從淋巴瘤中篩選出的特征性表達(dá)基因，為一種高度保守的胞內(nèi)蛋白，在細(xì)胞周期過(guò)程中可被蛋白激酶磷酸化，阻斷stathmin磷酸化將使細(xì)胞分裂停止于G2/M期。細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白磷酸化過(guò)程中stathmin是重要調(diào)節(jié)因子[10]，直接影響細(xì)胞分裂及增殖。stathmin在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，封閉該基因表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。本研究采用基因工程技術(shù)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體系構(gòu)建了針對(duì)stathmin基因的shRNA轉(zhuǎn)錄載體pSUPERS。攜帶靶序列的pSUPERS載體是帶有新霉素抗性基因和綠色熒光蛋白編碼基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體帶有依賴RNA聚合酶Ⅲ的H1啟動(dòng)子，可轉(zhuǎn)錄生成針對(duì)靶基因的shRNA，在體內(nèi)加工生成雙鏈的小干擾RNA，進(jìn)而降解相應(yīng)的靶mRNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染分裂期細(xì)胞，使目的基因穩(wěn)定地整合到靶細(xì)胞基因組而長(zhǎng)期表達(dá)，且不產(chǎn)生輔助病毒，具有很好的安全性。通過(guò)脂質(zhì)體將pSUPERS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。經(jīng)G418篩選，獲得了可長(zhǎng)期產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的Eca109細(xì)胞克隆，持續(xù)表達(dá)針對(duì)stathmin基因的shRNA，使靶基因的mRNA降解。為更深入地探討stathmin基因沉默對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞凋亡和增殖分化的影響，進(jìn)而應(yīng)用于食管癌的生物治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

［1］MistrySJ,BenhamCJ,Atwehofribozymesthattargetstathmin,amajorregulatorofthemitoticspindle[J].AntisenseNucleicAcidDrugDev,2001,11(1):4149.

IancuC,MistrySJ,ArkinS,etal.Effectsofstathmininhibitiononthemitoticspindle[J].JCellSci,2001,114(Pt5):909916.

AravinA,TuschlandcharacterizationofsmallRNAsinvolvedinRNAsilencing[J].FEBSLett,2005,579(26):58305840.

BrummelkampTR,BernardsR,AgamisystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells[J].Science,2002,296(5567):550553.

VandenHauteC,EggermontK,NuttinB,etal.LentiviralvectormediateddeliveryofshorthairpinRNAresultsinpersistentknockdownofgeneexpressioninmousebrain[J].HumGeneTher,2003,14(18):17991807.

CastanottoD,LiH,RossiJJ.FunctionalsiRNAexpressio