動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白

動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白第一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五思考要制備出我們想要的蛋白，需要了解些什么，做些什么？第二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五

生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選第三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五

生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得（1）原代細(xì)胞是直接取自動(dòng)物組織器官,經(jīng)過消化分離而獲得。用量大，浪費(fèi)時(shí)間。常用的有：雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞等。NO.1第四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五（2）二倍體細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)過傳代篩選克隆，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。第五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五（3）轉(zhuǎn)化細(xì)胞系常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖能力。自發(fā)人工誘變第六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性

W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,

倍增時(shí)間為24h，有限壽命50代。安全，用于制備疫苗。NO.2第七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。屬成纖維細(xì)胞。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對(duì)不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對(duì)人的病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。第八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細(xì)胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。第九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。第十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選NO.3真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建使用的載體有兩類：1）病毒載體牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒2）質(zhì)粒載體第十一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五1）病毒載體牛痘病毒：用構(gòu)建多價(jià)疫苗腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：用于基因治療。

桿狀病毒：用于外源基因表達(dá)。第十二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五2）質(zhì)粒載體在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)都能擴(kuò)增。都含有如下基本成分：①允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。②含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。④有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。第十三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選第十四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五1）基因載體的導(dǎo)入基因載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞最常用方法是：

磷酸鈣沉淀法電穿孔法

第十五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA—磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸時(shí)，則通過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。第十六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五電穿孔法：

借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)可逆性小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。第十七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五真核生物細(xì)胞生產(chǎn)藥用蛋白優(yōu)點(diǎn)：①具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu),理化特性最接近于天然蛋白分子；②具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；③具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；④具有貼壁生長特性，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，表達(dá)水平較高；⑤CHO（注射用重組人促紅素

）細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離。因此，可以針對(duì)性的篩選細(xì)胞株第十八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五

由于CHO-dhfr-細(xì)胞自身缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），無法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。二氫葉酸還原酶能夠被葉酸類似物氨甲喋呤(methotrexate,MTX)所抑制,用含有目的基因及與之相連的DHFR基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHOdhfr細(xì)胞,利用濃度不斷提高的MTX選擇抗MTX的細(xì)胞系,其中DHFR基因及與之相連的目的基因一起擴(kuò)增,從而使目的基因高水平表達(dá)。主要采用DHFR系統(tǒng)和GS系統(tǒng)

2）高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選二氫葉酸還原酶系統(tǒng)DHFR第十九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五第二十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五DHFR擴(kuò)增僅僅發(fā)生在二個(gè)等位基因中的一個(gè)。在穩(wěn)定系中擴(kuò)增的基因得以保持，因?yàn)樗鼈兾挥谌旧w上DHFR基因座上（均勻染色區(qū)），而其等位基仍保持正常的單拷貝。而在不穩(wěn)定系中當(dāng)選擇壓力消除時(shí)，擴(kuò)增的基因至少會(huì)部分丟失，但未丟失的是以染色體外的方式（雙微體）