分子生物學(xué)基因組概述

分子生物學(xué)基因組概述第一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五CH3

THECONTENT

OFTHEGENOME

基因組概述第二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五3.1Introduction

3.2Genomescanbemappedbylinkage,restrictioncleavage,orDNAsequence(用連鎖、限制酶切割或者DNA測序繪制基因組圖譜

)3.3Individualgenomesshowextensivevariation(個(gè)體基因組變化很大

)3.4RFLPsandSNPscanbeusedforgeneticmapping(RFLP和SNP能夠用來繪制遺傳圖譜

)3.5Whyaregenomessolarge(基因組為何如此之大

)?3.6ThehumangenomehasfewergenesthanExpected(人類基因組的基因數(shù)目比預(yù)想的要少

)第三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五3.7Howmanygenesareessential(有多少基因是必需的

)?3.8Genesareexpressedatwidelydifferinglevels(基因的表達(dá)量相差很大

)3.9OrganelleshaveDNA(細(xì)胞器也含有DNA)3.10OrganellegenomesarecircularDNAsthatcodefororganelleproteins(細(xì)胞器基因組是環(huán)狀ONA分子，它們編碼細(xì)胞器蛋白質(zhì))3.11MitochondrialDNAorganizationisvariable(線粒體DNA的結(jié)構(gòu)是可變的

)3.12Mitochondriaevolvedbyendosymbiosis(線粒體是通過內(nèi)共生演化來的

)3.13ThechloroplastgenomecodesformanyproteinsandRIMAs(葉綠體基因組編碼多種蛋白質(zhì)和RNA)第四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

3.1IntroductionThegenomeisthecompletesetofgenesofanorganism.UltimatelyitisdefinedbythecompleteDNAsequence,althoughasapracticalmatteritmaynotbepossibletoidentifyeverygeneunequivocallysolelyonthebasisofsequence.基因組（genome

）是有機(jī)體內(nèi)一組完整的基因，它最終由DNA的全序列決定，實(shí)際上我們不可能只根據(jù)序列來準(zhǔn)確鑒定每一條基因。第五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五基因組，Genome，一般的定義是單倍體細(xì)胞中的全套染色體為一個(gè)基因組，或是單倍體細(xì)胞中的全部基因?yàn)橐粋€(gè)基因組?？墒腔蚪M測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因編碼序列只占整個(gè)基因組序列的很小一部分。因此，基因組應(yīng)該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。說的更確切些，核基因組是單倍體細(xì)胞核內(nèi)的全部DNA分子；線粒體基因組則是一個(gè)線粒體所包含的全部DNA分子；葉綠體基因組則是一個(gè)葉綠體所包含的全部DNA分子。

第六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

基因是生命遺傳的基本單位，由30億個(gè)堿基對組成的人類基因組，蘊(yùn)藏著生命的奧秘。始于1990年的國際人類基因組計(jì)劃，被譽(yù)為生命科學(xué)的“登月”計(jì)劃，原計(jì)劃于2005年完成。各國所承擔(dān)工作比例約為美國54％，英國33％，日本7％，法國2.8％，德國2.2％，中國1％。此前，人類基因組“工作框架圖”已于2000年6月完成，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)人類基因數(shù)目約為2.5萬個(gè)，遠(yuǎn)少于原先10萬個(gè)基因的估計(jì)。人類基因組是全人類的共同財(cái)富。國內(nèi)外專家普遍認(rèn)為，基因組序列圖首次在分子層面上為人類提供了一份生命“說明書”，不僅奠定了人類認(rèn)識自我的基石，推動(dòng)了生命與醫(yī)學(xué)科學(xué)的革命性進(jìn)展，而且為全人類的健康帶來了福音。第七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五基因組（GENOME）一詞是1920年Winkles從GENes和chromosOEs鑄成的，用于描述生物的全部基因和染色體組成的概念。1986年美國科學(xué)家ThomasRoderick提出了基因組學(xué)（Genomics），指對所有基因進(jìn)行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一門科學(xué)。因此，基因組研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structuralgenomics）和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)（functionalgenomics)，又被稱為后基因組（postgenome）研究。第八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五功能基因組學(xué)（Functuionalgenomics）又往往被稱為后基因組學(xué)（Postgenomics），它利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段，通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使得生物學(xué)研究從對單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向多個(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。這是在基因組靜態(tài)的堿基序列弄清楚之后轉(zhuǎn)入對基因組動(dòng)態(tài)的生物學(xué)功能學(xué)研究。第九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五研究內(nèi)容包括基因功能發(fā)現(xiàn)、基因表達(dá)分析及突變檢測。基因的功能包括：生物學(xué)功能，如作為蛋白質(zhì)激酶對特異蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾；細(xì)胞學(xué)功能，如參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑；發(fā)育功能，如參與形態(tài)建成等。采用的手段包括經(jīng)典的減法雜交，差示篩選，cDNA代表差異分析以及mRNA差異顯示等，但這些技術(shù)不能對基因進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析，新的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，包括基因表達(dá)的系統(tǒng)分析（serialanalysisofgeneexpression,SAGE），cDNA微陣列（cDNAmicroarray），DNA芯片（DNAchip）等。第十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五Thetranscriptomeisthecompletesetofgenesexpressedunderparticularconditions.ItisdefinedintermsofthesetofRNAmoleculesthatispresent,andcanrefertoasinglecelltypeortoanymorecomplexassemblyofcellsuptothecompleteorganism.BecausesomegenesgeneratemultiplemRNAs,thetranscriptomeislikelytobelargerthanthenumberofgenesdefineddirectlyinthegenome.ThetranscriptomeincludesnoncodingRNAsaswellasmRNAs.

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是在特定條件下表達(dá)的一組完整基因，這是根據(jù)細(xì)胞中所存在的某一組RNA分子來決定，它可以指一種細(xì)胞類型，或者是任何一個(gè)更為復(fù)雜的細(xì)胞群體，甚至是一個(gè)完整的有機(jī)體。由于一條基因可能產(chǎn)生多條mRNA分子，所以從轉(zhuǎn)錄組定義的基因數(shù)目可能大于基因組中定義的基因數(shù)目。轉(zhuǎn)錄組包括非編碼的RNA和編碼的mRNA

。第十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics），是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。簡而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)即一個(gè)活細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA。研究轉(zhuǎn)錄組的一個(gè)重要方法就是利用DNA芯片技術(shù)檢測有機(jī)體基因組中基因的表達(dá)。從基因組DNA轉(zhuǎn)錄的基因總和，即轉(zhuǎn)錄組，也稱為表達(dá)譜，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。而研究生物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的發(fā)生和變化規(guī)律的科學(xué)就稱為轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)。第十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

Theproteome

isthecompletesetofproteins.ItshouldcorrespondtothemRNAsinthetranscriptome,althoughtherecanbedifferencesofdetailreflectingchangesintherelativeabundanceorstabilitiesofmRNAsandproteins.Itcanbeusedtorefertothesetofproteinscodedbythewholegenomeorproducedinanyparticularcellortissue.

蛋白質(zhì)組（proteome）是一組完整的蛋白質(zhì)，它應(yīng)該對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄組中的mRNA

。雖然在相對豐度或者穩(wěn)定性上，mRNA和蛋白質(zhì)有一些細(xì)微的差別，但它可以用來指由整個(gè)基因組編碼的一組蛋白質(zhì)，或者在某些特殊的細(xì)胞或組織中產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)。第十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五proteome

蛋白質(zhì)組:蛋白質(zhì)組是指組織或細(xì)胞中所有的蛋白質(zhì)。自從1994年提出此概念以來，對它的研究已逐步走向深入。蛋白質(zhì)組系統(tǒng)地、大尺度地研究一個(gè)器官、組織或細(xì)胞中表達(dá)的是什么蛋白質(zhì)，而且要研究這些蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)性質(zhì)，如修飾等。與基因組學(xué)相比，它是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念。蛋白質(zhì)組的內(nèi)容大于基因組，特別是在真核生物中，可想而知，蛋白質(zhì)的數(shù)量大于基因的數(shù)量是由于RNA在進(jìn)行轉(zhuǎn)譯時(shí)有剪接(Splicing)的作用，在轉(zhuǎn)譯后修飾時(shí)蛋白質(zhì)特殊部位會(huì)有磷酸化或糖基化的作用。第十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組學(xué)（genomics）兩個(gè)詞的組合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識，這個(gè)概念最早是在1995年提出的。第十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)組學(xué)的研究不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為眾多種疾病機(jī)理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。通過對正常個(gè)體及病理個(gè)體間的蛋白質(zhì)組比較分析，我們可以找到某些“疾病特異性的蛋白質(zhì)分子”，它們可成為新藥物設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)，或者也會(huì)為疾病的早期診斷提供分子標(biāo)志。確實(shí)，那些世界范圍內(nèi)銷路最好的藥物本身是蛋白質(zhì)或其作用靶點(diǎn)為某種蛋白質(zhì)分子。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能為人類健康事業(yè)帶來巨大的利益。第十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

蛋白質(zhì)組學(xué)研究中以前最常用的方法是二維電泳（2DE，or2-DElectrophorensis），二維電泳的第一維過程中，蛋白質(zhì)依其等電點(diǎn)的不同被分離開來，第二維的過程是用SDS將蛋白質(zhì)依分子量的不同加以分離，電泳結(jié)束后可將膠片以銀染或CoomassieBlue的方式染色，讓蛋白質(zhì)顯現(xiàn)出來。目前基于色譜分離與質(zhì)譜的大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的中心。這種技術(shù)可以大規(guī)模地對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，通過質(zhì)譜儀把蛋白質(zhì)或肽段的組成信息以一級圖譜與二級圖譜的形式表現(xiàn)出來，最后把這些圖譜與蛋白質(zhì)或肽段產(chǎn)生的理論圖譜相比較確定相似性（也即搜庫），并最終確定樣品中包含那些肽段，并通過肽段與蛋白質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系，最終推斷樣品中包含的蛋白質(zhì)。第十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis）是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進(jìn)行SDS（按照分子大小），經(jīng)染色得到的電泳圖是一個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。等電聚焦電泳（IFE，isoelectricfocusingelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis）第十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學(xué)（比較蛋白質(zhì)組學(xué)）也獲得了廣泛研究。它不僅檢測基因表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，而且要檢測其表達(dá)蛋白質(zhì)的含量。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容可以說是蛋白質(zhì)定量技術(shù)，而這種技術(shù)是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的重要途徑?？傮w來說，蛋白質(zhì)組學(xué)現(xiàn)在只是一種工具，且這種工具還存在許多未解決的問題。第十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五3.2Genomescanbemappedbylinkage,restrictioncleavage,orDNAsequence(用連鎖、限制酶切割或者DNA測序繪制基因組圖譜

)第二十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五Agenetic(orlinkage)map

identifiesthedistancebetweenmutationsintermsofrecombinationfrequencies.Itislimitedbyitsrelianceontheoccurrenceofmutationsthataffectthephenotype.Becauserecombinationfrequenciescanbedistortedrelativetothephysicaldistancebetweensites,itdoesnotaccuratelyrepresentphysicaldistancesalongthegeneticmaterial.

遺傳圖譜（geneticmap）或連鎖圖譜（linkagemap）是根據(jù)重組頻率來確定突變位點(diǎn)之間的距離。這種方法需要依靠對表型有影響的突變體的產(chǎn)生，故其應(yīng)用非常有限，而且由于重組頻率并不能準(zhǔn)確反映位點(diǎn)之間的物理距離，所以它不能確切反映遺傳物質(zhì)的物理距離。第二十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五Arestrictionmap

isconstructedbycleavingDNAintofragmentswithrestrictionenzymesandmeasuringthedistancesbetweenthesitesofcleavage.ThisrepresentsdistancesintermsofthelengthofDNA,soitprovidesaphysicalmapofthegeneticmaterial.

限制圖譜（restrictionmap）是通過用限制性內(nèi)切核酸酶把DNA切成片段，然后測量切割位點(diǎn)之間的距離來構(gòu)建的。這是用DNA的長度來表示距離的，因此，它提供了遺傳物質(zhì)的物理圖譜（physicalmap

）。第二十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五Bycomparingthesequenceofawild-typeDNAwiththatofamutantallele,wecandeterminethenatureofamutationanditsexactsiteofoccurrence.Thisdefinestherelationshipbetweenthegeneticmap(basedentirelyonsitesofmutation)andthephysicalmap(basedonorevencomprisingthesequenceofDNA).(通過比較野生型和突變型等位基因的DNA序列，我們能夠確定突變的本質(zhì)以及突變發(fā)生的準(zhǔn)確位置。通過這種方式，我們可以確定遺傳圖譜（完全根據(jù)突變位置）和物理圖（根據(jù)比較DNA序列）的關(guān)系。)第二十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五Similartechniquesareusedtoidentifyandsequencegenesandtomapthegenome.Ineachcase,theprincipleistoobtainaseriesofoverlappingfragmentsofDNA,whichcanbeconnectedintoacontinuousmap.Thecrucialfeatureisthateachsegmentisrelatedtothenextsegmentonthemapbycharacterizingtheoverlapbetweenthem,sothatwecanbesurenosegmentsaremissing.

(這些相似的技術(shù)可被用來鑒定和測序基因以及繪制基因組圖譜。原則上，我們都要獲得一系列的DNA重疊片段，然后將這些重疊片段互相連接，形成連續(xù)圖譜。關(guān)鍵是通過分析它們之間的重疊部分，在圖譜上，將每一片段與另一片段聯(lián)系起來，這樣我們就能夠確保不丟失某些片段。)第二十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五3.3Individualgenomesshowextensivevariation

(個(gè)體基因組變化很大)

第二十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五TheoriginalMendelianviewofthegenomeclassifiedallelesaseitherwild-typeormutant.Subsequentlywerecognizedtheexistenceofmultiplealleles,eachwithadifferenteffectonthephenotype.Insomecasesitmaynotevenbeappropriatetodefineanyonealleleas“wild-type”.(最初的孟德爾觀點(diǎn)認(rèn)為基因組的等位基因不是野生型就是突變型。后來我們認(rèn)識到機(jī)體存在著多條等位基因，每一條等位基因都會(huì)對表型產(chǎn)生不同的影響，所以在一些例子中，定義某一種等位基因?yàn)橐吧褪遣磺‘?dāng)?shù)摹?第二十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五Figure1.29Thewlocushasanextensiveseriesofalleles,whosephenotypesextendfromwild-type(red)colortocompletelackofpigment.

(w基因座上有一系列的等位基因，其表型從野生型(紅眼)到無色)。紅眼(野生表型)血紅桃紅淺黃蜜黃杏黃曙黃象牙白檸檬黃雜色白色(無色)每個(gè)等位基因具有不同的表型等位基因純合子表型(w+相對其他基因來說是顯性的，它們有很多不同的突變等位基因)第二十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

Thecoexistenceofmultipleallelesatalocusiscalledgeneticpolymorphism.Anysiteatwhichmultipleallelesexistasstablecomponentsofthepopulationisbydefinitionpolymorphic.Analleleisusuallydefinedaspolymorphicifitispresentatafrequencyof>1%inthepopulation.

(我們把在一個(gè)基因座上有多條等位基因的現(xiàn)象稱作遺傳多態(tài)性（geneticpolymorphism）。當(dāng)多條等位基因在一個(gè)種群中穩(wěn)定存在時(shí)，這些等位基因所在的位置被認(rèn)為是多態(tài)性的。如果某條等位基因在種群中存在的概率大于1%，那么我們就可以認(rèn)為它是多態(tài)性的。)第二十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

Achangeinasinglenucleotidewhenallelesarecomparediscalledasinglenucleotidepolymorphism(SNP).Oneoccursevery~1330basesinthehumangenome.DefinedbytheirSNPs,everyhumanbeingisunique.

(當(dāng)比較等位基因時(shí)，其單個(gè)核苷酸的改變被稱為單核苷酸多態(tài)性（SNP）。在人類基因組中，大約每1330個(gè)堿基就有一個(gè)單核苷酸多態(tài)性。從SNP

的角度來看，每一個(gè)人的基因組都是獨(dú)一無二的，SNP可以通過不同的方法進(jìn)行檢測，從直接的序列比較到質(zhì)譜或者生物化學(xué)方法，這些方法都是根據(jù)在特定區(qū)域中序列的變化來顯示差異的。)第二十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五Figure

3.1

Apointmutationthataffectsarestrictionsiteisdetectedbyadifferenceinrestrictionfragments.圖3.1

通過檢測限制片段的大小可以發(fā)現(xiàn)影響酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變DNA在一個(gè)區(qū)段上有三個(gè)靶位點(diǎn)突變消除了其中一個(gè)靶位點(diǎn)酶切產(chǎn)生兩條內(nèi)部片段有一些點(diǎn)突變會(huì)改變限制圖譜酶切產(chǎn)生一條內(nèi)部片段片段C第三十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

Adifferenceinrestrictionmapsbetweentwoindividualsiscalledarestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP).BasicallyaRFLPisaSNPthatislocatedinthetargetsiteforarestrictionenzyme.Itcanbeusedasageneticmarkerinexactlythesamewayasanyothermarker.Insteadofexaminingsomefeatureofthephenotype,wedirectlyassessthegenotype,asrevealedbytherestrictionmap.(兩個(gè)個(gè)體之間的限制圖譜的不同稱作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP）?；旧希粋€(gè)RFLP就是一個(gè)SNP，只是這個(gè)SNP位于一個(gè)酶切位點(diǎn)中，它能夠與任何其他遺傳標(biāo)記一樣，也可同樣用來作為遺傳標(biāo)記。只是它檢測的不是一些特征性表型，而是通過檢測限制圖譜來直接揭示基因型。圖3.2顯示了一個(gè)祖孫三代的限制性多態(tài)家譜，這個(gè)圖譜表明了DNA分子標(biāo)記片段的孟德爾分離規(guī)律。)第三十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五Figure

3.2

RestrictionsitepolymorphismsareinheritedaccordingtoMendelianrules.Fourallelesforarestrictionmarkerarefoundinallpossiblepairwisecombinations,andsegregateindependentlyateachgeneration.圖3.2

限制位點(diǎn)多態(tài)性的遺傳規(guī)律符合孟德爾定律。在所有可能的配對重組中，某個(gè)限制標(biāo)記的4條等位基因都能找到，并且它們在每一代中獨(dú)立地分離.

親代3個(gè)是雜合子，1個(gè)是C的純合子F2代遺傳A或D來自親代一方，B或C來自親代另一方限制性位點(diǎn)表現(xiàn)出孟德爾遺傳的特性第三十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

F1基因可以隨機(jī)進(jìn)入它所產(chǎn)生的配子中

3.4RFLPsandSNPscanbeusedforgeneticmapping(RFLP

和SNP

能夠用來繪制遺傳圖譜

)(PAUSEDHERE，L4—2016)第三十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五3.4RFLP和SNP

能夠用來繪制遺傳圖譜Becauserestrictionmarkersarenotrestrictedtothosegenomechangesthataffectthephenotype,theyprovidethebasisforanextremelypowerfultechniqueforidentifyinggeneticlociatthemolecularlevel.Atypicalproblemconcernsamutationwithknowneffectsonthephenotype,wheretherelevantgeneticlocuscanbeplacedonageneticmap,butforwhichwehavenoknowledgeaboutthecorrespondinggeneorprotein.(由于限制標(biāo)記不限于那些對表型有影響的基因組變化，因此它們成為了分子水平上測定遺傳基因座的有力工具。與已知表型的突變相關(guān)的一個(gè)典型問題是：相關(guān)的遺傳基因座應(yīng)該標(biāo)在遺傳圖譜上的哪一個(gè)位置，而此時(shí)我們還不清楚它們對應(yīng)的基因或者蛋白質(zhì)是什么)。第三十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五補(bǔ)充內(nèi)容——基因的分離與鑒定等引言“克隆”（clone）的含義在當(dāng)今生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域中，克隆一詞被廣泛使用。它不僅在詞義上有名詞和動(dòng)詞之分，而且在不同的學(xué)科之間和不同的研究層次上亦有不同的含義。

在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)個(gè)體或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。

在細(xì)胞水平上，克隆是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（perogenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。

在分子水平上，克隆是指凡帶有一段DNA插入序列的、獨(dú)特的寄主／載體單元。第三十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

克隆是英文clone的音譯，簡單講就是一種人工誘導(dǎo)的無性繁殖方式。

但克隆與無性繁殖是不同的。無性繁殖是指不經(jīng)過雌雄兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合、只由一個(gè)生物體產(chǎn)生后代的生殖方式，常見的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、莖、葉等經(jīng)過壓條或嫁接等方式產(chǎn)生新個(gè)體也叫無性繁殖。綿羊、猴子和牛等動(dòng)物沒有人工操作是不能進(jìn)行無性繁殖的。科學(xué)家把人工遺傳操作動(dòng)物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術(shù)叫克隆技術(shù)。第三十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五基因的克隆：包含待研究的目的基因的分離和鑒定兩個(gè)主要的內(nèi)容。整個(gè)基因克隆的過程則包括如下四個(gè)基本的步驟：

（i）用于基因克隆的DNA材料的選擇，及DNA分子的片段化；

（ii）外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng)；

（iii）將人工重組的DNA分子導(dǎo)入它們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞的程序；

（iv）獲得了重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選（圖1）。

用于基因克隆的DNA材料的來源，主要是從特定組織提取的染色體基因組DNA或是mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝。

第三十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

對于大分子量的染色體基因組DNA分子，必須先片段化成適于克隆的DNA片段群體。這些DNA片段群體，在體外同選擇好的載體分子重組后，被導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞群體中，并涂布在含特定抗菌素的培養(yǎng)基平板上生長。由于載體分子的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞才能夠生長存活，而且每一個(gè)抗性細(xì)胞均生長成一個(gè)菌落（或噬菌斑），即克隆。如此在細(xì)菌中增殖形成的克隆DNA片段之集合體，便叫做基因文庫。Vector(載體)：在分子克隆中攜帶外源DNA的質(zhì)粒、噬菌體或重組體。第三十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五圖1應(yīng)用大腸桿菌作寄主進(jìn)行DNA克隆的綜合實(shí)驗(yàn)方案(箭頭表示有利方向)第三十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五基因的分離從基因文庫中篩選出含有目的基因的特定克隆。這就是所謂的克隆基因的分離。

對于編碼產(chǎn)物是已知的目的基因，一方面可以應(yīng)用互補(bǔ)的核苷酸序列作探針進(jìn)行直接的分離。另一方面，也可以應(yīng)用特定的蛋白質(zhì)抗體及蛋白質(zhì)的功能測定，來篩選克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。

對于其編碼產(chǎn)物未知的目的基因，則需要用特殊的分離手段，諸如差別顯示技術(shù)、差減雜交方法等。此處主要敘述在大腸桿菌中克隆真核基因的一般程序（圖2）并討論基因克隆的不同實(shí)驗(yàn)方案以及重組體克隆的選擇與鑒定等內(nèi)容。第四十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五圖2真核基因克隆的基本步驟第四十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

1.基因組DNA的片段化

（l）利用限制酶片段化基因組DNA的一般問題

基因克隆的頭一步，需要從實(shí)驗(yàn)的生物材料中制備包含“目的基因”在內(nèi)的DNA片段群體。當(dāng)然，這樣的DNA片段群體必須包容著整個(gè)基因組的全部序列，而且還應(yīng)該是高純度的，片段的大小上要適合于基因操作的要求。如果待克隆的給體材料是雙鏈的基因組DNA，那么有好幾種方法都可以用來制備片段化的DNA群體。但其中最簡單的一種辦法是利用限制酶消化給體基因組DNA。這種消化產(chǎn)物，不經(jīng)過凝膠電泳分部分離，就直接用來同載體分子作連接反應(yīng)的克隆方法，叫做鳥槍法(shot-gunapproach)。一、DNA克隆片段的產(chǎn)生與分離第四十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

鳥槍法（shotgunapproach）最明顯的缺點(diǎn)是，所形成的重組體分子，實(shí)際上是一群帶有大小不同的插入片段的重組體的混合群體，篩選工作量大。

目的基因的核苷酸序列中，對所采用的限制酶可能會(huì)存在著一個(gè)甚至數(shù)個(gè)識別位點(diǎn)。就必須同時(shí)分離好幾個(gè)克隆，才有可能獲得目的基因的全序列。

此外，應(yīng)用限制酶消化并對片段化的基因組DNA進(jìn)行克隆，還會(huì)因某些限制片段的分子量太大或太小的緣故，而出現(xiàn)不能被克隆的情況。

選擇用于產(chǎn)生DNA克隆片段的限制酶，還必須考慮到它對DNA序列應(yīng)該具有最佳的識別位點(diǎn)分布規(guī)律。第四十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（2）基因組DNA的雙酶消化策略

1978年，T．Maniatis等人提出了利用兩種限制酶混合消化基因組DNA的實(shí)驗(yàn)策略。應(yīng)用這種方法可以獲得適于克隆的隨機(jī)片段化的DNA群體。他們所選用的均是具有4個(gè)核苷酸識別位點(diǎn)的核酸內(nèi)切限制酶，因此對基因組DNA具有較高的切割頻率。在Maniatis倡議的消化策略中，使用的是兩種識別序列完全無關(guān)的核酸內(nèi)切酶HaeⅢ和AluⅠ。第四十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五2．將DNA片段按大小分離在克隆之前，先對片段化的給體DNA群體進(jìn)行按大小的部分分離，會(huì)明顯地提高克隆基因的分離頻率。

通常是使用瓊脂糖凝膠電泳或蔗糖梯度離心進(jìn)行DNA片段的分部分離。采用瓊脂糖凝膠電泳分部分離技術(shù)，可以在很窄的范圍內(nèi)獲得高純度的某種DNA片段，或是大小相近的DNA片段。第四十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五3．編碼目的基因克隆片段的富集

經(jīng)限制酶消化的基因組DNA，通過凝膠電泳或蔗糖梯度離心之后，不同長度的DNA片段便會(huì)按大小順序彼此分開。根據(jù)事先已測定的編碼目的基因的克隆片段的分子量大小．從電泳凝膠的相應(yīng)譜帶上或蔗糖梯度的相應(yīng)部位中，收集DNA片段，于是便達(dá)到了富集目的基因DNA片段的要求。

應(yīng)用這些方法富集目的克隆片段，有一個(gè)基本的前提，那就是被克隆的目的基因的全序列，必須是位于一條DNA片段上，而不是分布在彼此交疊內(nèi)的數(shù)種片段上。因此，隨機(jī)片段化的DNA是不適用于這種方法的。第四十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五二、重組體DNA分子的構(gòu)建及導(dǎo)入受體細(xì)胞本節(jié)對構(gòu)建重組體DNA分子所涉及的主要步驟（圖3）作簡要的敘述。

1．外源DNA片段同載體分子的重組外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴于限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用。

大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶都能夠切割DNA分子，形成具有1～4個(gè)核苷酸的粘性末端。當(dāng)載體和外源給體DNA用同樣的限制酶，或是用能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶切割時(shí)所形成的DNA末端就能夠彼此退火，并被T4連接酶共價(jià)連接，形成重組體分子。第四十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五圖3構(gòu)建重組DNA分子的途徑第四十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（1）外源DNA片段定向插入載體分子

用兩種不同的限制酶同時(shí)消化一種特定的DNA分子，將會(huì)同時(shí)出現(xiàn)具有兩種不同粘性末端的DNA片段。如果載體分子和待克隆的DNA分子，都是用同一對核酸內(nèi)切限制酶切割，然后混合起來，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子（圖4）

。

第四十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五圖4外源DNA片段定向克隆第五十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（2）非互補(bǔ)粘性末端DNA分子間的連接

具有非互補(bǔ)粘性末端的兩種DNA片段之間，經(jīng)過專門作用于單鏈DNA的Sl核酸酶處理變成平末端之后，可以使用T4DNA連接酶進(jìn)行有效連接。

可以使用附加銜接物的辦法來提高平末端間的連接作用的效率。銜接物是一種用人工方法合成的DNA短片段，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)在其要連接的受體DNA上并不存在的限制酶識別位點(diǎn)。如果要連接的是具有非互補(bǔ)的粘性末端的載體分子和外源DNA片段，可先用Sl核酸酶除去粘性末端，形成平末端的片段，便可按平末端連接法分別給它們加上相同的一段銜接物。如此帶有銜接物的載體分子和外源DNA片段，隨后再用只在銜接物中具有的唯一識別位點(diǎn)的限制酶切割，結(jié)果就會(huì)產(chǎn)生出能夠彼此互補(bǔ)的粘性末端。這樣就可以按照常規(guī)的辦法，用T4DNA連接酶將它們連接起來（圖5）。

此外，應(yīng)用附加接頭或同聚物加尾技術(shù)也能夠有效地連接DNA分子。第五十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五圖5應(yīng)用化學(xué)合成的銜接物構(gòu)建粘性末端進(jìn)行基因克隆的程序5’

CTGCA↓G3’G↓ACGTC第五十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（3）最佳連接反應(yīng)

阻止經(jīng)限制酶切割后的線性載體分子自身的再環(huán)化作用，以提高DNA片段的插入效率。目前通用的有三種辦法：第一，用堿性磷酸酶處理由限制酶消化產(chǎn)生的線性載體分子。第二，使用同聚物加尾連接技術(shù)。第三，應(yīng)用柯斯質(zhì)粒。

在連接反應(yīng)中，正確地調(diào)整載體DNA和外源DNA之間的比例，是能否獲得高產(chǎn)量的重組體轉(zhuǎn)化子的一個(gè)重要因素。如果是應(yīng)用λ噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體時(shí)，配制高比值的載體DNA／給體DNA的連接反應(yīng)體系，則有利于重組體分子的形成。若是使用質(zhì)粒分子作為克隆的載體；當(dāng)載體DNA與給體DNA的比值為l時(shí)，會(huì)有利于這類重組體分子的形成。

第五十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五此外，在體外連接反應(yīng)中，DNA的總濃度對形成什么樣的DNA分子類型同樣也會(huì)有所影響。一般規(guī)律是，低濃度的DNA(低于20μgDNA/ml）分子間的相互作用機(jī)會(huì)少，有利于環(huán)化作用；而高濃度的DNA（高于300～400μgDNA/ml）,則有利于形成長的多連體DNA分子。

連接反應(yīng)的溫度也是影響連接效果的另一個(gè)重要因素。第五十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五2.重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑

基因的擴(kuò)增，是指帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構(gòu)成之后，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞進(jìn)行繁殖，從而獲得大量的單一的重組體DNA分子的過程。

將外源重組體分子導(dǎo)人受體細(xì)胞的途徑，包括轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細(xì)菌一類的原核細(xì)胞和酵母這樣的低等真核細(xì)胞，而顯微注射和電穿孔則主要應(yīng)用于高等動(dòng)植物的真核細(xì)胞。

第五十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（1）重組體DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染

在基因操作中，轉(zhuǎn)化（transformation）一詞嚴(yán)格地說是指，感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程；而轉(zhuǎn)染（transfection）一詞，則是專指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)噬菌體DNA分子的生命過程。但從本質(zhì)上講，兩者并沒有什么根本的差別。無論轉(zhuǎn)化還是轉(zhuǎn)染，其關(guān)鍵的因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞，以提高膜的通透性，從而使外源DNA分子能夠容易地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

細(xì)菌轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）的具體操作程序是：將DNA分子同經(jīng)過氯化鈣處理的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合，置冰浴中培養(yǎng)一段時(shí)間之后，轉(zhuǎn)移到42℃下作短暫的熱刺激。第五十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（2）體外包裝的λ噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)

體外包裝顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是一種使用體外包裝體系的特殊的轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)。它先將重組的λ噬菌體DNA或重組的柯斯載體DNA，包裝成具有感染能力的λ噬菌體顆粒，然后經(jīng)由在受體細(xì)胞表面上的λDNA接受器位點(diǎn)（receptorsites）,使這些帶有目的基因序列的重組體DNA注入大腸桿菌寄主細(xì)胞。第五十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五三、基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案從生物有機(jī)體中克隆某一特定DNA片段（或基因）的實(shí)驗(yàn)程序，總稱為基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案或策略。目前已經(jīng)發(fā)展出了好幾種諸如cDNA克隆和基因組DNA克隆等不同的基因克隆實(shí)驗(yàn)方案。在正式開始實(shí)驗(yàn)之前，正確地選擇一種適宜的克隆方案無疑是十分重要的。如人的-珠蛋白(-globin)，其大小約為1.5kb，而人的單倍體基因組總長度是3106kb左右。那么究竟需要克隆多少個(gè)長度為1.5kb的不同限制片段，才能夠確保(99%)在重組DNA轉(zhuǎn)化子克隆群體中，至少有一個(gè)是獲得了這個(gè)基因的分子呢？第五十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五也就是說一個(gè)完整的人基因組DNA基因文庫，究竟應(yīng)包含多少個(gè)獨(dú)立的克??？這取決于基因組的大小和所克隆DNA片段的平均大小兩個(gè)參數(shù)。理論克隆數(shù)：給體生物(細(xì)菌、真菌、動(dòng)物等)的基因組DNA總量除以克隆片段的平均大小得到，實(shí)際克隆按Clarke-carbon公式計(jì)算。第五十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五克隆片段的平均大小(bp)基因組的大小(bp)2106(細(xì)菌)2107(真菌)3109(動(dòng)物)理論克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù)理論克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù)理論克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù)5103101032010340103400200100501,8319194582784,0002,0001,00050018,4189,2084,6032,300600,000300,000150,00075,0002,763,1101,381,550690,774345,386不同生物的完全基因組基因文庫應(yīng)具有的理論克隆數(shù)和實(shí)際克隆數(shù)理論克隆數(shù)=給體生物的基因組DNA總量/克隆片段的平均大小；實(shí)際克隆按Clarke-carbon公式計(jì)算。第六十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五1.互補(bǔ)作用基因克隆如果被克隆的DNA片段，同重組體DNA分子的寄主細(xì)胞的染色體DNA是同源的，那么使用互補(bǔ)作用進(jìn)行基因克隆，將是一種十分有效的方法。它的一種最簡單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”，即一組含有大腸桿菌基因組全部DNA序列結(jié)構(gòu)的重組體DNA分子的異源群體，導(dǎo)入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株（auxotrophicstrain）的受體細(xì)胞。然后將此受體細(xì)胞涂布在一種缺少該菌株所需要的底物的基本培養(yǎng)基上。因此，只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因的受體細(xì)胞才會(huì)長成轉(zhuǎn)化子菌落。第六十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五2．cDNA基因克隆

cDNA克隆的基本過程是通過一系列的酶催作用，使總poly（A）mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)。如此便構(gòu)成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫（圖6）

。第六十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五圖6具有poly(A)的mRNA在oligo(dT)引物和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，可合成出雙鏈cDNA。隨后將它與質(zhì)粒載體構(gòu)成重組分子，并轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用這種方法能夠分離和擴(kuò)增我們所期望研究的基因或DNA片段末端轉(zhuǎn)移酶（Terminaltransferase,TdT）是一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA分子的3'羥基端。

TdTS1核酸酶第六十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（l）cDNA文庫的構(gòu)建

（i）構(gòu)建cDNA文庫的第一步是分離細(xì)胞總RNA，然后從中純化出主要含mRNA的分部。一段僅由脫氧胸腺嘧啶核苷酸組成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]，能夠同惰性物質(zhì)如纖維素（或瓊脂糖）結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞總RNA制劑通過已用oligo（dT）處理過的纖維素柱時(shí)，mRNA分子的pol（A）尾巴便會(huì)同oligo（dT）序列雜交而粘附到柱子的填充物纖維素上，而其余的rRNA及tRNA分子則流出柱子。經(jīng)過處理，可從纖維素柱子中洗脫下了純凈的mRNA分子（圖7）

。

（ii）構(gòu)建cDNA文庫第二步是合成第一鏈cDNA。其中一種方法叫做oligo（dT）引導(dǎo)的cDNA合成法。

另外一種叫做隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法（randomlyprimedcDNAsynthesis）。此法的基本原理是，根據(jù)許多可能的序列，合成出6～10個(gè)核苷酸長的寡核昔酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在這種情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生。第六十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五poly(A)mRNA與oligo(dT)雜交而被吸附，其它的RNA及rRNA仍處游離狀態(tài)加入總RNA(mRNA,tRNA和rRNA)收集洗脫下來的poly(A)mRNA圖7用纖維素柱純化poly(A)mRNA的流程示意圖oligo(dT)纖維素100mMNaCI洗脫下來的tRNA和rRNA100mMTris1mMEDTA第六十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（iii）構(gòu)建cDNA文庫第三步是將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子?？刹捎米晕乙龑?dǎo)合成法或置換合成。

（iv）構(gòu)建cDNA文庫的第四步是將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞增殖。

重組的方式是先用末端轉(zhuǎn)移酶給雙鏈cDNA分子加尾，或者更常用的是將人工合成的銜接物加到雙鏈cDNA分子的兩端，爾后再同經(jīng)適當(dāng)處理而具有相應(yīng)末端的載體分子連接。將如此構(gòu)成的重組體分子導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，于是便得到了所需的cDNA文庫。圖8表示出了λ噬菌體載體λgt為雙鏈DNA克隆的基本流程。第六十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五圖8以λ噬菌體作載體構(gòu)建成cDNA文庫的流程圖第六十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

λ噬菌體與細(xì)菌質(zhì)粒相比較，它可以攜帶較長的外源DNA片段，其最大容量為18－22kb，這是因?yàn)樵讦耸删w基因組中含有一個(gè)從基因J之后到N之前的非必需區(qū)，也稱為可替代區(qū)，它約占整個(gè)λ基因組的1／3。如果用外源基因片段替代這個(gè)區(qū)域，不會(huì)影響噬菌體顆粒的形成，正是這一特性構(gòu)成了λ噬菌體作為外源基因克隆載體的基礎(chǔ)。

λ噬菌體的感染能力與包裝在衣殼內(nèi)的DNA長度有關(guān)，通常野生型λDNA長度為48.5kb，具有很強(qiáng)的感染力，而當(dāng)DNA長度為野生型λDNA長度的75％或105％時(shí)，λ噬菌體雖然能夠包裝成具有感染性的顆粒，但感染效率明顯降低。若DNA長度短于野生型λDNA長度的75％或超出105％，則不能形成具有感染性的噬菌體顆粒，因此在利用λ載體構(gòu)建基因克隆重組體時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意選擇合適大小的外源DNA片段。第六十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

λgt11和λgt10均可用于cDNA文庫的構(gòu)建，但當(dāng)以核酸探針篩選重組體時(shí)，一般選用λgt10。λgt10在基因CⅠ內(nèi)有一個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，外源基因片段從EcoRⅠ位點(diǎn)的插入可使基因CⅠ失活，重組體呈現(xiàn)為CⅠ表型產(chǎn)生清亮型噬斑，其重組體的繁殖需選用高頻率溶原性突變株。即大腸桿菌的hfl突變株，λgt10在此宿主菌中不能形成噬斑，而重組體能以正常的效率感染宿主菌，并且有效地產(chǎn)生噬斑，利用這一特性可對重組體進(jìn)行篩選。λ噬菌體第六十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

λgt11是一種表達(dá)型的載體，這種λ載體不僅可以擴(kuò)增外源DNA片段，而且還可在大腸桿菌中表達(dá)外源DNA片段。該載體帶有大腸桿菌的LacZ基因片段，在半乳糖苷酶基因終止密碼子上游的53bp處存在單一的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，它可供外源基因片段的插人。在特定的宿主菌中，當(dāng)插人的外源基因具有正確的密碼閱讀框架時(shí)，外源基因能隨半乳糖苷酶基因的表達(dá)而表達(dá)，并產(chǎn)生由β半乳糖苷酶的氨基端部分與下游外源基因編碼的肽鏈構(gòu)成融合蛋白。利用融合蛋白的抗體可對重組體進(jìn)行篩選。為了使融合蛋白在宿主菌中不致于降解，一般選擇蛋白水解酶缺失的突變株(lon-)作為宿主菌，常用的宿主菌為Y1089和Y1090。λgt11的特點(diǎn)在于能使外源基因具有較高的表達(dá)水平，因此凡是以抗體作為重組體篩選時(shí)，應(yīng)該選用λgt11。λ噬菌體第七十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

溫和噬菌體λ的同源重組簡介

λ噬菌體的基因組可以進(jìn)行兩種形式的重組：同源重組:λDNA—λDNA之間的重組；非同源重組:λDNA—E.coli的染色體DNA之間的重組。

1)重組基因

λ基因組上有三個(gè)重組基因：red、int和xis，它們的位置都在附著位點(diǎn)att的旁邊。int和xis是整合和切離過程中起主要作用的基因，red是同源重組中起主要作用的基因。λ噬菌體第七十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五2)λ的復(fù)制和重組系統(tǒng)游離λ的DNA是線狀的，感染寄主細(xì)胞以后粘性末端(cohesiveend,cos)連接成為環(huán)狀分子。在λ基因O和P的作用下大約產(chǎn)生20個(gè)環(huán)狀分子以后復(fù)制方式便轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)環(huán)式或σ式。通過這一方式形成多聯(lián)體?；駻產(chǎn)物Ter蛋白作用于cos位點(diǎn)而把多聯(lián)體中屬于一個(gè)基因組的DNA切下，并為頭部蛋白包裝起來成為成熟的噬菌體。第七十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五（2）cDNA克隆的優(yōu)越性

第一，cDNA克隆以mRNA為材料，這對于有些RNA病毒，它們的增殖并不經(jīng)過DNA中間體，特別適用。

第二，cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行。

第三，由于每一個(gè)cDNA克隆都含有一種mRNA序列，這樣在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率就會(huì)比較低。

第四，cDNA克隆除了具備前述優(yōu)點(diǎn)之外，還具有其自身的特殊用途。這包括兩個(gè)方面，即克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因(獲得一種特殊的真核蛋白質(zhì)產(chǎn)物)和用作基因序列結(jié)構(gòu)的測定(有效地分析間斷基因的結(jié)構(gòu))。

第七十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五

3．基因組DNA克隆基因組DNA克隆與cDNA克隆不同，它的出發(fā)材料是基因組DNA。

由于cDNA分子比較小，可以在質(zhì)粒載體上克隆。高等真核生物染色體基因組DNA的基因文庫，通常是用λ噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體構(gòu)建的。

（1）應(yīng)用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫

構(gòu)建基因組文庫的第一步是，從給體生物制備基因組DNA，并用限制酶消化法產(chǎn)生出適于克隆的DNA片段。然后，在體外將這些DNA片段同適當(dāng)?shù)摩耸删w連接成重組體分子，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的受體細(xì)胞中去。最后，從轉(zhuǎn)化子克隆群體中挑選出含有目的基因的克隆。

下面舉例說明基因文庫的建立。第七十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期五1)采用HaeⅢ-AluⅠ雙酶消化法，選用兩種識別序列毫不相關(guān)的核酸內(nèi)切限制酶

HaeⅢ（5′…GG↓CC…3′）和AluI5′…AG↓CT…3′）對真核基因組DNA作局部混合酶切消化，收集到大小為20kb左右的隨機(jī)的DNA片段群體。由于這兩種酶切的結(jié)果形成的都是平末端的DNA片段分子，所以需要加用適宜的銜接物