PCR產(chǎn)物的TA克隆28DNA的膠回收和連接29

PCR產(chǎn)物的TA克隆(DNA的膠回收和連結(jié))【實驗原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在適合濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進行電泳，不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分別開。切下帶有所需DNA片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。2.利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’尾端加上一個非模板依靠的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連結(jié)酶作用下，能夠把PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點，可用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。商品化的T載體有好多。本實驗采用TaKaRa企業(yè)的pMDTM18-TSimpleVector。這個載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，除去了pUC18載體上的多克隆酶切位點，經(jīng)EcoRⅤ酶切后在兩側(cè)的3＇端添上“T”制備而成（見附錄1）。由于本載體上除去了多克隆酶切位點，克隆后的PCR產(chǎn)物將無法使用載體上的限制酶切下，需要在PCR擴增引物上導(dǎo)入合適的酶切位點?！驹噭┡c器材】（一）試劑1.pMDTM18-TSimpleVectorKit（Takara企業(yè)）。2.TAE電泳緩沖液3.瓊脂糖（Agarose）4.6×電泳加樣緩沖液：0.25％溴粉藍，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于4℃。1/75.溴化乙錠(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。6.70%乙醇7.膠回收試劑盒（Omega企業(yè)）（二）器材水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心計,恒溫水浴鍋,微量移液槍,微波爐或電爐,紫外透射儀,凝膠成像系統(tǒng)或其余照相設(shè)施?！静僮鞣椒ā浚ㄒ唬┠z回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物（以O(shè)mega企業(yè)GelExtractionKit為例）1.當(dāng)目的片段DNA完全分別時，轉(zhuǎn)移凝膠至紫外燈上盡可能快地切下目的片段。2.凝膠塊轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管(離心管已經(jīng)稱重了)中，稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積（假定其密度為1g/ml）。加入等體積的BindingBuffer（XP2），于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠完全融化，每2-3min振蕩混淆物。（在凝膠完全溶解之后，注意凝膠-Bindingbuffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的話，DNA的產(chǎn)量將大大減少。如果是橙色或紅色，則要加入5μl濃度為5M，pH為5.2的醋酸鈉，以調(diào)低其pH值。該混淆物的顏色將恢復(fù)為正常的淺黃色。）3.取一個干凈的HiBindDNAMini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(nèi)（已備好）。4.將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉(zhuǎn)移至柱子中。室溫下10,000xg離心1分鐘。棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。5.如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul，一次只能轉(zhuǎn)移700ul至柱子中，余下的可持續(xù)重2/7復(fù)第5步至所有的溶液都經(jīng)過柱子。每一個HibindDNA回收純化柱都有一個極限為25μgDNA的吸附能力。如果預(yù)期產(chǎn)量較大，則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱子中。6.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。轉(zhuǎn)移300μlBindingBuffer（XP2）至柱子中，室溫下，10,000xg下離心1min。7.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。轉(zhuǎn)移700μlSPWWashbuffer（已用無水乙醇稀釋的）至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。（濃縮的SPWWashBuffer在使用以前必須按標(biāo)簽的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩沖液在使用以前是置于冰箱中的，須將其拿出置于室溫下）。8.重復(fù)用700μlSPWWashbuffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。9.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。室溫下,13,000xg離心2min以甩干柱子基質(zhì)剩余的液體。把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入15~30μ（l詳細(xì)取決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度）的ElutionBuffer(或TE緩沖液)到柱基質(zhì)上，室溫放置1min,13,000xg離心1min以洗脫DNA。第一次洗脫能夠洗出70-80%的聯(lián)合DNA。如果再洗脫一次的話，能夠把剩余的DNA洗脫出來，可是那樣的濃度就會較低。（二）連結(jié)反響（以Takara企業(yè)pMDTM18-TSimpleVectorKit為例）1）在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5μl。pMDTM18-TSimpleVector1μlInsertDNA0.1pmol～0.3pmoldH2Oupto5μl3/72）加入5μl（等量）的SolutionI。3）16℃反響30分鐘。（2kbp以上長片段PCR產(chǎn)物進行DNA克隆時，連結(jié)反響時間請延伸至數(shù)小時）。4）全量（10μl）加入至100μl感覺態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。5）42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。6）加入890μlLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計數(shù)白色、藍色菌落。）精選白色菌落，判定載體中插入片段的長度大小?！咀⒁馐马椗c提示】1.使用新鮮的電泳緩沖液TAEBuffer。不要重復(fù)使用，其PH的升高會減少產(chǎn)量。2.無論采取何種方法回收DNA，在回收過程中，要盡量減少洗脫體積，以便提高收得率和濃度，以方便后續(xù)操作。3.從膠上回收DNA時，應(yīng)盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm)，以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。4.連結(jié)反響時間是與溫度親密有關(guān)，因為反響速度隨溫度的提高而加速。往常可采用16℃連結(jié)4小時為宜，如是平端連結(jié)需要適合延伸反響時間以提高連結(jié)效率；在選擇反響的溫度與時間關(guān)系時，也要考慮在反響系統(tǒng)中其他因素的影響。5.連結(jié)反響的整個過程應(yīng)注意槍頭的干凈以防止造成對酶的污染，為防備酶活性降低，取酶時應(yīng)在冰上操作且動作快速。7.4/76.連結(jié)反響應(yīng)在25℃以下進行，溫度升高較難形成環(huán)狀DNA，影響連結(jié)效率。長片段PCR產(chǎn)物（2kb以上）進行連結(jié)時，連結(jié)反響時間應(yīng)延伸至數(shù)小時。7.進行克隆時，VectorDNA和InsertDNA的摩爾數(shù)比一般為1:2~10。根據(jù)實驗情況選擇合適的摩爾數(shù)比。8.用高效的感覺態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)變效率≥1×108cfu/μgpUC19），這樣才可能獲得比較理想的陽性克隆。9.試劑盒配有ControlDNA。經(jīng)過比較實驗判斷試劑盒的保留效果。【實驗安排】第一天下午：配制6×電泳加樣緩沖液、TAE等緩沖液，將各樣耗材滅菌。次日上午：制備瓊脂糖凝（1%），電泳檢測，切膠回收DNA片段次日下午：大腸桿菌制備感覺態(tài)細(xì)胞；DNA與T載體連結(jié)轉(zhuǎn)變大