基因組學(xué)技術(shù)概要

第一講緒論Genomics：以生物信息學(xué)分析為手段研究基因組的組成、結(jié)構(gòu)、參加進(jìn)行了人體基因作圖，測定人體23對染色體由3×109核苷酸組成的全部HGP的目標(biāo):(1)人類DNA測序(2)發(fā)展測序技術(shù)(3)鑒定人類基因組變異(4)發(fā)展有效的基因組學(xué)技術(shù)(5)比較基因組學(xué)mn11(1)基因組學(xué)依賴于測序；(2)基因組學(xué)是數(shù)據(jù)引導(dǎo)的學(xué)科，而不是假說驅(qū)動的；第二章基因組研究主要網(wǎng)站介紹?蛋白質(zhì)序列(已知的和預(yù)測的)ibusdbSNPetceO快速找到與長度大于40個堿基的序列的相似性大于等于95%的序列，是BLAST-LikeAlignmentTool,但不是BLAST，可用于找到序列在基因組中的位22atedwithatrackintextformattocalculateintersections第三章測序原理與進(jìn)展一組(4種)熒光標(biāo)記引物，其序列相同，但標(biāo)記的熒光染料顏色不同。定義：將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上熒光標(biāo)記終止底物法的異同點(diǎn)：33SOLiDSOLiD測序(雜交的方法)[本版本重點(diǎn)介紹雜交過程]R堿基，反復(fù)進(jìn)行循環(huán)，便可以邊合成邊測序)IIuminasequencingtechnology測序：完成擴(kuò)增，這時每一個DNA片段都在平板上擴(kuò)增為了一簇；判斷第一個堿基(每一輪合成都加入四種不同熒光素序44N[附注：細(xì)心的同學(xué)可能會有這樣的疑問：每一種顏色的熒光都對應(yīng)四種堿基對 (見上圖)，在確定序列時怎樣確定第一個堿基呢？老師上課時也沒有講清楚，優(yōu)缺點(diǎn)DNA100bp的片段，將DNA分子變性后在其末端連接A剪切掉堿基上的阻斷集團(tuán)，在加入其他種類的dNTP，同樣的步驟進(jìn)行合成測序……第四講遺傳圖譜與物理圖譜真核生物在減數(shù)分裂過程中染色體進(jìn)行重組和交換，染色體上任意兩點(diǎn)之間發(fā)生重組和交換的概率隨著兩點(diǎn)之間相對距離的遠(yuǎn)近而發(fā)生變化。構(gòu)建遺傳圖譜的意義：55通過連鎖分析，可以找到某一致病基因或表型的基因與某一標(biāo)記鄰近(緊密連鎖)的證據(jù)，從而可把這一基因定位與染色體的特定區(qū)域，再對基因進(jìn)行不同的DNA結(jié)構(gòu)按其在染色體上的原始順序和實際距(1)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-taggedsite,STS)圖譜(2)DNA重疊群(DNAcontig)圖譜：3遺傳作圖的標(biāo)記(1)可識別性：親本間存在多態(tài)性(即差異)(2)可遺傳性：親本間存在的多態(tài)性在后代中可以重演(1)基因標(biāo)記(性狀標(biāo)記)a.形態(tài)學(xué)性狀標(biāo)記，個體上可以看見的遺傳標(biāo)記基因(如花色\株高\(yùn)體b.生化性狀基因(如血型系列\(zhòng)血清蛋白\免疫蛋白\同工酶)(2)DNA標(biāo)記(DNAmarkers)：以DNA片段為標(biāo)記，通過DNA片段的電泳66DNA)物77repeat,VNTR)重復(fù)單位長度為幾十個核苷酸在不同生物體中存在不同類型，如人類(AC)n(AAN)n植物(AT)n水稻(GA)n(GT)n--檢測STR：不同樣本重復(fù)區(qū)域有差異(重復(fù)次數(shù)不同)但PCR引物結(jié)合區(qū)域--STR應(yīng)用：微衛(wèi)星具有很大變異性(基因組復(fù)制的“滑移”現(xiàn)象)因此用來建立醫(yī)鑒定、親緣鑒定等88(1)理論上等位型最多為4，實際多為2(3)數(shù)量極大(4)SNP與人類易感性疾病有關(guān)，涉及藥物基因組學(xué)(5)編碼區(qū)SNP主要分布于密碼子的第3個堿基(1)DNA芯片技術(shù)(詳見下圖)(2)液相雜交技術(shù)(詳見下圖)7遺傳作圖--一些概念介紹：孟德爾遺傳定律(分離、自由組合)。連鎖與部分連鎖。重組99--遺傳作圖的理論基礎(chǔ)(也學(xué)過瞄一眼就行)&圖譜構(gòu)建：(2)重組熱點(diǎn)的存在(3)近端粒區(qū)&遠(yuǎn)著絲粒區(qū)重組率高(4)性別之間有重組率差異(5)雙交換的存在1、有性雜交(老鼠\果蠅\水稻)2、系譜分析(人\多年生樹木)3、DNA轉(zhuǎn)移(不能減數(shù)分裂的生物細(xì)菌\酵母)(1)親本分析：a親本間多態(tài)性程度與親緣距離：正相關(guān)，因此要擴(kuò)大親本親緣關(guān)系，以獲b度：有關(guān)-識別位點(diǎn)堿基數(shù)越多，多態(tài)性片段越長，多態(tài)性越高同限制酶產(chǎn)生的片段不同，多態(tài)性有差異-篩選具多態(tài)性的分子標(biāo)記-篩選高多態(tài)性的限制酶-控制多態(tài)性標(biāo)記在圖譜中數(shù)量合適、均勻分布(2)作圖群體分析(以雙親為對照，觀察分子標(biāo)記的帶型重組情況)：b.圖譜長度(各連鎖群長度、基因組總長)c.標(biāo)記密度(分子標(biāo)記密度足夠大時稱高密度圖譜)--遺傳圖譜局限性：分辨率有限(交換數(shù)目&后代有限)、覆蓋面低、排列會有差錯環(huán)節(jié)：染色體(大分子DNA提取)->DNA(大片段DNA克隆)->作圖文庫(物理作圖)->物理圖譜a.低等生物基因組物理作圖A法息(1)在染色體上位置獨(dú)一無二(2)序列已知，方便PCR檢測 (1)表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetagEST)來源于cDNA克隆EST來(2)SSLP可以建立遺傳圖譜與物理圖譜的聯(lián)系(3)隨機(jī)基因組測序(注：ppt上原話是“隨機(jī)基因組順序”)A.放射雜交量載體中所產(chǎn)生的的物理作圖中目優(yōu)點(diǎn):單拷貝復(fù)制，不會基因重組發(fā)生嵌合；的最好方法——克隆指紋排序15為何繪制遺傳圖譜&物理圖譜(1)由上至下：全基因組鳥槍法測序(2)由下至上：基于克隆物理圖的測序-克隆重疊群指導(dǎo)的測序(1)由上至下：全基因組鳥槍法測序shotgun稱“霰彈法”，“鳥槍法”(2)由下至上：基于克隆物理圖的測序-克隆重疊群指導(dǎo)的測序法：NAerprintingdatabase每五個泳道就是一個已知分子量的分子量每五個泳道就是一個已知分子量的分子量的makerHindIII切為小片段凝膠電泳，填補(bǔ)上空位ceFISH(fluorescenceinsituhybridization)熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)——證實小片段在染色體上的位置。wer(4)Autofinish：填補(bǔ)空缺，提高序列質(zhì)量等。可為填補(bǔ)空缺自動挑選模板和Hamilton路徑類算法自成一個結(jié)點(diǎn)Lander—Waterman模型——計算覆蓋度(2)DeBruijnGraph(DBG)——EULERPath類算法a轉(zhuǎn)換成圖論問題deBruijn圖邊：兩個K-mers重疊(K-1)個單元hingoingarcmerge(1)首先移除tips(節(jié)點(diǎn)末端不連接的部分)，有兩個標(biāo)準(zhǔn)：(2)再移除bubbles(起始和終止節(jié)點(diǎn)相同的路徑):TourBus算法(3)最后移除錯誤的連接困難：(1).基因組組中的重復(fù)序列似，比測序的讀長長很多(2)基因組覆蓋的不均一性(3)處理數(shù)據(jù)量測序錯誤與基因組序列的多態(tài)性第六講：基因組注釋組成了人類基因組的45%，涉及到RNA調(diào)節(jié)物(反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)或者DNA調(diào)節(jié)物(DNA轉(zhuǎn)座子)。長末端重復(fù)的轉(zhuǎn)座子(RNA介導(dǎo))長的散置的片段(LINES)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶短的散置片段(SINEs)(RNA介導(dǎo))包括Alu重復(fù)。DNA轉(zhuǎn)座子(組成了人類基因組的3%)4就像失活的拷貝(在這些拷貝中，轉(zhuǎn)座酶不在發(fā)揮作用)fer變，不能編碼有功能的蛋白。(4)部分復(fù)制s連續(xù)存在的多拷貝重復(fù)序列：這包括端粒的重復(fù)和著絲粒的重復(fù)。重復(fù)(“垃圾DNA”)(3)序列多樣性體現(xiàn)在核苷酸水平而不是蛋白質(zhì)水平，所以很難檢測同源性。(1)利用非PolyA依賴的克隆方法分離(2)微陣列tRNARNA證據(jù)(ESTs)1確定已知基因共有的特征2建立一個計算框架/模型，用來精確的描述這些現(xiàn)象?？捎脕磉M(jìn)行基因預(yù)測的統(tǒng)計學(xué)特征：的模型及方法：構(gòu)的限制性基因功能，包括結(jié)構(gòu)域分析你感興趣的特異性功能地圖11基因本體論(GO)：第七章轉(zhuǎn)錄組研究Abundant3用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交2逆轉(zhuǎn)錄擇(1)5’端 (3)兩端測序(1)去除低質(zhì)量的序列f剪切。發(fā)現(xiàn)新基因是基因組研究的熱點(diǎn),使用生物信息學(xué)方法預(yù)測新基因是后基因組時代必不可少的方法。利用對某一特異組織或某一生長發(fā)育階段的cDNA文庫,進(jìn)行隨機(jī)部分測序所ESTs序列在以上數(shù)據(jù)庫中存在同源序列,可對該ESTs所代表基因的分開性的時T癌癥基因組解析計劃P所 (2)將短片段標(biāo)簽相互連接形成長的DNA分子，對該克隆進(jìn)行測序得到大量特定的序列標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對應(yīng)的基因的表達(dá)豐度。同時測定細(xì)胞內(nèi)數(shù)千個基因的表達(dá)情況樣品的檢測A.按技術(shù)手段、探針類型分類sAffymetrixB.按實驗要求分類Stanford開發(fā)設(shè)計，通常為雙通道，常用于差異表達(dá)基因的篩選。A.選擇硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龍膜等支持物B.采用光導(dǎo)化學(xué)合成和照相平板印刷技術(shù)在硅片等表面合成寡核苷酸探針;或相應(yīng)位置上7微陣列實驗的優(yōu)點(diǎn)：NA程度等)4.探針的標(biāo)記5.RNA的抽提6.加樣7.其他因芯片的數(shù)據(jù)分析(1)差異表達(dá)基因的分析(2)基因共表達(dá)分析(3)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類(4)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分類(1)差異表達(dá)基因的分析調(diào)的基因?如果處理本身并不顯著，則結(jié)果無意義(2)基因共表達(dá)分析：相似的表達(dá)譜，可能存在正關(guān)聯(lián)：相反的表達(dá)譜，可能存在負(fù)調(diào)控(3)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類將表達(dá)譜相似的基因聚類在一起(4)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分類根據(jù)基因表達(dá)的數(shù)據(jù)將樣本分成兩類或多類–癌癥的亞型、不同階段(良性的vs.惡性的)進(jìn)TRssDNA。單鏈DNA病毒。基因組小(2-7kb)，且一般為環(huán)狀；二十面體衣dsRNA。雙鏈RNA病毒。二十面體衣殼；衣殼完整地留在細(xì)胞內(nèi)(保護(hù)基A受損；(3)蛋白質(zhì)合成受抑制是普遍現(xiàn)象。是與宿主有相同的命運(yùn)，宿主死亡，則病毒也無法生存)；侵染多種宿主(優(yōu)勢優(yōu)化)。和釋放。16、HIV病毒。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，HIV病毒從猿類中起源(生物信息學(xué)工具——LANL)。物具有較高的GC含量)和突變假說。LGT的要求&步驟：臨近供體DNA；DNA在環(huán)境中有穩(wěn)定性；載體傳遞；吸收9、MUMmer：比較兩個高度相關(guān)的序列，遍歷所有至少為某一長度(比如20第13講利用新一代測序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究1.基因:表達(dá)，可變剪切3.一些重復(fù)序列copyDNAshearDNA>linkers連接起來fSOLiD乳膠PCRg)SOLiD測序Primaryanalysis個distributereadsC：落在基因外顯子的mappablereads數(shù)量1.分配單一mappringreadsN：mappablereads總數(shù)(庫間標(biāo)準(zhǔn)化)2.基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化L：基因外顯子長度(庫內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化)比對，從概率上分拼接，形成兩個子庫(已知junctionA分析：因表達(dá)譜分析：基因表達(dá)譜聚類分析?非編碼區(qū)鑒定與注釋2.整合所有的已知轉(zhuǎn)錄區(qū)，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫排序為這些區(qū)域命名效的檢測?重復(fù)序列表達(dá)分析?內(nèi)含子表達(dá)分析(如候選polyA轉(zhuǎn)錄本，候選-表達(dá)情況尚不明確)芯片-相對表達(dá)(去背景過程中可能去掉了與調(diào)控相關(guān))RNA-seq:絕對表達(dá)?基因產(chǎn)物直系同源簇的分析(COG)EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)的代謝途徑分析-KEGG?優(yōu)勢：?未知基因組序列的物種的高通量轉(zhuǎn)錄組研究?(相對于芯片技術(shù))-對于基因表達(dá)譜有非常寬的檢測范圍。在有內(nèi)顯示出了較高的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。?不需要克隆，樣本少，可以在單細(xì)胞水平進(jìn)行表達(dá)譜分析?通量高，成本低A挑戰(zhàn) ?海量短序列數(shù)據(jù)的比對或拼接情況復(fù)雜，對重復(fù)序列和多匹配序列剪接和反式剪接的鑒定仍有相當(dāng)?shù)恼`差。 ?測序深度的確定因物種、器官、組織、時期而變，很難有統(tǒng)一公式 線蟲綱;昆蟲：果蠅、按蚊;海膽450MYA:魚310MYA:恐龍、雞5-50MYA:靈長目動物第一個基因組被測出的多細(xì)胞生物?估測異染色質(zhì)長度：通過直接在減數(shù)分X上異染色質(zhì)block有多態(tài)性(1/3~1/2)Y幾乎全部異染色質(zhì)化DNA9%轉(zhuǎn)座子(長度67%單一序列乎全部序列是重復(fù)性的4蚊(Mosquito)?特征：相似性：?埃及伊蚊基因組?注釋?與其他生物進(jìn)化關(guān)系：5紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)[非脊索后口動物中唯一被測序的，幫助我們了解生物過程(如氣味感知和免疫過程)的進(jìn)化]A特征：棘皮動物門，放射對稱的殼，移動緩慢，食藻類，體外受精A基因組?高雜合性因組，補(bǔ)充全基因組鳥槍法測序組裝6玻璃海鞘(Cionaintestinalis)A高等位基因多態(tài)性?轉(zhuǎn)座序列少但是多樣性高?有全基因組復(fù)制(WGD)：輔鰭魚世系中的WGD有爭議-WGD產(chǎn)緊跟著WGD，染色體重排發(fā)生(分裂，融合，易位)，減少到218雞(Gallusgallus)s 一個祖先開始的染色體易位都很少，而染色體內(nèi)部重排(如倒位)更常見?多基因家族的擴(kuò)展和收縮是哺乳類和鳥類各自獨(dú)立進(jìn)化的主要因素復(fù)序列中反轉(zhuǎn)錄酶具有高特異性(CR1LINE)MB的基因數(shù)和島數(shù)-負(fù)相關(guān)d.平均基因長度(內(nèi)含子正相關(guān)，外顯子負(fù)9有袋目負(fù)鼠(Opposum)A基因組anislupusfamiliaris?哺乳動物基因組差異：狗-最低轉(zhuǎn)座子插入率鼠-最高刪除率人-最低核苷酸?哺乳動物中有一套常用的功能序列?50%高保守nc序列cluster在~200基因缺乏區(qū)域。大部分含有在識別中起重要作用的基因(如轉(zhuǎn)錄因子，軸突指導(dǎo)受體)?鼠特異基因擴(kuò)展：嗅覺受體基因家族?替換率和插入/缺失率都比人高A黑猩猩基因組:的CpG替換率在雄性與雌性精子中比非CpG區(qū)域更接近?插入刪除比單堿基替換少(逆轉(zhuǎn)錄病毒序列)?人類和黑猩猩的同源蛋白十分相似?原始人類進(jìn)化中的正選擇個更小的蛋白質(zhì)歧化率?外顯子沉默位點(diǎn)的替換比相鄰的內(nèi)含子位點(diǎn)低>更弱的清潔選擇低重組區(qū)域:G+C低>高分歧；反之……(2)雄性減數(shù)分裂的突變率是雌性的兩倍，大多數(shù)突變發(fā)生在雄性當(dāng)中。(3)超過1.4百萬個單核苷酸突變多態(tài)性被確定。(3)D組中心粒在染色體的一端。(4)18號染色體具有最低的基因密度。(5)19號染色體具有最高的基因密度。(6)Y染色體包括中心粒(1M)，長臂(40M)，island(400kb)(1)單基因疾病(常顯常隱)，(2)復(fù)雜基因疾病(中樞神經(jīng)疾病)(3)基因組疾病(染色體數(shù)目變化)(4)感染疾病(5)環(huán)境疾病(1)基因組太大。(2)突變機(jī)制較多。(1)比較正常和患者基因(2)基因定位(3)突變效果(4)功能基因組(5)(1)連接分析(家系)(2)GWAS(全基因組關(guān)聯(lián)分析)(3)染色體異常鑒定(4)DNA測序.分子進(jìn)化:基因或蛋白的進(jìn)化模式和機(jī)制，有時涵蓋序列基礎(chǔ)上的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)。 .進(jìn)化遺傳學(xué):群體遺傳學(xué)和近緣物種中的物種形成。 .進(jìn)化發(fā)育生物學(xué)(EvoDevo):主要生物(門)的發(fā)育和它們的進(jìn)化結(jié)果的基因進(jìn)化基因組學(xué)的初步定義研究基因組進(jìn)化的機(jī)制以及在基因組水平研究物種及其特征進(jìn)化的遺傳機(jī)制(也稱比較基因組學(xué))的一門生物學(xué)學(xué)科。進(jìn)化基因組學(xué)的研究方法1.計算生物學(xué)手段：數(shù)據(jù)分析、挖