基因克隆的質(zhì)粒載體

基因克隆的質(zhì)粒載體第一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五

載體通論（一）基本概念載體：在基因工程中，用于承載、克隆、轉(zhuǎn)移目的基因(DNA片段)，能自我復(fù)制的DNA分子。（二）分類

克隆載體表達載體質(zhì)粒載體噬菌體載體人工染色體按載體功能分按載體性質(zhì)分第二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五在基因克隆時：將目的片段轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進行復(fù)制克隆——克隆載體；在基因?qū)胧荏w時：將目的片段轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中并進行使之表達——轉(zhuǎn)化載體或表達載體。常用基因工程載體有：細(xì)菌質(zhì)粒(克隆)；λ噬菌體(克隆)；柯斯質(zhì)粒(克隆)；穿梭質(zhì)粒(克隆/表達)；細(xì)菌人工染色體(克隆/表達)；酵母人工染色體(克隆/表達)；Ti質(zhì)粒及其衍生載體(轉(zhuǎn)化)。第三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五表達體載體宿主第一代原核生物表達體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌第二代酵母表達體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類細(xì)胞表達體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)動物細(xì)胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個體第四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（三）基因工程載體必須具備的條件：

※（1）有復(fù)制起點

※（2）具有若干個限制性內(nèi)切酶的單一識別位點

※（3）具備合適的篩選標(biāo)記

※（4）具備合適的拷貝數(shù)目（5）分子量要相對較小（6）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高（7）易分離純化※表示載體必須具備的條件第五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（四）基因工程中常用的載體

基因工程中常用的載體有5類：

質(zhì)粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（cosmid）

動物病毒（virus）

第六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征第七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)

質(zhì)粒載體

一、質(zhì)粒（plasmid）是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍藻、酵母等細(xì)胞中。第八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌的質(zhì)粒第九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五在大腸桿菌的各種菌體中找到了許多種不同類型的質(zhì)粒，其中已經(jīng)作了比較詳盡研究的主要有F質(zhì)粒、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。

①F質(zhì)粒又叫F因子或性質(zhì)粒（sexplasmid）。它們能夠使寄主染色體上的基因和F質(zhì)粒一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體細(xì)胞中去。

②R質(zhì)粒通稱抗藥性因子。它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能夠?qū)⒋朔N抗性轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。

③Col質(zhì)粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌是一類可以使不帶有Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死的蛋白質(zhì)。第十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（1）分子?。?.質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1—200kb（2）編碼基因少：2—3個中等大小的蛋白質(zhì)。（3）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。（酵母的“殺傷質(zhì)粒”是RNA）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。第十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五1．當(dāng)其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時，稱之為共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA），這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型；

2．如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時，稱之為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構(gòu)型；

3．若質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后，發(fā)生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA），通稱L構(gòu)型（4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型：第十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（5）質(zhì)粒空間構(gòu)型與電泳速率在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移就緒。其中走在最前沿的是SC

DNA，其后依次是LDNA和OCDNASCOCL第十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（1）質(zhì)粒的類型：在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒:非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移2質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移第十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五按接合轉(zhuǎn)移功能分類主要基因按抗性記號分類非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，產(chǎn)生大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)

接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒第十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。（1.1）接合型質(zhì)粒不符合基因工程的安全要求。第十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（2）F質(zhì)粒(Fplasmid)又稱F因子、致育因子或性因子，是大腸桿菌等細(xì)菌決定性別并有轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒。分子量約為大小94kb，共編碼19個轉(zhuǎn)移基因。F質(zhì)粒在寄主細(xì)胞中有三種存在形式：以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，不帶來自寄主染色體的基因或DNA區(qū)段。以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，攜帶著細(xì)菌的染色體基因或DNA區(qū)段。以線性DNA形式從不同位點整合到寄主染色體上。第十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五F質(zhì)粒結(jié)構(gòu)：tra區(qū)（轉(zhuǎn)移區(qū)，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和性菌毛合成有關(guān)）oriT（轉(zhuǎn)移起始點）oriS復(fù)制起始點）inc（不相容群）rep（復(fù)制功能）轉(zhuǎn)座因子第十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五根據(jù)F質(zhì)粒在細(xì)胞中的存在方式，可把大腸桿菌分成四種不同接合型菌株。（1）F+菌株F+菌株即“雄性”菌株，指細(xì)胞內(nèi)存在一至幾個F質(zhì)粒，并在細(xì)胞表面著生一至幾條性菌毛的菌株。（2）F-菌株F-菌株即“雌性”菌株，指細(xì)胞中無F質(zhì)粒、細(xì)胞表面也無性菌毛的菌株。第十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（3）Hfr菌株（高頻重組菌株）在Hfr菌株（高頻重組菌株）細(xì)胞中，因質(zhì)粒由游離態(tài)轉(zhuǎn)為在核染色體組特定位點上的整合態(tài)，故Hfr菌株與F-菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率比單純用F+與F-接合后的頻率高出數(shù)百倍。（4）F’菌株當(dāng)Hfr菌株細(xì)胞內(nèi)的F質(zhì)粒因不正常切離而脫離核染色體組時，可重新形成游離的、但攜帶整合位點鄰近一小段核染色體基因的特殊F質(zhì)粒，稱F’質(zhì)?；騀’因子。第二十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五在合適的條件下，將雄性細(xì)胞和雌性細(xì)胞混合培養(yǎng)，由于性須的作用，就會形成雌-雄細(xì)胞配對，這種過程稱為細(xì)菌的接合作用（conjunction）。F因子DNA拷貝，需1分鐘時間從雄性細(xì)胞轉(zhuǎn)移到雌性細(xì)胞第二十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（3）質(zhì)粒DNA的接合轉(zhuǎn)移

①細(xì)胞交配對的形成雄性細(xì)胞的性須頂端與受體細(xì)胞表面接觸之后，便會迅速收縮，把給體細(xì)胞與受體細(xì)胞拉在一起。因此，性須在確立配對細(xì)胞表面間的緊密接觸方面，起著至關(guān)重要的作用。

大腸桿菌雄性細(xì)胞是不會同其它的亦帶有F質(zhì)粒的細(xì)胞發(fā)生配對作用的，因為traS和traT編碼的“表面排斥”蛋白質(zhì)，使此種細(xì)胞無法成為接合作用的受體。這就決定了雄性細(xì)胞只能同不具F因子的雌性細(xì)胞配對的特異性。

②質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移

F質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移是從轉(zhuǎn)移起點oriT開始的。當(dāng)細(xì)胞交配對建立之后，TraY和TraI蛋白質(zhì)首先在oriT位點作單鏈切割，隨后缺口鏈在其游離的5′-端的引導(dǎo)下轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并作為模板合成互補鏈，形成新的質(zhì)粒分子。于是受體細(xì)胞便轉(zhuǎn)變成為具有F因子的雄性細(xì)胞。第二十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第二十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五2.非接合型質(zhì)粒：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。（1）R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。第二十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第二十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col質(zhì)粒：大腸桿菌素對不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)粒或R質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。第二十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五

非接合型的質(zhì)粒，由于分子小，不足以編碼全部轉(zhuǎn)移體系所需要的基因，因而不能夠自我轉(zhuǎn)移。但如果在其寄主細(xì)胞中存在著一種接合型的質(zhì)粒，那么它們通常也是可以被轉(zhuǎn)移的。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫做質(zhì)粒的遷移作用（mobilization）。

ColE1是一種可以遷移但是屬于非接合型的質(zhì)粒。需要質(zhì)粒自己編碼的兩種基因參與。一個是位于ColE1DNA上的特異位點bom；另一個是ColE1質(zhì)粒特有的彌散的基因產(chǎn)物，即mob基因（mobilizationgene）編碼的核酸酶。3質(zhì)粒DNA的遷移作用第二十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第二十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五相容性的兩種質(zhì)粒F和ColE1共存于同一細(xì)菌細(xì)胞中，F(xiàn)質(zhì)?？梢詾镃olE1質(zhì)粒提供其所缺乏的結(jié)合功能，這樣使得ColE1質(zhì)粒也能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移作用。（a）表示位于F-細(xì)胞中的ColE1質(zhì)粒的狀，它的mob基因進行了轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物使bom位點發(fā)生單鏈斷裂而出現(xiàn)缺口，于是ColE1DNA便從超盤旋的的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為缺口環(huán)狀的構(gòu)型。但ColE1質(zhì)粒缺乏形成性須的能力，無力進行結(jié)合配對，所以它的DNA也就不能從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。正是由于不能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移，這種從超盤旋到缺口環(huán)狀的構(gòu)型轉(zhuǎn)變過程，就有可能被回復(fù)，所以就出現(xiàn)這兩種構(gòu)型之間的平衡狀態(tài)。（b）中的細(xì)胞同時含有F和ColE1兩種質(zhì)粒。F因子能夠?qū)е滦皂毜暮铣?，為其DNA轉(zhuǎn)移提供了轉(zhuǎn)移裝置，因此ColE1可以被轉(zhuǎn)移。而在F質(zhì)粒提供的這種轉(zhuǎn)移裝置被分離掉的情況下，ColE1的mob-突變體便不能夠轉(zhuǎn)移。遺傳分析證明，mob-突變是隱性的，mob基因編碼一種蛋白質(zhì)。而且當(dāng)這種突變體質(zhì)粒被分離出來時，并不是以松弛復(fù)合物的形式存在。（c）所示，F(xiàn)質(zhì)粒無力幫助mob-突變體進行轉(zhuǎn)移，其中F性須和轉(zhuǎn)移裝置雖已形成，但ColE1DNA并沒有發(fā)生缺口。（d）表示另一種具mob+表型并帶有一個順式顯性突變的ColE1突變體，它缺失了bom位點。在這樣的寄主細(xì)胞中，雖然能夠合成mob蛋白質(zhì)，但由于不能發(fā)生缺口，因此仍然不能夠轉(zhuǎn)移。第二十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五4質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型1.低拷貝數(shù)的質(zhì)粒拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝，也稱為“嚴(yán)緊型”復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringentplasmid）2.高拷貝的質(zhì)?？截悢?shù)多，有10—60份拷貝，也稱為“松弛型”復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxedplasmid）（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。根據(jù)寄主細(xì)胞所含的拷貝數(shù)的多少，將質(zhì)粒分為低拷貝數(shù)的質(zhì)粒和高拷貝數(shù)的質(zhì)粒第三十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)?？截悢?shù)：每條細(xì)菌染色體所平均具有的質(zhì)粒DNA分子數(shù)目。質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力，同它們的分子大小及復(fù)制類型間存在一定的相關(guān)性。接合型質(zhì)粒，分子量大，一般屬嚴(yán)緊型非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型第三十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第三十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（1）質(zhì)粒的不親和性現(xiàn)象

所謂質(zhì)粒的不親和性（plasmidincompatibility），有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒

不親和群（incompatibilitygroup），指具有親緣關(guān)系，但彼此之間是互不相容的質(zhì)粒。

5質(zhì)粒的不親和性第三十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（2）質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)

質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的。

大多數(shù)質(zhì)粒都會產(chǎn)生出一種控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其濃度是與質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比的。阻遏蛋白質(zhì)通過同其靶序列間的相互作用，使雙鏈DNA中的一條鏈斷裂，從而導(dǎo)致質(zhì)粒DNA復(fù)制的啟動，并建立起一種調(diào)節(jié)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)反饋環(huán)（negativefeedbackloop）。當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白質(zhì)時，其復(fù)制活動便被抑制；而當(dāng)質(zhì)粒處于低拷貝和低濃度遏蛋白質(zhì)的條件下，它的復(fù)制反應(yīng)便會繼續(xù)進行。

由于每一種質(zhì)粒的復(fù)制速率和拷貝數(shù)控制，都是由一對不相容質(zhì)粒產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)總濃度聯(lián)合調(diào)控的，這種交叉抑制的結(jié)果，使細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)，比其單獨感染狀態(tài)下的正?？截悢?shù)減少許多。第三十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五同一細(xì)胞中含有兩種不相容的質(zhì)粒，其產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)不僅調(diào)節(jié)自身的復(fù)制，也會調(diào)節(jié)另一種與之共存的不相容質(zhì)粒的復(fù)制第三十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五一．質(zhì)粒DNA復(fù)制的多樣性不同質(zhì)粒DNA的復(fù)制在如下幾個方面存多樣性：（i）對寄生酶的依賴性

有的完全利用寄主細(xì)胞所提供的核酸酶，有的自身也編碼若干核酸酶，參加DNA復(fù)制（ii）DNA聚合酶的利用

多數(shù)利用polIII,有的質(zhì)粒利用polI（iii）復(fù)制的方向性

有純單向的，純雙向的，有既有單向又又雙向的（iv）復(fù)制的終止

單向復(fù)制，在起點處終止復(fù)制雙向復(fù)制，在復(fù)制叉到達同一位點時終止，或有一固定的終止位點（v）復(fù)制型

蝶狀復(fù)制第二節(jié)質(zhì)粒DNA的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制第三十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五ColE1質(zhì)粒DNA的復(fù)制，是從一個特定的復(fù)制起點（ori）開始，并沿著環(huán)DNA分子單向性地進行?？刂拼朔N質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動的兩種關(guān)鍵因素RNAI和RNAⅡ兩種RNA分子，都是由ColE1DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。RNAⅡ也叫做復(fù)制引物。RNAⅡ分子在轉(zhuǎn)錄起點附近同互補的模板DNA形成一種雜交分子，被RnaseH酶所切割，從而釋放出3′-OH末端，作為供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。RNAⅠ可以通過同RNAⅡ結(jié)合，以阻止其與模板DNA發(fā)生雜交作用。

從本質(zhì)上講，ColE1質(zhì)粒的復(fù)制啟動顯然是受一種負(fù)反饋機理控制的。根據(jù)這種模型，細(xì)胞中RNAⅠ分子的濃度是隨著質(zhì)粒拷貝數(shù)的多寡而增減的。例如，若細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)下降到正常數(shù)值以下的水平，RNAⅠ的濃度也就相應(yīng)降低，于是質(zhì)粒的復(fù)制也就受到較少的抑制，結(jié)果導(dǎo)致其拷貝數(shù)的上升。二．ColE1質(zhì)粒DNA復(fù)制的啟動第三十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五三．質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型質(zhì)粒DNA復(fù)制控制機理的分子模型有兩種：自體阻遏蛋白質(zhì)模型（autorepressormodel）：阻遏蛋白質(zhì)的合成受負(fù)反饋（negativefeedback）機理調(diào)節(jié)，而且其濃度是恒定的。抑制蛋白質(zhì)稀釋模型（inhibitordilutionmodel）：阻遏蛋白質(zhì)是組成型合成，其濃度同質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。第三十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（1）抑制蛋白質(zhì)稀釋模型質(zhì)粒DNA編碼的抑制蛋白質(zhì)同質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點（oir）結(jié)合阻斷起始蛋白質(zhì)Rep的合成細(xì)胞中Cop蛋白質(zhì)的濃度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)成正比，它抑制質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的作用方式有兩種途徑第三十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五1.質(zhì)粒DNA的復(fù)制是由一種叫做起始蛋白質(zhì)Rep引發(fā)的Rep蛋白質(zhì)編碼基因rep和自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr是屬于同一個操縱子，它們共轉(zhuǎn)錄成同一個mRNA分子。自體阻遏蛋白質(zhì)通過同啟動子-操縱基因區(qū)（P/O）的結(jié)合作用，調(diào)節(jié)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細(xì)胞中Atr和Rep蛋白質(zhì)處于恒定的水平。由Atr蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的Rep蛋白質(zhì)，則是通過同復(fù)制起點（ori）的結(jié)合，來引發(fā)質(zhì)粒DNA的復(fù)制2.Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)既具有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用又具有起始蛋白質(zhì)的功能，能對復(fù)制起點（ori）發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進行復(fù)制（2）自體阻遏蛋白質(zhì)模型第四十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第四十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)質(zhì)粒DNA的分離與純化應(yīng)用質(zhì)粒作為基因克隆的載體分子，一個重要的條件是要獲得批量的純化的質(zhì)粒DNA分子。通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促使大腸桿菌細(xì)胞裂解的，絕大部分的染色體DNA分子都將以高分子量的形式釋放出來，這樣便可以應(yīng)用高速離心的方法使之與細(xì)胞碎片一起被沉淀除去，得到了比較清亮的裂解液。第四十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五一．氯化銫密度梯度離心法

在細(xì)胞裂解及DNA分離的過程上，大分子量的細(xì)菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應(yīng)的線性片段，而質(zhì)粒DNA則由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。

氯化銫-EtBr密度梯度離心法，就是根據(jù)這一差別建立的純化質(zhì)粒DNA的經(jīng)典技術(shù)。當(dāng)將含有溴化乙錠（EtBr）的氯化銫（CsCl）溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中時，EtBr扁平分子便會通過在堿基對之間的嵌入作用而結(jié)合成DNA分子鏈上，并因此導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋反應(yīng)。線性的或開環(huán)的DNA分子，例如大腸桿菌染色體DNA片段，可結(jié)合相當(dāng)大量的EtBr分子。而像質(zhì)粒這樣的共價閉合環(huán)狀的DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的結(jié)合數(shù)量相對較少。在DNA-EtBr復(fù)合物中，結(jié)合的EtBr分子數(shù)量越多，其密度也就越低。通過氯化銫密度梯度離心之后，根據(jù)它們的不同密度，就會平衡在不同的位置，從而達到純化質(zhì)粒DNA的目的。第四十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五線性的或開環(huán)的DNA分子，可結(jié)合相當(dāng)大量的EtBr分子，密度低共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的結(jié)合數(shù)量相對較少，密度高通過氯化銫密度梯度離心，根據(jù)它們的不同密度，就會平衡在不同的位置，從而達到純化質(zhì)粒DNA的目的。第四十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第四十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五

根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片段之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。

通過加熱，在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，連接DNA互補鏈之間的氫鍵會被斷裂，但由于cccDNA的雙螺旋主鏈骨架的彼此盤繞作用，互補的兩條鏈仍然會緊密地結(jié)合在一起。通過致冷或恢復(fù)中性pH值更會迅速地復(fù)性，復(fù)性迅速而準(zhǔn)確。

線性的染色體DNA分子，在此過程中彼此已經(jīng)分離開來的互補鏈之間的復(fù)性作用就不會那么迅速而準(zhǔn)確。它們聚集形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心分離便會與變性的蛋白質(zhì)及RNA一道沉淀下來。仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒cccDNA則可用酒精沉淀法收集。二．堿變性法第四十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五

微量堿變性法具有簡單快速、經(jīng)濟實惠的優(yōu)點，是當(dāng)前分子生物學(xué)及基因工程研究工作中最常用的一種分離純化質(zhì)粒DNA的方法

第一步，取1.5毫升含有質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀，并用100微升冰冷的溶液I[50mM葡萄糖，25MmTris-HCl（Ph8.0），10MmEDTA，4～5mg溶菌酶/mL]重新懸浮。將反應(yīng)混合物在室溫下靜置5分鐘，讓溶菌酶充分發(fā)揮效力，促使大腸桿菌細(xì)胞變得脆弱而易于裂解。溶菌酶對反應(yīng)液的pH值有很大的依賴關(guān)系，TrisHCl緩沖體系和適量的葡萄糖而有利于pH的調(diào)節(jié)。乙二胺四乙酸（EDTA），可抑制酸酶的活性，從而保護質(zhì)粒DNA免被降解。

第二步，加入200微升冰冷的溶液Ⅱ[0.2NNaOH,1.0%SDS]，緩緩混勻后，置室溫下5分鐘。SDS的作用在于使細(xì)胞裂解，以釋放質(zhì)粒及染色體的DNA。在高pH值（12.0～12.5）的反應(yīng)體系中，則會使線性缺口的質(zhì)粒DNA以及線性的染色體DNA片段被選擇性地變性，而共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA則不會受影響。三．微量堿變性法第四十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸鈉，緩緩震蕩10秒鐘后，放置在冰浴中5分鐘。PH4.8的醋酸鈉溶液降低了反應(yīng)混合物中的pH值，起到中和作用，從而使線性的質(zhì)粒及染色體DNA復(fù)性，并聚集成不可溶的網(wǎng)絡(luò)狀聚合物。同時高濃度的醋酸鈉亦會引起蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和高分子量的RNA分子發(fā)生沉淀。通過離心處理，便可把網(wǎng)絡(luò)狀的DNA聚合物同變性的蛋白質(zhì)-DNA及RNA等以復(fù)合物形式沉淀出來，從而使質(zhì)粒DNA得到純化。第四步，將上述離心所得的主要是含有質(zhì)粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提數(shù)次除去蛋白質(zhì)污染物，最后按酒精沉淀法收集質(zhì)粒DNA。

按照這種方法制備的質(zhì)粒DNA，其純度完全可以滿足常規(guī)的基因克隆實驗要求。如有必要亦可用凝膠過濾法作進一步的純化。第四十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（1）寄主菌株的遺傳背景

大腸桿菌寄主菌株的正確選擇，是獲得高產(chǎn)量質(zhì)粒DNA的重要條件之下。建議使用endA基因發(fā)生突變的（endA1）大腸桿菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突變的結(jié)果，使大腸桿菌寄主細(xì)胞失去了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶I的能力，從而增進了所含有的質(zhì)粒DNA分子的穩(wěn)定性。所以從這類寄主細(xì)胞中制備的質(zhì)粒DNA不僅在質(zhì)量上有所改進，同時在產(chǎn)量上也得到了提高。四．影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素第四十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子大小

細(xì)菌培養(yǎng)物中質(zhì)粒DNA之理論產(chǎn)量，可以根據(jù)公布的質(zhì)粒的拷貝數(shù)和分子量大小（bp）及每毫升培養(yǎng)物中的大腸桿菌細(xì)胞總數(shù)三者相乘得出。質(zhì)粒分子拷貝數(shù)的多寡和質(zhì)粒分子大小是決定其DNA產(chǎn)量的重要因素之一。第五十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（1）分子量大，拷貝數(shù)低第四節(jié)質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.天然質(zhì)粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長

9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當(dāng)克隆位點，Tetr作為篩選標(biāo)志。天然質(zhì)粒,是指那些沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。在大腸桿菌中，常見的要用于基因克隆的天然質(zhì)粒有ColE1RSF2124和pSC101等。第五十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第五十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第五十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標(biāo)志不理想可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點

EcoRI正好位于這個基因的內(nèi)部。第五十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五ColE1第五十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（1）

具有復(fù)制起點（ORI）2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。用來插入外源DNA片斷。且插入后不影響復(fù)制功能。第五十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。第五十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性

（Kanr）四環(huán)素抗性

（Tetr）鏈霉素抗性

（Strr）氯霉素抗性

（Cmlr）3.質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理：（1）選擇標(biāo)記①抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇記號，包括有新陳代謝特性、對大腸桿菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。第五十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五

常用抗菌素的抗性工作原理i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長的細(xì)菌。a）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)。第五十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Cmlr

編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ?。a）抑菌原理第六十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五a）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯讀。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Kanr

編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。第六十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五iv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理通過與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯譯。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Strr

編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對鏈霉素進行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。第六十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五v）四環(huán)素（Tetracycline，Tet）b）細(xì)菌抗性原理a）抑菌原理通過于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。Tetr編碼特異性蛋白質(zhì)，對細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進行修飾，組止四環(huán)素通過細(xì)胞膜進入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。第六十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第六十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第六十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五②

遺傳標(biāo)記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。第六十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第六十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素第六十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五4.人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點。而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達到每個細(xì)胞的拷貝數(shù)1000—3000個！適合大量增殖克隆基因、或需要表達大量的基因產(chǎn)物。第六十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

但有特殊用途:由pSC101派生來的載體特點是分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達產(chǎn)物過多時會嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴增DNA用。適合于克隆含量過高對寄主代謝有害的DNA。第七十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（3）失控的質(zhì)粒載體（runawayplasmidvectors）這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。溫度低（低于37oC），拷貝數(shù)很少；溫度增加（>40oC）時，拷貝數(shù)會很快增加到1000個以上。1979年B.E.Uhlin等構(gòu)建。如pBEU1、pBEU2。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2～3小時。這期間編碼在質(zhì)粒載體上的基因產(chǎn)物便超過了常量。最后，細(xì)胞生長受到了抑制，并失去了存活的能力，但在這個階段質(zhì)粒DNA可累積到占細(xì)胞總DNA的50%。第七十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（4）

插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點位于其某一個選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐酝庠碊NA無抗菌素抗性選用插入失活型質(zhì)粒，將外源DNA片段插入在會導(dǎo)致選擇記號基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位點，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽性克隆的幾率。第七十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（5）正選擇的質(zhì)粒載體(Directselectionvectors)如pUR2、pTR262等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。具有直接選擇記號并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。通過選擇具這種表型特征的轉(zhuǎn)化子，便可大大降低需要篩選的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，從而減輕了實驗的工作量，提高了選擇的敏感性。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。第七十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（6）

表達型質(zhì)粒載體主要用來使外源基因表達出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄—翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。使克隆在大腸桿菌中特定位點的外源真核基因的編碼序列置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯信號控制之下，并能在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱為表達載體（expressionvectors）。它分為表達型質(zhì)粒載體和表達型噬菌體載體兩種不同的類型。第七十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五復(fù)制起始點ORI、選擇標(biāo)記、多克隆位點MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因

I操縱基因O啟動基因P核糖體結(jié)合位點序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。1）普通載體元件①表達載體的結(jié)構(gòu)第七十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第七十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五五、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體

1.pSC101第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長度9.09kb。（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr第七十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五6個克隆位點：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點第七十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第七十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五2.ColE1（1）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長度6.3kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因（immE1）特點是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達到每個細(xì)胞1000-3000拷貝之多！第八十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五①colicinE1基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea+kil基因產(chǎn)物③

不被其他細(xì)菌的colicinE1所殺死的原因imm基因第八十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五EcoRI位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位點ColicinE1外源DNA無Colicin第八十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五用對外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作選擇，操作非常繁雜。對colicinE1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicinE1的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷ColE1抗

colicinE1殺ColE1-仍抗

colicinE1不殺ColE1-插入片斷ColE1第八十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第八十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五目前在基因克隆中廣泛使用的一種大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建縮小基因組的體積移去一些對基因克隆載體無關(guān)緊要的DNA片段，限制酶識別位點，使質(zhì)粒同存在任何易位子統(tǒng)統(tǒng)失去功能。易位子的轉(zhuǎn)移（即易位）有可能導(dǎo)致選擇記號的喪失，甚至也有可能使克隆的DNA片段喪失或重排。構(gòu)建pBR322質(zhì)粒的還必須通過體內(nèi)易位或體外重組加入可選擇的抗藥性記號。3.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。第八十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五Ampr來源Tn3易位8.3kb13.3kb2.6kbEcoRI*活性消化tetr來源5.3kbTn3易位10.2kbTn3易位8.8kbEcoRI*活性消化4.3kb構(gòu)建關(guān)鍵：體內(nèi)易位或體外重組加入可選擇的抗藥性標(biāo)記；除去非必要的區(qū)段降低分子量。帶控制大腸桿菌素E1合成的基因和Ampr基因帶五個抗藥性基因和帶Ampr基因的易位子Tn3pMB8:帶控制大腸桿菌素E1免疫性基因和EcoRI單一識別位點pMB9:帶ColE1質(zhì)粒復(fù)制特性，含對大腸桿菌素E1免疫性基因，EcoRI單一識別位點和四環(huán)素抗性基因pBR312：具雙重抗性pBR313：Tn3易位子上的BamHI位點消失，不再易位第八十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五pBR322質(zhì)粒是由三個不同來源的部分組成的：來源于R7268質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點（ori）.第八十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因pBR322元件來源①復(fù)制起點

oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。第八十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（2）長度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個克隆位點。第八十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五第九十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五（5）pBR322的優(yōu)點①雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記

插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。第九十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡第九十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五氯霉素擴增之后，每個細(xì)胞可達1000~3000copy④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。③

高拷貝數(shù)②分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。第九十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五Mob基因已經(jīng)缺失，但保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點。（6）pBR322的缺點能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！從生物安全的角度出發(fā)，不希望載體具易位能力及接合轉(zhuǎn)移的功能第九十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期五①刪除mob識別位點（如質(zhì)粒pBR327、pAT