現(xiàn)代生物技術(shù)課件 2013925-BT基因工程-緒論和工具酶

第二章基因工程

（GeneEngineering）

2012年9月2

要求

1、掌握基因工程的概念

2、掌握基因工程的基本過程

3、熟悉工具酶和載體類型及應(yīng)用

4、熟悉原核、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染、表

達(dá)的基本方法和類型。

5、熟悉基因工程產(chǎn)生的基礎(chǔ)和過程

(科研思維與方法)。

6.

設(shè)計(jì)一個(gè)基因克隆或基因表達(dá)的程序。

3

第一節(jié)概述基因工程—生物技術(shù)的核心內(nèi)容

4

人們按照預(yù)定設(shè)計(jì)，在體外對(duì)不同來源DNA分子進(jìn)行人工切割、連接、插入載體DNA分子，使遺傳物質(zhì)重新組合、改造，經(jīng)轉(zhuǎn)移、導(dǎo)入到原先不含有重組體的受體細(xì)胞，使之持續(xù)穩(wěn)定繁殖，目的基因擴(kuò)增、表達(dá)，獲得人類所需的產(chǎn)品的工程。一、基因工程的概念（一）定義：5

基因工程（Geneengineering）DNA重組技術(shù)（recombinantDNAtechnology）基因操作（genemanipulation）基因克?。╣enecloning）分子克?。╩olecularcloning）DNA克?。―NAcloning）基因修飾（genemodification）

6WithRestrictionenzymesWithRestrictionenzymeswithDNAligaseenzyme(Genetictransformation)7（二）基因工程的基本內(nèi)涵

基因工程是將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。體外重建、基因轉(zhuǎn)移和外源表達(dá)是重組DNA技術(shù)的三大環(huán)節(jié)。8

——

兩個(gè)水平，六個(gè)階段

二、基因工程的基本步驟

9基因工程包括分子和細(xì)胞兩個(gè)水平的操作分子水平操作指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與重組體構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；細(xì)胞水平操作指轉(zhuǎn)化、篩選和培養(yǎng)工程菌或細(xì)胞以及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化過程。10

獲得含目的基因的重組體分子（亦稱重組子）。

本階段的操作有三個(gè)主要環(huán)節(jié)：

（1）分離：提取、分離含目的基因的DNA分子和載體DNA分子，在分離提取過程中，注意質(zhì)、量，減少損傷。

（2）切割：選擇合適的RE工具酶，分別對(duì)外源目的DNA分子和載體DNA分子進(jìn)行酶解切割。

（3）連接：用DNA連接酶，將目的基因與載體在體外連接為一個(gè)重組DNA分子，并進(jìn)行鑒定。1．分子水平操作階段：11

2.細(xì)胞水平操作階段：

把含目的基因的重組體導(dǎo)入受體細(xì)菌或受體細(xì)

胞，賦予其“生命”讓其表達(dá)，獲得產(chǎn)品。

本階段的操作也有三個(gè)主要環(huán)節(jié)。

（1）轉(zhuǎn)移：利用DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，把構(gòu)建的重組體導(dǎo)入到受體菌或受體細(xì)胞中，獲得工程菌或工程細(xì)胞。

（2）篩選：利用核酸雜交，酶切分析、PCR和表型特征等技術(shù)，篩選出已克隆化的工程菌/細(xì)胞。

（3）表達(dá)：大量培養(yǎng)含重組體的工程菌/細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，提取和純化。

重組DNA操作一般步驟：（1）分離：提取和獲得目的基因和載體DNA；（2）切割：分別對(duì)目的基因和載體DNA

酶切；（3）連接：目的基因與載體連接，形成新的重組DNA分子；（4）轉(zhuǎn)化：用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞；（5）篩選：能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（6）表達(dá)：對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。供體+載體重組體受體工程細(xì)胞分子水平細(xì)胞水平

分切連

轉(zhuǎn)篩表

基因工程的四類技術(shù)：提取，重組，轉(zhuǎn)移，表達(dá)基因工程的三個(gè)要素：供體，載體，受體14基因工程的支撐技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)15（1）填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝

跨越天然物種屏障（原核和真核生物、植物和動(dòng)物)，造福人類，過去人們難以置信的事情，已成為現(xiàn)實(shí)。三、基因工程的重大意義基因工程?16

（2）縮短了進(jìn)化時(shí)間

遺傳和變異是一對(duì)矛盾，遺傳賦予生物種的穩(wěn)定，變異賦予生物種的進(jìn)化。自然變異的進(jìn)化時(shí)間需要千萬(wàn)年，常規(guī)育種亦要幾年；而重組DNA技術(shù)將進(jìn)化時(shí)間大大縮短至幾年?；虿僮饔糜谟N，縮短進(jìn)化時(shí)間，在解決全世界人民溫飽問題上發(fā)揮了重要作用。17（3）使人類能對(duì)生物進(jìn)行定向改造

重組DNA技術(shù)標(biāo)志著人類控制和改造生物的歷史已進(jìn)入一個(gè)新紀(jì)元。以重組DNA技術(shù)培育出抗真菌蔬菜為例，幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞的組分之一，幾丁質(zhì)酶能水解幾丁質(zhì)，科學(xué)家將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胛骷t柿、土豆、萵苣和甜菜中，這一技術(shù)將對(duì)蔬菜抗真菌感染具有重要意義。18（4）利用重組DNA技術(shù)可以在體外大量擴(kuò)增、純化人們感興趣的基因，研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制，從而拓寬了分子生物的研究領(lǐng)域。19（5）醫(yī)學(xué)上應(yīng)用更為廣泛，涉及各領(lǐng)域

正常人類生命活動(dòng)的分子機(jī)制；

人類各種疾病發(fā)生的分子機(jī)理；

人類各種疾病如遺傳性疾病、腫瘤、肥胖、

心血管疾病、傳染病等病因的查明、診斷、

治療和預(yù)防；

藥物的研發(fā)和生產(chǎn)；

疾病模型的建立；

人類的營(yíng)養(yǎng)、健康、長(zhǎng)壽和保?。▉喗】担┗蚬こ滩皇前l(fā)現(xiàn)，而是創(chuàng)造。改變傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)概念

讓植物生產(chǎn)人體蛋白質(zhì)生產(chǎn)促性腺絨毛激素的矮牽?；òl(fā)光的水稻23

第二節(jié)基因工程的發(fā)生與發(fā)展24

一、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)

20世紀(jì)中期分子遺傳學(xué)理論的重大進(jìn)展

六大發(fā)現(xiàn)：

1．確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA1944年美國(guó)微生物學(xué)家Avery等通過肺炎鏈球菌光滑型和粗糙型的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)基因就是DNA分子，提出DNA是遺傳信息的載體。而后噬菌體DNA轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)也得到進(jìn)一步證實(shí)。

2．DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制

DNA堿基配對(duì)規(guī)律和X衍射研究

1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型26

3．生物遺傳的“中心法則”解決了遺傳信息的流向和遺傳性狀的相互關(guān)系，揭示了生命遺傳信息傳遞基本規(guī)律。1957年，Crick提出中心法則。27

自我復(fù)制，遺傳信息由親代傳給子代；通過轉(zhuǎn)錄，遺傳信息傳給RNA；通過翻譯，信息傳給蛋白質(zhì)和酶；基因型決定生物的表型。DNA

RNA

protein28

4．“操縱子”學(xué)說揭示了基因表達(dá)

和調(diào)控的概念

基因組結(jié)構(gòu)

基因分布

基因表達(dá)

基因調(diào)控的原理

酶誘導(dǎo)的本質(zhì)

1965年，Jacob和Monod提出操縱子學(xué)說，開創(chuàng)了基因表達(dá)調(diào)控研究30

5．破譯了全部生物遺傳密碼，

確定了它在生物界的通用

性，人類更加具體地了解

遺傳信息表達(dá)規(guī)律。

1965年破譯了全部64個(gè)遺傳密碼遺傳密碼表32mRNA分子上從5至3的方向,每3個(gè)核苷酸構(gòu)建一個(gè)密碼子，編碼某一特定氨基酸或作為蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號(hào)，稱為三聯(lián)體密碼，也稱遺傳密碼子(geneticcodon)。解決了信息語(yǔ)言的對(duì)應(yīng)關(guān)系33

6、生物進(jìn)化，基因突變、獲得的性狀可以遺傳到后代。34

分子遺傳學(xué)理論上的六大進(jìn)展解決了

生命現(xiàn)象的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)（均是核酸）結(jié)構(gòu)模型（同類構(gòu)件、雙螺旋）復(fù)制方式（相似的機(jī)制）遺傳信息流動(dòng)方向（共同的中心法則）遺傳密碼（共用一套相同的密碼）表達(dá)和調(diào)控的機(jī)理（類同的方法）基因突變機(jī)理、意義（變異與進(jìn)化）為基因工程技術(shù)的誕生典定了理論基礎(chǔ)。

理論上的可行性。

35二、分子遺傳學(xué)新方法是基因工程的技術(shù)基礎(chǔ)（六大技術(shù)）

首當(dāng)其沖的是要解決：①如何自如地得到目的基因；②如何在體外改造基因，得到重組體；③如何在體外轉(zhuǎn)移重組基因；直到20世紀(jì)70年代中期，相繼出現(xiàn)了

幾項(xiàng)關(guān)鍵性技術(shù)，夢(mèng)想成真。361.工具酶的發(fā)現(xiàn):

DNA分子的切割和連接技術(shù)1970年Smith發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶

HinfⅠ對(duì)DNA分子有特異地切割作用。（手術(shù)刀剪）同年Khorana又發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶，能將DNA片段連接在一起。（縫紉機(jī)、漿糊）DNA、RNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶等合成酶。（復(fù)印機(jī)）構(gòu)成了一個(gè)研究DNA、RNA分子的工具酶箱。372.DNA片段載體系統(tǒng)的構(gòu)建

目的基因、DNA片段不能復(fù)制，也易破壞。必須連到具有復(fù)制能力的DNA分子上。

載體（vector)

是能攜帶外源DNA、能自我復(fù)制的小DNA分子。最早發(fā)現(xiàn)的是：質(zhì)粒、噬菌體和病毒。383.大腸桿菌受體細(xì)胞系統(tǒng)的建立

體外獲得的含目的基因或DNA片段的重組體，雖具有自我復(fù)制的本能，但沒有原料、酶系統(tǒng)和生命活力。必須將其安全轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞才能進(jìn)行增殖，賦予其“生命”。39

1970年發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理過的細(xì)胞易于吸收接納外源DNA；

1972年CohenC報(bào)道，質(zhì)粒DNA也能被大腸桿菌吸收。而后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過改造的質(zhì)粒、噬菌體和病毒都可以攜帶目的DNA片段和基因，經(jīng)過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立該基因的無(wú)性繁殖系。4.大腸桿菌DNA轉(zhuǎn)化體系建立40

酶切分析技術(shù)（核酸分辨儀）核酸分子雜交技術(shù)（核酸探測(cè)儀）

序列分析（密碼復(fù)讀機(jī)）生物信息學(xué)（密碼破譯機(jī)）

5.DNA分析、鑒定技術(shù)41凝膠電泳：Agarose,PAGEgel

離心技術(shù):

層析技術(shù):

印跡技術(shù):Southernblot

……

6.DNA分離、純化及鑒定技術(shù)42

技術(shù)上的可行性:六大技術(shù)方法的建立

實(shí)際上的可操作性:

材料、實(shí)驗(yàn)條件、時(shí)空

條件、經(jīng)濟(jì)條件和政策

基礎(chǔ)方面的基本條件（可能性+可行性+可操作性）具備，尚需人的科學(xué)創(chuàng)新思維+艱苦的實(shí)踐。才能得到創(chuàng)新的發(fā)明、發(fā)現(xiàn)和成果。43

1972年Berg等人使用EcoRI在體外對(duì)猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體的DNA分別酶消化，再用T4DNA連接酶將兩種片段連接起來，得到SV40和λDNA的重組雜種DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA體外不同物種之間的DNA重組實(shí)驗(yàn)（片段重組）?；蚬こ痰拇竽憞L試:44基因工程的誕生1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)1972年斯坦福大學(xué)的PaulBerg小組完成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)。

Berg的開創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)45第三節(jié)

基因工程常用工具酶46基因工程技術(shù)中，對(duì)核酸分子進(jìn)行體外切割、連接、修飾和合成等步驟，都是在酶的催化下完成的。

凡是在基因操作時(shí)應(yīng)用的各種酶，統(tǒng)稱為工具酶。工具酶種類多、數(shù)量大，這里僅介紹常用的幾種重要的工具酶。

核酸核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶磷酸酶重組體核酸酶反轉(zhuǎn)錄酶工具酶48一、限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease，RE)

核酸酶(nucleases):指可水解核酸的酶。按底物不同分為：DNA酶（DNase）

RNA酶（RNase）按作用部位不同分為：

5′末端外切酶 核酸外切酶

3′末端外切酶 核酸內(nèi)切酶49

限制性核酸內(nèi)切酶：又簡(jiǎn)稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶。有嚴(yán)格的序列依賴性，是基因工程中的重要工具酶。505’5’

GCAATGCTTAGCCAT

CGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶5’5’

GCAAGCTTTAGCCAT

CGTTCGAAATCGGTA限制性核酸內(nèi)切酶51何謂限制性核酸內(nèi)切酶？是如何發(fā)現(xiàn)的…….52

20世紀(jì)30年代，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱為“限制現(xiàn)象”。

（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能53EcoliK株噬菌體

EcoliK株

EcoliB菌株限制現(xiàn)象限制性內(nèi)切酶細(xì)菌的限制與修飾作用54寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象簡(jiǎn)稱為R/M體系。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。R/M體系組成：由兩種酶活性配合完成；一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種是核酸內(nèi)切限制酶。限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，稱為限制性核酸內(nèi)切酶。56

限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和

Arber從

E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對(duì)其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)金。57（二）限制性核酸內(nèi)切酶的概念

限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)部特定堿基順序，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)，簡(jiǎn)稱限制酶。

限制酶識(shí)別位點(diǎn)，切割位點(diǎn)均在分子內(nèi)部，且具特異性，被稱為基因工程“分子手術(shù)刀、分子手術(shù)剪”，貢獻(xiàn)很大。58限制性內(nèi)切酶的一般特征：

*存在于任何一種原核細(xì)菌中

*在特異位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段

*各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內(nèi)切酶切圖譜*在生物分類,基因定位,基因重組,疾病診斷,刑事偵察領(lǐng)域極為重要.AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）電泳NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNN酶切圖譜60

（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則

限制酶的命名是采用Smith和Nathans

提議的方案。

屬名+種名+株名+編號(hào)61

(1)第一個(gè)字母（大寫）代表產(chǎn)生該酶微生物

（宿主菌）屬名。

(2)第二、三個(gè)字母（小寫）代表微生物種名。

(3)第四個(gè)字母代表宿主菌的株或型

（大寫或小寫）。

(4)如果從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶，即根據(jù)

發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。

命名原則如下：62EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)

舉例：大腸桿菌(Escherichiacoli)R株中分離到五種限制酶，分別表示為EcoRI、EcoRⅡEcoRV等。63（四）限制性核酸內(nèi)切酶的分類

根據(jù)其識(shí)別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，將限制酶分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類。

64

I型限制酶：

屬?gòu)?fù)合功能酶，兼有修飾和切割DNA兩種功能；

需要Mg2+、ATP和S-腺苷甲硫氨酸作為輔助因子,具有核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四種活性；

在DNA鏈上的識(shí)別和切割位點(diǎn)不一致，有隨機(jī)切割位點(diǎn)，一般在識(shí)別位點(diǎn)外上游或下游的1kb至幾kb處隨機(jī)切割，不產(chǎn)生特異片段。

65Ⅲ型限制酶：

有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶功能，但在DNA鏈上有特異切割位點(diǎn)，其切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)3′以外的24-26bp處。

I、Ⅲ型酶對(duì)重組DNA技術(shù)無(wú)重要價(jià)值。

Ⅱ型限制酶

通常指的限制酶。Ⅱ型限制酶分子量小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)輔助因子。

它能識(shí)別和切割雙鏈DNA內(nèi)部的特異順序，產(chǎn)生特異的DNA片段，是常用的重要工具酶。66

三類限制性核酸內(nèi)切酶性質(zhì)比較性質(zhì)第一類第二類第三類限制-修飾活性多功能酶限制酶與修飾酶分開多功能酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三種不同亞基相同亞基二種不同亞基輔助因子Mg2+、ATP、SAMMg2+Mg2+、ATP、SAM分子量大小大切割位點(diǎn)非特定，離識(shí)別位點(diǎn)1Kb特定，在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)特定，離識(shí)別位點(diǎn)24-26處67（五）Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶性狀

1.一般性狀單鏈多肽，最適pH為6～8；NaCl有抑制作用,能被Mg2+激活,巰基有保護(hù)作用，對(duì)熱不穩(wěn)定，常溶于含50％甘油的緩沖液中貯存于–20℃環(huán)境下。取出使用時(shí)必須立即置于冰浴中。

68①有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序。它以核酸內(nèi)切方式

水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段

5′端為P，3′端為OH。

②識(shí)別序列一般為4～8個(gè)堿基對(duì)，最常見的為

6個(gè)堿基,

通常是反轉(zhuǎn)重復(fù)順序（正反讀出的序列一樣），具有180o的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性（回文結(jié)構(gòu)）。

2.酶的識(shí)別、切割特點(diǎn)69Ⅱ類限制酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)GGATCCCCTAGG5’3’5’3’限制酶：BamHⅠ正讀與反讀都相同。以識(shí)別序列的中線為對(duì)稱軸，左右兩側(cè)的堿基互補(bǔ)。為便于書寫，識(shí)別序列可以以5’→3’走向的單鏈DNA表示。70

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識(shí)別序列HaeⅠ的識(shí)別序列71

常用的限制性核酸內(nèi)切酶酶切序列限制酶識(shí)別序列及切口限制酶識(shí)別序列及切口

AluⅠ

AG/CTHindⅢ

A/AGCTT

TC/GAT

TCGA/A

BamHⅠ

G/GATCCSalⅠ

G/TCGAC

CCGAG/GC

AGCT/G

BglⅠ

A/GATCTSmaⅠ

CCC/GGG

T

CTAG/AGGG/CCC

EcoRⅠ

G/AATTC

C

TTAA/G72

酶的識(shí)別順序長(zhǎng)度決定了它切割DNA后產(chǎn)生的DNA片段的長(zhǎng)短。如DNA鏈上的堿基隨機(jī)分布，對(duì)于識(shí)別四個(gè)堿基順序的酶，識(shí)別位點(diǎn)多，切割后片段短。八個(gè)核苷酸的Ⅱ型酶，切割后產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)。733.酶切切口

有些酶在識(shí)別序列內(nèi)的對(duì)稱軸上切割，其切割產(chǎn)物具平頭末端；很多限制酶不能精確地在2個(gè)對(duì)稱軸部位切割，而在識(shí)別序列2條鏈對(duì)應(yīng)位上錯(cuò)位切割，切割產(chǎn)物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些為3’-突出的粘性末端。這些粘性末端的任何一側(cè)都能和另一末端互補(bǔ)配對(duì)，使任何含有該識(shí)別序列的DNA分子都能和另一個(gè)含相同識(shí)別序列的DNA分子容易地連接成新的重組分子。74①平末端：

在識(shí)別順序的對(duì)稱軸上，對(duì)雙鏈DNA同時(shí)切割，產(chǎn)生平末端（bluntend），

例如AluI識(shí)別的順序是：

5′AGCT３′

3′TCGA5′

它的切點(diǎn)在G和C之間，在對(duì)稱軸上將DNA從G與C之間切開：

5′AGCT3′5′-AG

CT-3′

3′TCGA5′3′-TCGA-5′

切口類型：75

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識(shí)別序列和酶切切口（平端）76

②5′粘末端：在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的5′末端切割，產(chǎn)生5′端突出的粘性末端（cohesiveend或stickyend）。例如：EcoRI的識(shí)別序列：EcoRI5’5’5’775’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識(shí)別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’（CohesiveEnds）78

③3′粘末端：

在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的3′末端切割，產(chǎn)生3′端突出的粘性末端。例如：PstⅠ（3′端突出的粘性末端）5’-

CTGCAG

-3’3’-GACGTC

-5’795’NNNNNNNCTGCAGNNNNNNNN3’3’NNNNNNNGACGTCNNNNNNNN5’5’NNNNNCTGCA3’NNNNNGpPstⅠ的識(shí)別序列和酶切切口（粘端）

pGNNNNNN3'ACGTCNNNNNN5’5’-CTGCAG

-3’3’-

GACGTC-5’PstI的識(shí)別序列3’3’80限制內(nèi)切酶切出的三種斷口814.少數(shù)有特殊性質(zhì)的Ⅱ型酶

（1）異源同功酶又稱同裂酶，識(shí)別位點(diǎn)相同，酶的來源不同。

從不同原核生物中分離出來的不同的酶，但有相同的識(shí)別順序，切割DNA的位點(diǎn)可以相同，也可不同。這些工具酶可互相代替。82GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ（a）切點(diǎn)位置相同83CCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGGC+XmaⅠCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+SmaⅠ（b）切點(diǎn)位置不相同84（2）同尾酶識(shí)別位點(diǎn)不同，切出片段有相同末端序列有些限制酶的識(shí)別序列包含在另一些限制酶的識(shí)別順序之中。這些酶雖來源不同，但它們作用后能產(chǎn)生相同的粘性末端，故稱為同尾酶。例如：BamHⅠ、BglⅡ的識(shí)別切割序列分別為

BamHI:

5′GGATCC

3′，

Bg1Ⅱ：5′AGATCT

3′85上述２種酶的識(shí)別序列中均有5′-GATC-3′，切割后產(chǎn)生的互補(bǔ)粘性末端可彼此連接起來。這種能產(chǎn)生互補(bǔ)末端的同尾酶在分子克隆中有一定作用，增加了靈活性。在少數(shù)情況下，兩種同尾酶產(chǎn)生的粘性末端連接后得到的重組體不再被原來的任一種同尾酶所識(shí)別。例如由SalⅠ（G↓TCGAC）和XhoⅠ（C↓TCGAG）分別切割，然后連接得到的重組體不能再被SalⅠ和XhoⅠ切割。這適用于載體構(gòu)建需清除某個(gè)限制酶切位點(diǎn)時(shí)用，但在克隆過程中，若要回收插入片段時(shí)，則要慎重選擇適當(dāng)?shù)耐裁浮?65’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

BamHⅠ5’-TGATCA-3’

3’-ACTAGT-5’

BclⅠ5’-AGATCT-3’

3’-TCTAGA-5’

BglⅡBamHⅠ

BclⅠ

BglⅡ三種酶可產(chǎn)生相同的

5’GATC粘性末端，由這種同尾酶產(chǎn)生的

DNA片段可因粘性末端的互補(bǔ)而彼此再連接起來。87

（3）遠(yuǎn)距離裂解酶（distantcleavage）

這類酶的識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致，但其切割位點(diǎn)與識(shí)別位點(diǎn)的距離是一定的，一般為10個(gè)堿基左右。它們?cè)谀骋缓塑账釁^(qū)域與識(shí)別序列結(jié)合，然后滑行到識(shí)別序列以外的另1個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行切割。此類酶在重組DNA技術(shù)中有一定的應(yīng)用價(jià)值。88

（4）可變酶

這類酶是Ⅱ型酶中的一個(gè)特例，它們的識(shí)別序列中1個(gè)或幾個(gè)核苷酸是可變的，并且識(shí)別序列一般大于6個(gè)堿基對(duì)。

（5）同位酶：識(shí)別相同序列切點(diǎn)不同。89

（六）RE應(yīng)用注意事項(xiàng)酶的活性單位和質(zhì)量

在適當(dāng)反應(yīng)條件下(包括溫度、緩沖液的種類、pH、離子強(qiáng)度等)，1小時(shí)內(nèi)完全分解1μg特定DNA底物所需的限制酶量定為1個(gè)活性單位。目前出售的幾乎所有限制酶均以λ噬菌體DNA(λDNA)作為底物測(cè)定其活性單位。好的限制酶應(yīng)不存在任何核酸內(nèi)切酶或外切酶的污染；長(zhǎng)時(shí)間酶解不出現(xiàn)識(shí)別序列特異性的下降；以及酶解的DNA片段再連接后能被重新識(shí)別并切割等技術(shù)指標(biāo)。90

操作時(shí)應(yīng)注意如下原則：①許多購(gòu)得的限制酶為濃縮液，當(dāng)需要從管中取出少量酶液時(shí)，必須使用新的滅菌微量加樣器吸頭，將其稍稍接觸液面，這樣可取出少至0.1μl的酶液，一個(gè)吸頭不能反復(fù)使用。值得提醒的是加入限制酶的體積不能超過反應(yīng)總體積的10％，否則酶液中的甘油終濃度達(dá)到5％時(shí)將會(huì)抑制酶的活性。整個(gè)操作過程在低溫進(jìn)行，一般總是在加完其他試劑后，最后加酶。91

③酶應(yīng)分裝成小份。當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常用延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間來減少酶的用量，這樣做比較節(jié)約。④當(dāng)需要許多管DNA樣品中用同一種酶時(shí)，應(yīng)計(jì)算所需酶的總量，再將酶稀釋液分別加至各個(gè)反應(yīng)管中，以減少酶液貯存管的污染機(jī)會(huì)。92

⑤當(dāng)DNA需兩種以上的酶切割，且兩種酶需不同的緩沖液時(shí)，最保險(xiǎn)的方法還是單個(gè)酶切后，酚／氯仿抽提、乙醇沉淀，改變緩沖液后再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng)。

⑥貯存與應(yīng)用限制酶對(duì)熱不穩(wěn)定，貯存于-20oC，為避免反復(fù)凍溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用時(shí)添加相應(yīng)的緩沖液稀釋，降低反應(yīng)液中甘油的濃度。93酶的星號(hào)活力(“星”活性)

限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，能切割一些與其特異識(shí)別順序類似的序列，降低酶切的特異性，這種酶的特異性改變或特異性降低而呈現(xiàn)的活性現(xiàn)象稱星號(hào)活力。

星號(hào)活力一般在相應(yīng)限制酶名稱右上角加一個(gè)星號(hào)(*)表示，如EcoRI

EcoRⅠ：GAATTC

EcoRⅠ*：NAATTN

*代表EcoRI星號(hào)活力。94誘發(fā)星號(hào)活力出現(xiàn)的常見原因有：①反應(yīng)體系中甘油含量高(>5％)，應(yīng)使用能完全酶切DNA的最小酶量避免之；②限制酶用量過大(>100μg／gDNA)；③低離子強(qiáng)度(<25mmol／L)；④高pH(pH8.0)，用緩沖液pH降至7.0防止之；⑤含有機(jī)溶劑(如二甲基亞砜、乙醇、二甲基乙酰胺等)；Mn2+、Cu2+、CO2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子存在。95（七）II型限制性核酸內(nèi)切酶

酶解反應(yīng)的操作1)大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl2

10mMNaCl0-150mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTt

37℃1-1.5hr96

2)II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切。對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)切低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切973)限制酶切反映要求較純的底物DNA:

DNA溶液中不能含有痕量酚、氯仿、乙醚、大于10mmol／L的EDTA、SDS和過量的鹽等，這些物質(zhì)的存在均可不同程度地影響限制酶的活性。98在緩沖液中添加2—巰基乙醇或二硫蘇糖醇的目的是防止酶的氧化，穩(wěn)定酶活性。牛血清白蛋白對(duì)某些限制酶活性有穩(wěn)定作用；絕大多數(shù)限制酶的反應(yīng)溫度為37℃(有些酶需25℃或50～65℃，請(qǐng)看使用說明書)，酶量和酶切時(shí)間則根據(jù)DNA底物上酶切位點(diǎn)的多少與DNA總量位點(diǎn)的數(shù)目比較后再?zèng)Q定。限制酶反應(yīng)時(shí)間一般1～2小時(shí)，也可酌情延長(zhǎng)。酶切反應(yīng)時(shí)各液體的混勻不可忽視4)其他因素99限制酶活性不良的可能原因酶已失活，反應(yīng)體系中有抑制劑存在，緩沖液組成或反應(yīng)溫度不適，電泳凝膠的濃度不適，DNA已甲基化或其他修飾，DNA的純度未達(dá)到，底物中沒有所選酶的識(shí)別序列，等等。100

1967年，世界上有數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶(1igase)。

二、DNA連接酶101

DNA連接酶催化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵，而將兩段DNA分子拼接起來。連接酶主要有兩種：

T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶在重組DNA技術(shù)中常用前者。102

DNA連接酶利用NAD+或ATP中的能量催化兩個(gè)核酸鏈之間形成磷酸二酯鍵。（一）DNA連接酶的連接機(jī)制103連接酶的作用機(jī)理104

（二）T4DNA連接酶的特征

分子量為68kD的多肽，催化兩個(gè)獨(dú)立DNA片段5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵，把兩個(gè)DNA分子連接在—起。切口和缺口的區(qū)別

DNA分子糖-磷酸主鍵的破壞稱為切口(nick)，這可以通過形成磷酸二酯鍵來修復(fù)。

DNA分子中核苷酸缺失，稱為缺口(gap)，這不能單獨(dú)用連接酶來解決問題。105106T4DNA連接酶可連接：

①兩個(gè)不同片段雙鏈DNA間存在的互補(bǔ)粘性末端；②兩個(gè)雙鏈DNA分子間的平末端；③也可連接帶切口的雙鏈DNA分子或是RNA—DNA雜交體。兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端的連接效率比兩個(gè)平末端高得多。107

1、粘性末端連接1092.連接平頭雙鏈DNA分子5‘…

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…

5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…

3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…

5’

T4-DNA連接酶110

3.與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上的連接nick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHP5‘…

G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶111

反應(yīng)時(shí)需ATP、Mg2+和巰基(二硫蘇糖醇，DTT)存在，最佳pH為7.5-8.0。連接兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端DNA時(shí)，10％聚乙二醇(PEG)可增加水溶液中大分子間的有效作用，促進(jìn)DNA分子間的連接。連接兩個(gè)平末端DNA時(shí)，單價(jià)陽(yáng)離子(150～200mmol／LNaCl)及低濃度的PEG可大大提高平末端連接的速率。（三）DNA連接酶的反應(yīng)特征：112（四）DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP

0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTt4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：

在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量。113平頭雙鏈DNA片段的連接操作：從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多。提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)

加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用

加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），最終濃度150-200mM114三、與DNA合成相關(guān)的酶類115（一）

DNA聚合酶DNA重組技術(shù)常需要在DNA聚合酶的催化下，在體外合成DNA。常用：大腸桿菌DNA聚合酶I

大腸桿菌聚合酶IKlenow片段

TaqDNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶

116

大腸桿菌DNA聚合酶I是由分子量為109kD的單條多肽鏈組成的多功能酶。

5′→3′DNA聚合酶活性催化單核苷酸結(jié)合到DNA的3′-OH末端，使DNA鏈從5′→3′延伸。1）DNA聚合活性：

1.大腸桿菌DNA聚合酶I(DNApolI)117

3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’

5‘…

C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘

…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI118聚合反應(yīng)的特點(diǎn)：

1、聚合反應(yīng)具有方向性:5’3’2、DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離的脫氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3-OH逐個(gè)添加脫氧核苷酸，使核苷酸鏈不斷延長(zhǎng)。5’5’引物1192）核酸外切酶活性:5’AGCTTCAGGATC3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAG5’

5′→3′外切酶活性

3′→5′外切酶活性

1205’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’?3’5’外切酶活性

5’3’外切酶活性能切除突變的DNA片段能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解AC121DNA聚合酶的用途①催化DNA切口平移反應(yīng)，制備高比活DNA探針。②對(duì)DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。122

1)缺口平移法標(biāo)記DNA

在DNase的作用基礎(chǔ)上產(chǎn)生鏈內(nèi)切口，應(yīng)用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切核酸酶活性的同步聯(lián)合反應(yīng)，使切口沿DNA鏈從5’-端向3’-端移動(dòng)。若用于聚合反應(yīng)的原料dNTP帶有放射性核素α32P，就能使生成的雙鏈帶有標(biāo)記物。1235‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP5‘pppdA

5‘…G-C-T-C

A-G-C-T-G-G

A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘DNaseIDNApolI切口平移標(biāo)記法制備32P標(biāo)記的探針（a-32P-dATP）124

2)3-粘端的末端標(biāo)記先利用此酶的3’→5’外切核酸酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；再以其5’→3’聚合酶活性使其補(bǔ)平，在高濃度的dNTP條件下，使3’-端的外切反應(yīng)與dNTP的攙入反應(yīng)達(dá)到平衡。若dNTP中有放射性標(biāo)記的核苷酸，即可使產(chǎn)物成為3’-末端帶標(biāo)記的DNA。1255’3’5’3’126大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）1.Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。2.Klenow酶小片段N端C端蛋白酶大腸桿菌DNA聚合酶I5核酸外切酶活性大片段（

Klenow片段）

DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性1282.Klenow片段的基本用途:

用于:1）隨機(jī)引物標(biāo)記核酸探針2）5’-粘端補(bǔ)平3）合成cDNA的第二鏈4）DNA序列分析5）3’-端的末端標(biāo)記129TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermusaquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶。

本酶具有5′3′的聚合酶活性和依賴聚合作用的5′3′外切酶活性。3.TaqDNA聚合酶

1976年從Thermusaquaticus菌中分離純化到此酶后，直至1985年P(guān)CR概念的形成，才將此酶應(yīng)用于PCR技術(shù)的建立和完善。對(duì)基因的克隆、測(cè)序、突變研究和檢測(cè)診斷等方面發(fā)揮巨大的作用。130最適溫度75℃-80℃

需要Mg2+(10mmol／L)

在低濃度Mn2+(2mmol/L)中有低活性

Ca2+使其完全失活一價(jià)陽(yáng)離子高至0.1mo1