基因工程和其應用上課

誰能告訴我這是ＷＨＡＴ？誰能告訴我這是ＷＨＡＴ？香蕉魚你見過嗎?你知道什么是真正的碩果累累嗎?給科學插上想象的翅膀，你會收獲更多！一、基因工程與基因基因決定性狀家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮青霉菌能產生對人類有用的抗生素——青霉素定向基因改造設想設想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐出”蠶絲？設想二能否讓微生物產生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設想三經過多年的努力，科學家于20世紀70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術——基因工程。二、基因的認識1866年發(fā)表論文，提出分離規(guī)律和獨立分配規(guī)律。1900年Mendel遺傳規(guī)律被重新發(fā)現(xiàn)，遺傳學的元年1866年，孟德爾（JohannGregorMendel，1822－1884）提出了遺傳因子（hereditaryfactor）的概念。他將控制豌豆性狀的遺傳因素稱之為遺傳因子形成了基因的雛形。（1856-1864豌豆雜交實驗）1、基因的發(fā)展過程1909年，丹麥的遺傳學家WilhelmLudwig

Johanssen(1859-1927)。根據(jù)希臘語“給予生命”之義，創(chuàng)造了“gene”一詞，并用這個術語代替孟德爾的“遺傳因子”。不過他所說的基因并不代表物質實體，而是一種與細胞的任何可見形態(tài)結構毫無關系的抽象單位。因此，那時所指的基因只是遺傳性狀的符號，還沒有具體涉及基因的物質概念。

“遺傳因子/基因”的設想一經提出，便推動人們去尋找，去探索

基因在哪里？基因是什么？顯微鏡技術與染色技術的發(fā)展，使人們注意到，細胞分裂時，尤其是減數(shù)分裂中，染色體的行為和孟德爾提出的等位基因的分離規(guī)律相當一致，所以，確定基因在細胞核中，在染色體上。第一次將代表某一特定性狀的基因與某一特定的染色體聯(lián)系起來，創(chuàng)立了遺傳的染色體理論。隨后遺傳學家又應用當時發(fā)展的基因作圖（genemapping）技術，構筑了基因的連鎖圖，進一步揭示了在染色體載體上基因是按線性順序排列的。。1910年，美國遺傳學家摩爾根（ThomasHuntMorgan,1866-1945）以果蠅為研究材料，發(fā)現(xiàn)了連鎖交換定律并提出遺傳粒子學說。1933發(fā)現(xiàn)DNA的遺傳功能，始于1928年英國科學家格里菲斯（P．Griffith）所做的用肺炎雙球菌感染小鼠的實驗。首次發(fā)現(xiàn)了基因是一類特殊生物分子的證據(jù)。FredericGriffith1879—1941格里菲斯用肺炎球菌做實驗時發(fā)現(xiàn)了一個令人驚異的現(xiàn)象：加熱殺死的能致病的S型菌＋不能致病的R型菌→混合→注射到小鼠體內→小鼠病死→從死鼠體內分離出大量的S型肺炎球菌難道S型致病菌復活了嗎？這就是著名的“格里菲斯之謎”。艾弗里等人的實驗說明使細菌性狀發(fā)生轉化的因子是DNA（即脫氧核糖核酸），而不是蛋白質或RNA（即核糖核酸）。不僅揭開了“格里菲斯之謎”，并且在世界上第一次證明基因就在DNA上。OswaldTheodoreAvery(1877～1955)1944年，艾弗里首次證實遺傳物質的基礎是DNA，基因位于DNA上。實驗材料是肺炎鏈球菌，他們發(fā)現(xiàn)死去的S型菌并未復活，而是S型菌的DNA進入了R型菌，使其轉化為新的S型致病肺炎雙球菌。美國微生物學家阿爾弗雷德·戴·赫爾希（AlfredDayHershey，1908～1997）他們的實驗材料是T2噬菌體實驗證實，進入細菌細胞的噬菌體是核酸；進而說明，攜帶遺傳信息的是核酸，而不是蛋白質。噬菌體的DNA不但包括噬菌體自我復制的信息，而且包括合成噬菌體蛋白質所需要的全部信息。1952年，赫爾希和他的學生共同發(fā)表報告，肯定了艾弗里的結論。此后，再也無人懷疑DNA是遺傳物質了。35S－32P－35S標記外殼蛋白質,感染后放射標記不進入大腸桿菌細胞32P標記DNA,感染后放射標記進入大腸桿菌細胞19691953年，F(xiàn)rancisCrick和JamesWatson

創(chuàng)立DNA雙螺旋模型，證實基因是具有一定遺傳效應的DNA片段。用分子結構的特征解釋生命現(xiàn)象最基本問題之一－－基因復制的機理，從而使生物學真正進入分子生物學的新時代。

1953JamesDeweyWatson，F(xiàn)rancisHarryComptonCrick1961年，美國生物學家尼倫伯格（MarshallWarrenNirenberg，1927～）等人成功破譯了遺傳密碼，以無可辯駁的科學依據(jù)證實了DNA雙螺旋結構的正確性。人們對遺傳機制有了更深刻的認識。

1967年發(fā)表了全套的遺傳密碼表。1968理論上的三大發(fā)現(xiàn)：

發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質是DNA

發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結構和半保留復制機理

發(fā)現(xiàn)了遺傳信息的傳遞方式

基因工程的準備階段技術上的三大發(fā)明：1967發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶；1970Khorana實驗室發(fā)現(xiàn)T4噬菌體DNA連接酶；1972建立雙鏈DNA的連接方法。3.基因工程的載體:Geneticengineeringvector19722.限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn):Restrictionenzyme19701.DNA連接酶的發(fā)現(xiàn):DNAligase1967獨立于染色體外的遺傳因子：細菌的性因子—F因子;抗藥性因子（R）;大腸桿菌素因子（COE）基因工程誕生的理論基礎:1.DNA是遺傳物質的發(fā)現(xiàn)2.DNA雙螺旋結構的確立3.遺傳信息傳遞方式的認定1.剪刀:限制性核酸內切酶2.針線:DNA連接酶3.運輸工具:質粒等基因工程誕生的技術保障:1973年斯坦福大學的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質粒pSC101連接成重組質粒，具有雙重抗藥性。SrSr

NerTcrPsc101R6-3ECORIECORI轉化E.coli連接酶PSC101R6-3：質粒Ner：抗新霉素基因Sr：抗黃胺基因Tcr：

抗四環(huán)素基因1986Nobel生理或醫(yī)學獎1986StanleyCohenHerbertBoyer非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質粒重組，轉化大腸桿菌，并在菌體內成功轉錄出相應的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實驗?；蚬こ蹋杭础Ｍㄋ椎恼f，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，地改造生物的。原理：操作水平：結果：一、基因工程基因重組DNA分子水平定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類所需要的品種?；蚱唇蛹夹g或DNA重組技術定向遺傳性狀二、基因操作的工具1、基因工程的指“限制性核酸內切酶

”主要存在于微生物（200種）一種限切酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并在特定切點切割DNA分子已發(fā)現(xiàn)的有4000多種種類:來源:特點:“”

大腸桿菌(E.coli)的一種限制性核酸內切酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制性核酸內切酶切割結果:①產生黏性末端被限制性核酸內切酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。黏性末端黏性末端限制性內切酶（EcoRⅠ）作用過程點擊播放要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制性核酸內切酶切幾個切口？可產生幾個粘性末端？要切兩個切口，產生四個粘性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制性核酸內切酶來切割，會怎樣呢？會產生相同的粘性末端，然后讓兩者的粘性末端粘合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。SmaⅠ平末端平末端②產生平末端:如SmaⅠ限制性核酸內切酶切割的化學鍵：磷酸二酯鍵例：限制性核酸內切酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制性核酸內切酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。在質粒上有酶Ⅰ的一個切點，在目的基因的兩側各有1個酶Ⅱ的切點。①請畫出質粒被限制性核酸內切酶Ⅰ切割后所形成的粘性末端。②請畫出目的基因兩側被限制性核酸內切酶Ⅱ切割后所形成的粘性末端下列關于限制性核酸內切酶的說法正確的是（）A.限制性核酸內切酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中少B.一種限制性核酸內切酶只能識別一種特定的核苷酸序列C.不同的限制性核酸內切酶切割DNA后都會形成粘性末端D.限制性核酸內切酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵B限制酶是一群核酸切割酶，可辨識并切割DNA分子上特定的核苷酸堿基序列。下圖為四種限制酶BamHI,EcoRI,HindⅢ以及BgIⅡ的辨識序列：

箭頭表示每一種限制酶的特定切割部位，其中哪兩種限制酶所切割出來的DNA片段末端，可以互補結合？其正確的末端互補序列為何？（）A．BamHI和EcoRI；末端互補序列－AATT－B．BamHI和HindⅢ；末端互補序列－GATC－C．BamHI和BgIⅡ；末端互補序列－GATC－D．EcoRI和HindⅢ；末端互補序列－AATT－C2、基因工程的指“DNA連接酶”“”作用：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子DNA連接酶的作用過程點擊播放

DNA連接酶的作用位點是：相鄰的兩個脫氧核苷酸的切口。即生成：磷酸二酯鍵。DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈雙鏈單鏈連接部位在兩DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶常見類型E.coliDNA連接酶(大腸桿菌連接酶)T4DNA連接酶(T4噬菌體連接酶)來源大腸桿菌T4噬菌體功能連接黏性末端連接黏性末端

或平末端結果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵3、基因的運載體（2）應具備條件：①能夠在受體細胞中自我復制或與染色體、DNA整合后進行同步復制②具有一個或多個限制酶切點，供目的基因插入其中③具有某些標記基因，供重組DNA的檢測和鑒定（3）常用類型：（1）功能：將目的基因送入受體細胞質粒、噬菌體和動、植物病毒等

標記基因，便于進行檢測。

其中質粒存在于許多細菌和酵母菌等生物中,是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環(huán)狀DNA分子.步驟一：獲取目的基因

目的基因是人們所需要轉移或改造的基因,獲取目的基因是實施基因工程的第一步。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，植物的抗病基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。從基因文庫中獲取目的基因：基因文庫:

一個生物體的基因組DNA用限制性核酸內切酶部分酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個生物體的整個基因組，也就是構成了這個生物體的基因文庫。

(genelibrary).獲得目的基因的方法直接分離基因人工合成基因反轉錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：“鳥槍法”（“散彈射擊法”）1.“鳥槍法”（“散彈射擊法”）

用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（即擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再利用一定方法將目的基因的DNA片段分離出來。用限制酶切斷成許多片段(1)反轉錄法：2.人工合成基因雙鏈DNA(即目的基因)合成單鏈DNA(cDNA)目的基因的mRNA反轉錄(2)根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：mRNA的核苷酸序列蛋白質的氨基酸序列結構基因的核苷酸序列化學合成推測推測目的基因步驟二：制備重組DNA分子（基因表達載體的構建）（1）用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。（2）用同一種限制酶切斷帶有目的基因的外源DNA片段，使其產生相同的黏性末端。（3）將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）。目的基因與載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重新組合的過程。將目的基因導入受體細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑，如土壤農桿菌轉化法。步驟三：轉化受體細胞（將攜帶目的基因的載體導入受體細胞）1.將目的基因導入植物細胞（農桿菌介導轉化技術）2.將目的基因導入動物細胞（顯微注射技術）3.將目的基因導入微生物細胞

大腸桿菌細胞最常用的轉化方法是:（1）用CaCl2處理細菌，以增大細菌細胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。（3）目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非?？欤诤芏痰臅r間內就能獲得大量的目的基因。

步驟四：篩選出獲得目的基因的重組細胞四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因步驟五：培養(yǎng)受體細胞并誘導目的基因的表達重組的DNA分子進入受體細胞后受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。思考：依照中心法則分析番茄軟化的原因：多聚半乳糖酸酶基因mRNA多聚半乳糖酸酶細胞壁結構被破壞番茄軟化轉錄翻譯熒光蛋白酶基因轉化花卉哪些新技術能大大簡化基因工程的操作技術？1、DNA測序儀：2、PCR技術：能快速地測定DNA樣品的堿基序列。在體外通過酶促反應有選擇的大量擴增目的基因或序列的技術。①概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應技術，是一項在體外通過酶促反應有選擇地大量擴增目的基因或序列的技術。③條件：目的基因或序列、四種脫氧核苷酸、DNA聚合酶、一對引物(做啟動子)②原理：DNA復制④方式：以指數(shù)方式擴增。⑤結果：使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增利用PCR技術擴增目的基因①90-95℃變性②

50-65℃退火③70-75℃延伸PCR反應過程：20-40個PCR循環(huán)1個PCR循環(huán)過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性50℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈四、基因工程的應用1、基因工程與作物育種Goldenriceandnormal(white)

/wsjbiotech.html轉2個水仙花和1個細菌VA合成酶基因的水稻“金米”（AntifreezeProteinsAFPs)避免細胞結冰有助植物抗凍抗凍糖蛋白無冰晶細菌幫助草莓抗霜凍降低原生質冰點抑制冰晶重結晶修飾冰晶形態(tài)調節(jié)原生質膠體性質抗蟲轉基因植物生長快、肉質好的轉基因魚(中國)乳汁中含有人生長激素的轉基因牛(阿根廷)轉黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉魚抗寒基因的番茄2、基因工程與藥物研制我國生產的部分基因

工程疫苗和藥物

許多藥品的生產是從生物組織中提取的。受材料來源限制產量有限，其價格往往十分昂貴。

微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產。若將生物合成相應藥物成分的基因導入微生物細胞內，讓它們產生相應的藥物，不但能解決產量問題，還能大大降低生產成本。

胰島素從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產量之低和價格之高可想而知。

將合成的胰島素基因導入大腸桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產生100g胰島素！使其價格降低了30%-50%!

基因工程做成的“超級細菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質。

通常一種假單孢桿菌只能分解石油中的一種烴類．用基因工程培育成功的“超級細菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。

科學家還培育出能吞食轉化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質的細菌。3、環(huán)境污染治理

利用基因工程培育的“指示生物”能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉化污染物。

轉基因食品

安全嗎?!

轉基因抗乙肝西紅柿(中國)，雖然不能治愈乙肝，但一年只吃幾個抗乙肝西紅柿，就完全能代替注射乙肝疫苗?？挂腋挝骷t柿屬于轉基因食品，就是將乙肝疫苗植入西紅柿內，經過多代繁殖，使轉入的基因穩(wěn)定化。用轉基因的植物生產藥物轉基因植物的安全性爭論支持派認為：如果轉基因農業(yè)生物技術得不到社會支持，這一研究將被扼殺，并且強調，迄今為止并沒有發(fā)現(xiàn)轉基因食品危害人體健康和環(huán)境的確切證據(jù)。美國人食用轉基因食品已多年，超級市場上有4000多種商品是含有