發(fā)酵工程菌種的衰退復(fù)壯和保藏

發(fā)酵工程菌種的衰退復(fù)壯和保藏第一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五①能在廉價(jià)原料上快速生長；②生長條件易于掌控；③對設(shè)備和操作方式適應(yīng)性強(qiáng)；④菌株生產(chǎn)性能穩(wěn)定性強(qiáng)；⑤產(chǎn)物產(chǎn)量高，積累濃度高；⑥產(chǎn)物的回收容易；⑦抗雜菌、抗噬菌體能力強(qiáng)；⑧菌體不是病原菌。發(fā)酵菌種的基本要求第二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五(1)微生物保藏單位獲取(2)自然界分離(3)野生菌株誘變(4)基因重組(5)動(dòng)植物細(xì)胞發(fā)酵菌種獲得的一般途徑第三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進(jìn)行。

影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異b）污染c）死亡第四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五一、菌種的衰退菌種的退化

變異有正變（自發(fā)突變）和負(fù)變兩種，負(fù)變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標(biāo)記的丟失均稱為菌種的退化。第五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五一、菌種的衰退衰退的表現(xiàn)

1）原有形態(tài)形狀變得不典型；

2）生長速度變慢；

3）代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降；

4）對外界不良環(huán)境的抵抗力下降。第六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

菌種退化現(xiàn)象：菌落顏色的改變，畸形細(xì)胞的出現(xiàn)等菌株生長變得緩慢，產(chǎn)孢子越來越少直至產(chǎn)孢子能力喪失菌種的代謝活動(dòng)，代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降第七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五菌種退化的原因菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代旺盛細(xì)胞，發(fā)生突變的機(jī)率比處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞大得多。第八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

菌種衰退的原因

1）基因自發(fā)突變（根本原因）

粘質(zhì)賽氏桿菌（Serratiamarcescens)H-2892

菌株生產(chǎn)力：18g/L組氨酸，

五次傳代后菌株生產(chǎn)力：4g/L第九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

2）變異菌株性狀分離隨著菌種傳代和核的分離也會(huì)使性狀表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會(huì)隨之變化，即使是單核孢子發(fā)生突變時(shí)，如果雙鏈DNA上僅一條鏈上某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化，經(jīng)移殖后也會(huì)出現(xiàn)性狀分離。因此一個(gè)較穩(wěn)定的變異株的獲得必須經(jīng)過多次分離純化。

菌種衰退的原因第十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五劑量（以存活率計(jì)，%）菌落總數(shù)突變菌落數(shù)突變頻率（突變菌落/103）不純菌落（%）純不純100（對照）80~10060~8020~601~2012165120608553492298841134665195—122017280.0822716.722.6—43302113

變異菌株性狀分離——不同劑量紫外線處理裂殖酵母時(shí)不純菌落百分?jǐn)?shù)在菌種篩選工作中經(jīng)常遇到初篩搖瓶產(chǎn)量很高，復(fù)篩產(chǎn)量逐漸下降而被淘汰的現(xiàn)象，在霉菌中更為常見。

第十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

3）傳代次數(shù)的影響，使負(fù)突變株的比例逐漸占了優(yōu)勢

個(gè)別細(xì)胞性狀改變不足以引起菌種退化，經(jīng)多次傳代，退化細(xì)胞在數(shù)量上占優(yōu)勢，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為一株退化菌株。

菌種衰退的原因第十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)移接代數(shù)每代斜面保存時(shí)間（天）回復(fù)子比數(shù)腺苷產(chǎn)量（g/L）1234560267912147133，1447，3，9，3，71，1447，3，9，3，13，58，1447，3，9，3，13，8，3，47，447，3，9，3，13，8，3，4，14，6，6，311/4.5×1061/2.4×1061/2.2×1051/3.5×1051/5.3×1031/1.0×10313.514.910.713.18.17.4連續(xù)傳代——產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系第十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五4）與培養(yǎng)條件有關(guān)的其它因素——溫度、濕度、培養(yǎng)基成分及各種培養(yǎng)條件等。

如在保藏菌種中基因突變率就隨溫度降低而減少。

衰退是發(fā)生在微生物細(xì)胞群體中的一個(gè)由量變到質(zhì)變的逐步演變的過程。

菌種衰退的原因第十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五菌種退化的原因

基因突變連續(xù)傳代菌種退化生產(chǎn)保藏條件變化質(zhì)粒脫落第十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五二、衰退的防止與復(fù)壯1.減少傳代次數(shù)2.創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件3.利用不易衰退的細(xì)胞傳代4.采用有效的菌種保藏方法（一）防止衰退的措施第十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（一）防止退化的措施前期育種時(shí)需注意1.合理的育種，處理細(xì)胞用單核的，避免使用多核細(xì)胞；2.增加突變位點(diǎn)，減少分離回復(fù)；3.誘變處理后分離純化，以保證保藏菌種純；第十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（1）控制傳代次數(shù)

基因的變化往往發(fā)生在復(fù)制和繁殖過程中，繁殖越頗繁，復(fù)制的次數(shù)越多，基因發(fā)生變化的機(jī)會(huì)也就越多。因此應(yīng)該盡量避免不必要的接種和傳代，把傳代次數(shù)控制在最低水平，以降低突變機(jī)率。（一）防止退化的措施第十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（1）控制傳代次數(shù)一般情況下，斜面每移植一代，霉菌、放線菌、芽孢桿菌在低溫下可保藏半年左右，酵母可保藏3個(gè)月左右，無芽孢細(xì)菌可保藏1個(gè)月左右。為此，生產(chǎn)菌種每移植一代，最好同時(shí)移植較多的斜面，以供一段時(shí)間生產(chǎn)之需，這樣移植次數(shù)就可減少。（一）防止退化的措施第十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（2）選擇合適的培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件對菌種衰退有一定的影響，選擇一個(gè)適合原種生長的條件可以防止菌種衰退。另外，生產(chǎn)上應(yīng)避免使用陳舊的斜面菌種。（一）防止退化的措施第二十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（3）利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代

在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含有許多核，甚至是異核體，因此用菌絲接種時(shí)就會(huì)出現(xiàn)衰退和不純的子代。而孢子一般是單核的，利用孢子來接種，可以達(dá)到防止衰退的目的。但是這也必須注意到微生物細(xì)胞本身的特點(diǎn)。對構(gòu)巢曲霉來說，利用它的分生孢子傳代易發(fā)生衰退而用它的子囊孢子移種則不易退化。（一）防止退化的措施第二十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（4）選擇合適的保藏方法

采用有效的菌種保藏方法也可以防止菌種的衰退。

采用有效的菌種保藏方法研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。（一）防止退化的措施第二十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（二）菌種的復(fù)壯1.從衰退的菌種群體中把少數(shù)個(gè)體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種(狹義復(fù)壯，消極措施)。a）純種分離;b）通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯；第二十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五純種的分離方法

平板劃線分離法

菌落純

平板涂布分離法

平板傾注分離法

用“分離小室”進(jìn)行單細(xì)胞分離

細(xì)胞純顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離第二十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五稀釋分離法第二十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五顯微操作：單細(xì)胞分離第二十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（二）菌種的復(fù)壯2.有意識(shí)地利用微生物會(huì)發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種維護(hù)工作中不斷篩選“正變”個(gè)體(廣義復(fù)壯，積極措施)

。第二十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五舉例：產(chǎn)鏈霉素放線菌菌種分離（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏

高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點(diǎn)，選擇目的菌落

放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試第二十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五三、菌種保藏的原理和方法菌種保藏的意義菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。第二十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五三、菌種保藏的原理和方法國內(nèi)菌種保藏機(jī)構(gòu)

1979年7月，我國成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)(ChinaCommitteeforCultureCollectionofMicroorganisms．CCCCM)。并確定了與普通、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)、抗生素和獸醫(yī)等微生物學(xué)有關(guān)的六個(gè)菌種保藏管理中心。第三十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCM）下設(shè)幾個(gè)中心：1）中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ChinaCenterofIndustrialCultureCollection,CCICC)：負(fù)責(zé)全國工業(yè)生產(chǎn)與研究應(yīng)用微生物菌種的收集、鑒定、保藏與供應(yīng)等職責(zé)?，F(xiàn)藏工業(yè)微生物菌種1750余株。國內(nèi)菌種保藏機(jī)構(gòu)第三十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五2）林業(yè)微生物菌種保藏中心

1985年成立，由林科院負(fù)責(zé)，側(cè)重林業(yè)微生物的菌種保藏，現(xiàn)保藏菌種690余株；國內(nèi)菌種保藏機(jī)構(gòu)第三十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五3）中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏管理中心1996年成立，下設(shè)9個(gè)庫：中國普通微生物保藏管理中心（CGMCC）；中國病毒保藏中心（CCGVCC）；細(xì)胞庫；昆明細(xì)胞庫；基因庫；植物離體種質(zhì)庫；稀有瀕危特有植物種質(zhì)庫；海洋生物種質(zhì)庫?，F(xiàn)藏培養(yǎng)物16000個(gè)株系，其中菌株13000株。國內(nèi)菌種保藏機(jī)構(gòu)第三十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五1）美國典型菌種保藏中心（ATCC）

位于馬里蘭州，現(xiàn)藏細(xì)菌8000株，絲狀真菌4400株，酵母菌606株及其他菌種千余株。保藏方法主要以冷凍干燥和液氮超低溫凍結(jié)法。2）荷蘭真菌中心收藏所（CBS）位于荷蘭巴爾恩市，現(xiàn)藏細(xì)菌1000株，絲狀真菌13000株，酵母菌3500株。國外菌種保藏機(jī)構(gòu)第三十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五3）英國的國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（NCTC）

英聯(lián)邦真菌研究所（CMI）4）冷泉港研究室（CSH）美國5）日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所（IAM）6）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）……國外菌種保藏機(jī)構(gòu)第三十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五菌種保藏的原理微生物菌種保藏，原理基本一致，即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護(hù)劑或酸度中和劑等方法，挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體，使微生物生長在代謝不活潑，生長受抑制的環(huán)境中。第三十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五菌種保藏的原理

菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。使菌種處于“體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。第三十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五理想的菌種保藏方法注意事項(xiàng)(1)

經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2)

保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的方法經(jīng)濟(jì)。第三十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五菌種保藏在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥第三十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五保藏方法

7種常用方法

（1）斜面冰箱保藏法（2）半固體冰箱保藏法（3）石蠟油封藏法（4）甘油懸液保藏法（5）沙土管保藏法（6）冷凍干燥保藏法（7）液氮保藏法第四十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五常用方法第四十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。第四十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法。此法最為簡單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。

斜面保藏法第四十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五斜面保藏法因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于4℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性。保存期2個(gè)月到6個(gè)月第四十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五穿刺保藏法斜面保藏法的改進(jìn)常用于好氣性細(xì)菌的保藏，真菌、放線菌等1~2cm高的穿刺培養(yǎng)物上覆蓋2~3mm的液體石蠟第四十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五礦物油保藏法將瓊脂斜面、穿刺或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡便有效。可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。第四十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五礦物油保藏法操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油，斜面礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。注意某些菌株在液體石蠟下仍生長十分明顯，如某些假絲酵母同化液體石蠟，也有的對液體石蠟保藏敏感。第四十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五沙土管干燥保藏法適用于絲狀真菌、放線菌或芽孢細(xì)菌的保藏一般沙過80目，土過100目，按1~2：1混合，高度約1cm。也可用硅膠、磁珠或多孔玻璃珠代替。接種后真空抽干封口。保存期1年左右。第四十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

真空冷凍干燥保藏法

冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。

第四十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五凍干保藏

大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。第五十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五第五十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五第五十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五冷凍保藏種類

一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)第五十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞接到試管或指管內(nèi)，用橡膠塞嚴(yán)格封好，置于-20℃冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。第五十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞接到試管或指管內(nèi)，用橡膠塞嚴(yán)格封好，置于-20℃冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。第五十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五注意經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)第五十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長期保藏的微生物菌種在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

第五十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。第五十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五液氮冷凍保藏法

冷凍保護(hù)劑

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。第五十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五液氮冷凍保藏法

冷凍保護(hù)劑

保護(hù)劑的作用可能是在冷凍干燥的脫水過程中代替結(jié)合水而穩(wěn)定細(xì)胞成分(細(xì)胞膜)的構(gòu)型，防止細(xì)胞膜因?yàn)閮鼋Y(jié)而破壞。保護(hù)劑還可以起支持作用，使膜疏松地固定在上面。第六十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五原理用液氮能長期保存菌種。這是因?yàn)橐旱臏囟瓤蛇_(dá)-196℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其新陳代謝作用停止的溫度(-130℃)，所以此時(shí)菌種的代謝活動(dòng)已停止，化學(xué)作用亦隨之消失。第六十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五不同菌種保藏方法比較第六十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五不同菌種保藏方法比較第六十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五基因工程菌的保藏當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)?；蚬こ叹鷳?yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第六十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五微生物活力和穩(wěn)定性測定

成功的菌種長期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏6個(gè)月、1年或更長時(shí)間后存活百分率(或存活單位)、細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性；以及實(shí)驗(yàn)室中、中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。第六十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五液氮冷凍保藏技術(shù)

(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟

1．待冷凍保藏菌種懸液的制備

(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～lmL分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶。

第六十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五液氮冷凍保藏技術(shù)

(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。第六十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五液氮冷凍保藏技術(shù)

2．控速冷凍(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；第六十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-96℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。液氮冷凍保藏技術(shù)

第六十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五液氮冷凍保藏技術(shù)

(三)復(fù)蘇1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解；第七十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五液氮冷凍保藏技術(shù)

(三)復(fù)蘇3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。第七十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五凍干保藏

操作步驟1．啟動(dòng)冷凍干燥器的致冷單元。當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到-40℃時(shí)啟動(dòng)真空泵，使真空度達(dá)到2.67～4.00Pa。2．將冷凍槽置于歧管之下方。槽中裝入2／3體積的異丙醇，然后插入溫度計(jì)及可調(diào)溫控儀降溫探頭．打開降溫探頭控制醇浴溫度在-40℃，這一過程約需30min。3．每支斜面加入2mL20％的脫脂乳，然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液，加入40％的脫脂乳，最終細(xì)菌菌株濃度一般要求在106CFU／m1。第七十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五凍干保藏

4．取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分裝安瓿(0.2ml／瓿)，重新塞好棉塞。5．輕輕振蕩安瓿，以使細(xì)胞重新懸浮。將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使細(xì)胞懸液迅速凍結(jié)。6．15min后，將歧管與真空泵相通。7．維持-40℃的醇浴溫度90-120min，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使醇浴溫度上升至-10℃，維持2h。8．關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭，讓醇浴溫度上升至室溫(25℃)。第七十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五凍干保藏

9．在冷凍干燥的最初4h內(nèi)應(yīng)定期測真空度，在安瓿置于真空下后1h內(nèi)，真空度必須達(dá)到13.33Pa，并于菌懸液接近干燥時(shí)逐漸降到2.67～4.0Pa。10．在真空狀態(tài)下，讓安瓿保存在冷凍干燥機(jī)中至少16h以獲得完全干燥。11．干燥后，在2.67～4.00Pa的真空度下封瓶．12．在所有安瓿都封蓋好后，撤去真空。13．關(guān)閉真空泵，冷凝器。第七十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。凍干保藏

第七十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五凍干菌種的保藏與再生2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺(tái)中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿．凍干保藏

第七十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五凍干菌種的保藏與再生2．復(fù)蘇：(3)在安瓿中加入0.5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。凍干保藏

第七十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五凍干菌種的保藏