柴胡疏肝散抗肝纖維化

柴胡疏肝散抗肝纖維化

【摘要】目的探討柴胡疏肝散對肝纖維化大鼠模型αSMA、TGFβ1的影響及其抗纖維化的機(jī)制。方法采用40%CCl4皮下注射，制備肝纖維化模型并以柴胡疏肝散干預(yù)，測定肝功能、血清透明質(zhì)酸、層黏連蛋白及肝組織羥脯氨酸，光鏡觀察肝組織病理變化，免疫組織化學(xué)法檢測肝組織αSMA、TGFβ1表達(dá)，RTPCR檢測TGFβ1mRNA的表達(dá)。結(jié)果柴胡疏肝散組較模型組:肝功能明顯改善，血清HA及LN顯著降低，肝組織HYP含量明顯少，肝組織纖維化程度明顯改善，肝組織αSMA及TGFβ1表達(dá)減少。結(jié)論柴胡疏肝散對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有良好的防治作用。

【關(guān)鍵詞】柴胡疏肝散；肝纖維化；αSMA；TGFβ1

近年來柴胡疏肝散抗肝纖維化的臨床研究取得了較好的臨床效果〔1〕，但目前國內(nèi)外尚無柴胡疏肝散抗肝纖維化的基礎(chǔ)研究。本實(shí)驗(yàn)采用四氯化碳大鼠肝纖維化模型,觀察柴胡疏肝散的抗肝纖維化作用,并探討其對α平滑肌肌動(dòng)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子影響及柴胡疏肝散抗肝纖維化的理論機(jī)制。

1材料與方法

11材料

111動(dòng)物及藥物雄性22月齡Wistar大鼠60只,體重300～350g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。柴胡疏肝散經(jīng)冷水浸泡藥材2h，常規(guī)兩煎,頭煎15h，二煎1h，兩次水煎液混合并過濾,經(jīng)水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥112g/ml的濃縮藥液冷藏備用。按體表面積折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效劑量為28g/kg。

112藥品及試劑CCl4購自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司)；秋水仙堿購自昆明股份制藥有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所；血清總膽紅素試劑盒購自上?？迫A東菱診斷用品有限公司；透明質(zhì)酸、層黏連蛋白放射免疫分析測定盒購自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)中心；單克隆急用型鼠抗人生αSMA試劑盒購自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫組化試劑盒購自福州邁新試劑公司，DAB購自北京中山生物公司，RTPCR兩步法試劑盒購自TAKARA公司，Trizol購自Sangon公司。

12方法

121模型制作參照文獻(xiàn)〔2〕方法：實(shí)驗(yàn)第1天除正?？瞻讓φ战M外,其余動(dòng)物皮下注射CCl4分析純05ml/100g,以后每隔3d注射40%CCl4橄欖油劑03ml/100g,連續(xù)8w。實(shí)驗(yàn)前2w飼喂高脂玉米粉飼料，第3～6周飼喂100%玉米粉和30%乙醇飲料。

122分組及給藥方法將60只大鼠隨機(jī)分為4組,每組15只，第1組對照組,飼喂正常飲食;第2組模型組,按上述造模方法給予飲食;第3組柴胡疏肝散治療組,于造模3w開始,給予柴胡疏肝散煎劑灌胃,每日28g/kg;第4組秋水仙堿組，于造模3w開始給予秋水仙堿01mg/-1，共8w。

123標(biāo)本制作上述造模及處理過程結(jié)束日，禁食12h后稱質(zhì)量，股靜脈取血，分離血清置-20℃保存;并立刻完整摘取肝臟及脾臟，稱質(zhì)量后用生理鹽水漂洗肝左葉數(shù)次，濾紙拭干后，切取02g置于冰浴中的組織勻漿器內(nèi)，加入冰生理鹽水2ml，制備成100g/L肝組織勻漿，4000r/min4℃離心，取上清液保存于-20℃。肝右葉置于40g/L中性甲醛液中常規(guī)固定后，石蠟包埋，用于制作組織芯片。

13檢測指標(biāo)

131血清及組織纖維化指標(biāo)檢測測定血清肝功能包括總膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、A/G，檢測透明質(zhì)酸，Ⅲ型前膠原，N型膠原，層黏蛋白含量:肝勻漿檢測羥脯氨酸含量，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，均按試劑盒說明書操作。

132病理檢測組織芯片分別行常規(guī)HE染色，Masson三色染色及網(wǎng)織纖維染色，光鏡下觀察，并根據(jù)王泰齡等改進(jìn)的肝纖維化半定量評分系統(tǒng)〔3〕進(jìn)行炎癥活動(dòng)度及肝纖維化程度計(jì)分。

133免疫組織化學(xué)檢查αSMA、TGFβ1采用石蠟包埋常規(guī)切片,SP法,兔抗鼠TGFβ1,多克隆抗體及鼠抗鼠αSMA單克隆抗體均以1∶100稀釋,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對照。陽性組織呈棕色，陰性組織呈藍(lán)色在全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)上，采用HPIAS2000型圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選取每張切片10個(gè)視野倍測定陽性細(xì)胞的A值與所占視野面積，取其乘積平均值為該組織切片所得值，兩項(xiàng)乘積越大表明組織中該抗原含量越高。

134RTPCR檢測大鼠GAPDH上游引物:5′CATGACCACAGTCCATGCCATC3′,下游引物：5′CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC3′全長450bp；TGFβ1上游引物：5′TGAGTGGCTGTCTTTTGACG3′，下游引物：5′ACTTCCAACCCAGGTCCTTC3′全長350bp。αSMA上游引物：5′AAGAGGAAGACAGCACAGCTC3′,下游引物：5′GATGGATGGGAAAACAGCC3′稱取50～100mg肝組織用Trizol提取總RNA，采用分光光度法測定其含量及純度，測定A260/A280值。取2μg總RNA，42℃逆轉(zhuǎn)錄90min。參數(shù)設(shè)置94℃變性,3min×1循環(huán)。94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)。最后72℃徹底延伸7min×1循環(huán)。同法擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參照。取5μlPCR產(chǎn)物15%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測灰度,TGFβ1/GAPDH比值表示TGFβ1mRNA相對水平。αSMA/GAPDH比值表示αSMAmR2NA相對水平。

14統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)SPSS1110軟件包進(jìn)行方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

21各組大鼠肝功能改變模型組ALT、AST顯著升高,ALB顯著降低；干預(yù)組ALT、AST較模型組明顯降低,ALB則顯著升高。見表1。

表1大鼠血清肝功能的變化

與模型組比較：1)P＜005，與正常組比較：2)P＜001

22各組大鼠血清纖維化檢查結(jié)果與正常組相比,模型組大鼠肝纖維化各項(xiàng)指標(biāo)明顯升高，柴胡疏肝散干預(yù)組與模型組比較，HA、LN及PCⅢ明顯降低，但未達(dá)到正常對照組的水平。肝組織HYP含量模型組與正常組相比明顯升高，柴胡疏肝散干預(yù)組與模型組比較，明顯降低。見表2。

表2各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量變化

與模型組比較：1)P＜001，與正常組比較：2)P＜001

23組織形態(tài)學(xué)改變肝臟HE染色顯示,正常大鼠可見少量膠原著色,病理模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,纖維組織增生明顯,將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán),肝細(xì)胞廣泛變性壞死,匯管區(qū)擴(kuò)大、膠原沉積。柴胡疏肝散干預(yù)組肝細(xì)胞有不同程度的變性壞死,匯管區(qū)及小葉間有少量纖維組織增生,纖維間隔細(xì)小,與模型組比較差異顯著。秋水仙堿干預(yù)組肝細(xì)胞有不同程度的變性壞死,匯管區(qū)及小葉間有少量纖維組織增生，肝細(xì)胞內(nèi)可見脂肪沉積。統(tǒng)計(jì)分析，柴胡疏肝散干預(yù)組及秋水仙堿干預(yù)組較模型組纖維化程度較輕，Masson染色膠原面積:模型組與柴胡疏肝散干預(yù)組相比分別為與%和%，柴胡疏肝散干預(yù)組較模型組為低。見表3。新晨范文網(wǎng)

表3大鼠肝纖維化的分級

與模型組比較：1)P＜005,與正常組比較：2)P＜001

24免疫組化結(jié)果正常組肝組織中幾乎不表達(dá)TGFβ1，模型組TGFβ1陽性細(xì)胞主要位于中央小葉和門靜脈周圍纖維帶及肝纖維間隔中,主要見于Kuffer細(xì)胞、類間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)及其周圍，柴胡疏肝散干預(yù)組陽性染色程度均較模型組明顯減輕。αSMA在胞漿表達(dá)，正常對照組只表達(dá)于小動(dòng)脈及小靜脈，在膽管無表達(dá)。模型組αSMA主要表達(dá)于匯管區(qū)及纖維間隔，且呈長橢圓形或梭形。實(shí)驗(yàn)表明模型組αSMA免疫組織化學(xué)染色面積明顯升高，顯著高于正常組。柴胡疏肝散治療組及秋水仙堿干預(yù)組明顯低于模型組。見表4。

表4各組大鼠肝組織TGFβ1及αSMA表達(dá)的變化

與模型組比較：1)P＜005,與正常組比較：2)P＜001

25RTPCR檢測正常肝組織幾乎不表達(dá)TGFβ1mRNA，而模型組為強(qiáng)表達(dá)，TGFβ1/GAPDH比值為084±017，遠(yuǎn)高于正常組；柴胡疏肝散干預(yù)組TGFβ1/GAPDH比值為057±014，TGFβ1mRNA表達(dá)低于模型組。αSMAmRNA模型組表達(dá)較正常組明顯增強(qiáng)，比值為097±015；柴胡疏肝散干預(yù)組比值為062±023，與模型組比較。

3討論

目前的研究認(rèn)為，肝纖維化的病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)的增生和降解失衡所致，而病理情況下細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞來源是肝星狀細(xì)胞，他的激活和增生在肝纖維化過程中起主要作用〔4，5〕。TGFβ1是HSC活化的強(qiáng)有力刺激因子和肝纖維化形成的始動(dòng)細(xì)胞因子〔6，7〕，αSMA是HSC活化的標(biāo)志〔8〕。從祖國醫(yī)學(xué)辨證認(rèn)為，肝纖維化是由于氣滯、血瘀、絡(luò)阻所致，肝纖維化初期主要為氣滯，進(jìn)而血瘀，最后絡(luò)阻，氣機(jī)不暢，肝纖維化、肝硬化形成。因而，在肝纖維化早期給予理氣治療，間以活血可有效地阻止肝纖維化的形成，柴胡疏肝散主入肝經(jīng)，方用陳皮、柴胡、川芎、香附、枳殼疏肝理氣，川芎、赤藥活血化淤，共奏理氣活血之功效，是防治肝氣淤滯的有效驗(yàn)方。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了柴胡疏肝散具有保護(hù)鼠肝功能的作用，ALT、AST較模型組明顯降低，ALB較模型組明顯升高，兩者比較差別顯著；血清中各纖維化指標(biāo)及肝組織羥脯氨酸含量柴胡疏肝散組較模型組明顯降低；柴胡疏肝散從組織學(xué)上具有減少試驗(yàn)鼠肝纖維化形成的作用，病理HE染色，Masson三色染色膠原含量較模型組明顯降低，病理分級明顯改善，兩者比較差別顯著；柴胡疏肝散能夠減少或阻抑試驗(yàn)鼠TGFβ1