柴胡疏肝散抗肝纖維化

柴胡疏肝散抗肝纖維化

【摘要】目的探討柴胡疏肝散對肝纖維化大鼠模型αSMA、TGFβ1的影響及其抗纖維化的機制。方法采用40%CCl4皮下注射，制備肝纖維化模型并以柴胡疏肝散干預(yù)，測定肝功能、血清透明質(zhì)酸、層黏連蛋白及肝組織羥脯氨酸，光鏡觀察肝組織病理變化，免疫組織化學(xué)法檢測肝組織αSMA、TGFβ1表達，RTPCR檢測TGFβ1mRNA的表達。結(jié)果柴胡疏肝散組較模型組:肝功能明顯改善，血清HA及LN顯著降低，肝組織HYP含量明顯少，肝組織纖維化程度明顯改善，肝組織αSMA及TGFβ1表達減少。結(jié)論柴胡疏肝散對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有良好的防治作用。

【關(guān)鍵詞】柴胡疏肝散；肝纖維化；αSMA；TGFβ1

近年來柴胡疏肝散抗肝纖維化的臨床研究取得了較好的臨床效果〔1〕，但目前國內(nèi)外尚無柴胡疏肝散抗肝纖維化的基礎(chǔ)研究。本實驗采用四氯化碳大鼠肝纖維化模型,觀察柴胡疏肝散的抗肝纖維化作用,并探討其對α平滑肌肌動蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子影響及柴胡疏肝散抗肝纖維化的理論機制。

1材料與方法

11材料

111動物及藥物雄性22月齡Wistar大鼠60只,體重300～350g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。柴胡疏肝散經(jīng)冷水浸泡藥材2h，常規(guī)兩煎,頭煎15h，二煎1h，兩次水煎液混合并過濾,經(jīng)水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥112g/ml的濃縮藥液冷藏備用。按體表面積折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效劑量為28g/kg。

112藥品及試劑CCl4購自北京北化精細化學(xué)品有限責(zé)任公司)；秋水仙堿購自昆明股份制藥有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所；血清總膽紅素試劑盒購自上?？迫A東菱診斷用品有限公司；透明質(zhì)酸、層黏連蛋白放射免疫分析測定盒購自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)中心；單克隆急用型鼠抗人生αSMA試劑盒購自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫組化試劑盒購自福州邁新試劑公司，DAB購自北京中山生物公司，RTPCR兩步法試劑盒購自TAKARA公司，Trizol購自Sangon公司。

12方法

121模型制作參照文獻〔2〕方法：實驗第1天除正?？瞻讓φ战M外,其余動物皮下注射CCl4分析純05ml/100g,以后每隔3d注射40%CCl4橄欖油劑03ml/100g,連續(xù)8w。實驗前2w飼喂高脂玉米粉飼料，第3～6周飼喂100%玉米粉和30%乙醇飲料。

122分組及給藥方法將60只大鼠隨機分為4組,每組15只，第1組對照組,飼喂正常飲食;第2組模型組,按上述造模方法給予飲食;第3組柴胡疏肝散治療組,于造模3w開始,給予柴胡疏肝散煎劑灌胃,每日28g/kg;第4組秋水仙堿組，于造模3w開始給予秋水仙堿01mg/-1，共8w。

123標本制作上述造模及處理過程結(jié)束日，禁食12h后稱質(zhì)量，股靜脈取血，分離血清置-20℃保存;并立刻完整摘取肝臟及脾臟，稱質(zhì)量后用生理鹽水漂洗肝左葉數(shù)次，濾紙拭干后，切取02g置于冰浴中的組織勻漿器內(nèi)，加入冰生理鹽水2ml，制備成100g/L肝組織勻漿，4000r/min4℃離心，取上清液保存于-20℃。肝右葉置于40g/L中性甲醛液中常規(guī)固定后，石蠟包埋，用于制作組織芯片。

13檢測指標

131血清及組織纖維化指標檢測測定血清肝功能包括總膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、A/G，檢測透明質(zhì)酸，Ⅲ型前膠原，N型膠原，層黏蛋白含量:肝勻漿檢測羥脯氨酸含量，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，均按試劑盒說明書操作。

132病理檢測組織芯片分別行常規(guī)HE染色，Masson三色染色及網(wǎng)織纖維染色，光鏡下觀察，并根據(jù)王泰齡等改進的肝纖維化半定量評分系統(tǒng)〔3〕進行炎癥活動度及肝纖維化程度計分。

133免疫組織化學(xué)檢查αSMA、TGFβ1采用石蠟包埋常規(guī)切片,SP法,兔抗鼠TGFβ1,多克隆抗體及鼠抗鼠αSMA單克隆抗體均以1∶100稀釋,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對照。陽性組織呈棕色，陰性組織呈藍色在全自動圖像分析系統(tǒng)上，采用HPIAS2000型圖像分析軟件進行定量分析，隨機選取每張切片10個視野倍測定陽性細胞的A值與所占視野面積，取其乘積平均值為該組織切片所得值，兩項乘積越大表明組織中該抗原含量越高。

134RTPCR檢測大鼠GAPDH上游引物:5′CATGACCACAGTCCATGCCATC3′,下游引物：5′CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC3′全長450bp；TGFβ1上游引物：5′TGAGTGGCTGTCTTTTGACG3′，下游引物：5′ACTTCCAACCCAGGTCCTTC3′全長350bp。αSMA上游引物：5′AAGAGGAAGACAGCACAGCTC3′,下游引物：5′GATGGATGGGAAAACAGCC3′稱取50～100mg肝組織用Trizol提取總RNA，采用分光光度法測定其含量及純度，測定A260/A280值。取2μg總RNA，42℃逆轉(zhuǎn)錄90min。參數(shù)設(shè)置94℃變性,3min×1循環(huán)。94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)。最后72℃徹底延伸7min×1循環(huán)。同法擴增GAPDH作為內(nèi)參照。取5μlPCR產(chǎn)物15%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測灰度,TGFβ1/GAPDH比值表示TGFβ1mRNA相對水平。αSMA/GAPDH比值表示αSMAmR2NA相對水平。

14統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果計量數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)SPSS1110軟件包進行方差分析，組間比較采用t檢驗。

2結(jié)果

21各組大鼠肝功能改變模型組ALT、AST顯著升高,ALB顯著降低；干預(yù)組ALT、AST較模型組明顯降低,ALB則顯著升高。見表1。

表1大鼠血清肝功能的變化

與模型組比較：1)P＜005，與正常組比較：2)P＜001

22各組大鼠血清纖維化檢查結(jié)果與正常組相比,模型組大鼠肝纖維化各項指標明顯升高，柴胡疏肝散干預(yù)組與模型組比較，HA、LN及PCⅢ明顯降低，但未達到正常對照組的水平。肝組織HYP含量模型組與正常組相比明顯升高，柴胡疏肝散干預(yù)組與模型組比較，明顯降低。見表2。

表2各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量變化

與模型組比較：1)P＜001，與正常組比較：2)P＜001

23組織形態(tài)學(xué)改變肝臟HE染色顯示,正常大鼠可見少量膠原著色,病理模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,纖維組織增生明顯,將肝小葉分隔成大小不等的肝細胞團,肝細胞廣泛變性壞死,匯管區(qū)擴大、膠原沉積。柴胡疏肝散干預(yù)組肝細胞有不同程度的變性壞死,匯管區(qū)及小葉間有少量纖維組織增生,纖維間隔細小,與模型組比較差異顯著。秋水仙堿干預(yù)組肝細胞有不同程度的變性壞死,匯管區(qū)及小葉間有少量纖維組織增生，肝細胞內(nèi)可見脂肪沉積。統(tǒng)計分析，柴胡疏肝散干預(yù)組及秋水仙堿干預(yù)組較模型組纖維化程度較輕，Masson染色膠原面積:模型組與柴胡疏肝散干預(yù)組相比分別為與%和%，柴胡疏肝散干預(yù)組較模型組為低。見表3。新晨范文網(wǎng)

表3大鼠肝纖維化的分級

與模型組比較：1)P＜005,與正常組比較：2)P＜001

24免疫組化結(jié)果正常組肝組織中幾乎不表達TGFβ1，模型組TGFβ1陽性細胞主要位于中央小葉和門靜脈周圍纖維帶及肝纖維間隔中,主要見于Kuffer細胞、類間質(zhì)細胞質(zhì)及其周圍，柴胡疏肝散干預(yù)組陽性染色程度均較模型組明顯減輕。αSMA在胞漿表達，正常對照組只表達于小動脈及小靜脈，在膽管無表達。模型組αSMA主要表達于匯管區(qū)及纖維間隔，且呈長橢圓形或梭形。實驗表明模型組αSMA免疫組織化學(xué)染色面積明顯升高，顯著高于正常組。柴胡疏肝散治療組及秋水仙堿干預(yù)組明顯低于模型組。見表4。

表4各組大鼠肝組織TGFβ1及αSMA表達的變化

與模型組比較：1)P＜005,與正常組比較：2)P＜001

25RTPCR檢測正常肝組織幾乎不表達TGFβ1mRNA，而模型組為強表達，TGFβ1/GAPDH比值為084±017，遠高于正常組；柴胡疏肝散干預(yù)組TGFβ1/GAPDH比值為057±014，TGFβ1mRNA表達低于模型組。αSMAmRNA模型組表達較正常組明顯增強，比值為097±015；柴胡疏肝散干預(yù)組比值為062±023，與模型組比較。

3討論

目前的研究認為，肝纖維化的病理改變是細胞外基質(zhì)的增生和降解失衡所致，而病理情況下細胞外基質(zhì)的主要細胞來源是肝星狀細胞，他的激活和增生在肝纖維化過程中起主要作用〔4，5〕。TGFβ1是HSC活化的強有力刺激因子和肝纖維化形成的始動細胞因子〔6，7〕，αSMA是HSC活化的標志〔8〕。從祖國醫(yī)學(xué)辨證認為，肝纖維化是由于氣滯、血瘀、絡(luò)阻所致，肝纖維化初期主要為氣滯，進而血瘀，最后絡(luò)阻，氣機不暢，肝纖維化、肝硬化形成。因而，在肝纖維化早期給予理氣治療，間以活血可有效地阻止肝纖維化的形成，柴胡疏肝散主入肝經(jīng)，方用陳皮、柴胡、川芎、香附、枳殼疏肝理氣，川芎、赤藥活血化淤，共奏理氣活血之功效，是防治肝氣淤滯的有效驗方。本實驗證實了柴胡疏肝散具有保護鼠肝功能的作用，ALT、AST較模型組明顯降低，ALB較模型組明顯升高，兩者比較差別顯著；血清中各纖維化指標及肝組織羥脯氨酸含量柴胡疏肝散組較模型組明顯降低；柴胡疏肝散從組織學(xué)上具有減少試驗鼠肝纖維化形成的作用，病理HE染色，Masson三色染色膠原含量較模型組明顯降低，病理分級明顯改善，兩者比較差別顯著；柴胡疏肝散能夠減少或阻抑試驗鼠TGFβ1