培養(yǎng)基制備 配制培養(yǎng)基（植物組織培養(yǎng)）

任務(wù)6培養(yǎng)基配制【知識(shí)點(diǎn)】MS培養(yǎng)基的調(diào)制與分裝技術(shù)培養(yǎng)基的消毒滅菌與保存方法【技能點(diǎn)】能根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)目的配制不同的培養(yǎng)基及選擇不同的激素水平素質(zhì)要求：培養(yǎng)學(xué)生任務(wù)執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；具有科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)事求是的工作態(tài)度；具有團(tuán)隊(duì)合作交流意識(shí)和生態(tài)環(huán)保意識(shí)。一、培養(yǎng)基的類(lèi)型與特點(diǎn)

1.培養(yǎng)基的種類(lèi)根據(jù)態(tài)相不同，培養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其區(qū)別在于培養(yǎng)基中是否添加了凝固劑。

根據(jù)營(yíng)養(yǎng)水平不同，分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基就是MS、White培養(yǎng)基。

完全培養(yǎng)基由基本培養(yǎng)基添加適宜的激素和有機(jī)附加物組成。

2.培養(yǎng)基的特點(diǎn)根據(jù)培養(yǎng)基的成分不同，有MS、B5、White、H、Nitsch、Miller、N6、SH、LS（詳見(jiàn)教材）等培養(yǎng)基。1）MS培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽類(lèi)離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其中鉀鹽、銨鹽和硝酸鹽含量較高。廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞核原生質(zhì)體培養(yǎng)。2）White培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽類(lèi)濃度較低的培養(yǎng)基。特別適合于生根培養(yǎng)和幼根胚培養(yǎng)。3）N6培養(yǎng)基1974年由我國(guó)學(xué)者朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，特點(diǎn)是KNO3和(NH4)2SO4含量較高，不含鉬。4）B5培養(yǎng)基含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。在豆科植物中用得較多，也適用于木本植物。5）SH培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度較高的培養(yǎng)基。在單子葉和雙子葉植物上使用效果很好。二、培養(yǎng)基的制備1.培養(yǎng)基的配制與分裝固體培養(yǎng)基的配制步驟如下：稱(chēng)取蔗糖、瓊脂→在鍋內(nèi)加熱溶解蔗糖和瓊脂計(jì)算→攪勻后調(diào)pH移取各母液至量筒內(nèi)→將量筒內(nèi)母液倒入鍋內(nèi)↓

↓清理←標(biāo)識(shí)、記錄←封口←分裝達(dá)到規(guī)定的量1）蔗糖、瓊脂的稱(chēng)取量例：求3%蔗糖和0.5%瓊脂的稱(chēng)取量？“3%和0.5%”的含義：表示在1L培養(yǎng)基中蔗糖的含量占3%，瓊脂的含量占0.5%。蔗糖=1L×3%=1000ml×0.03=30g瓊脂=1L×0.5%=1000ml×0.005=5g2）求母液的吸取量

所需培養(yǎng)基體積（ml）母液吸取量（ml）=

該母液的擴(kuò)大倍數(shù)例：配制1L培養(yǎng)基，需GaCl2·2H2O的10倍母液中吸取多少毫升？母液吸取量（ml）==100ml

3）激素母液激素吸取量=（配方濃度/母液濃度）×培養(yǎng)基體積例：若配方激素NAA濃度為1mg/L，激素母液為0.1mg/mlNAA，求配制1L培養(yǎng)基需要激素母液吸取量？吸取量=（配方濃度/母液濃度）×培養(yǎng)基體積=（1mg/L/0.1mg/ml）×1L=10ml4）移液管的使用

培養(yǎng)基配制操作步驟（以1L為例）1）分配水量：500ml蒸餾水定容母液，500ml蒸餾水溶解糖與瓊脂。2）移取母液與溶解糖和瓊脂（1）用對(duì)應(yīng)的移液管分別量取母液，移至500ml的量筒內(nèi)，最后加蒸餾水定容到500ml刻度線；（2）用天平分別稱(chēng)取蔗糖和瓊脂，將蔗糖直接倒入鍋內(nèi)，加500ml蒸餾水加熱溶解，將瓊脂趁熱倒入鍋內(nèi)，用玻璃棒攪拌直至完全溶解為止。后關(guān)閉電爐。3）將混合的母液倒入鍋內(nèi)與糖和瓊脂混合均勻，測(cè)定培養(yǎng)基的pH值為6左右，過(guò)酸用1NNaOH和過(guò)堿用1NHCL調(diào)整。4）分裝：每培養(yǎng)瓶50ml左右（一般占培養(yǎng)瓶1/3左右）。5）標(biāo)記與清理：

（1）標(biāo)明培養(yǎng)基代號(hào)、操作人與時(shí)間、瓶數(shù)即可滅菌。（2）用具清理和洗滌：各種母液按原位置擺整齊，用過(guò)的量筒、移液管、燒杯、鋁鍋等用水洗滌干凈，然后按次序放回原處。6）滅菌。注意事項(xiàng)：1）操作前須檢查儀器和材料。2）稱(chēng)量操作與移液管使用規(guī)范、熟練、準(zhǔn)確，要穩(wěn)。3）定容操作要規(guī)范、迅速；液面凹液面與刻度線相切。4）分裝時(shí)要趁熱，速度要快要穩(wěn)，培養(yǎng)基不能濺在瓶口或接近瓶口內(nèi)壁。5）封口不能太緊，標(biāo)簽內(nèi)容要清楚。6）用電注意安全防范工作。2.培養(yǎng)基的消毒滅菌培養(yǎng)基滅菌的意義：培養(yǎng)基在制備過(guò)程中常帶有雜菌，培養(yǎng)基配置完畢和分裝后在24h內(nèi)完成。培養(yǎng)基常用滅菌方法：1）高壓蒸汽滅菌：適用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。2）過(guò)濾滅菌：用于液體培養(yǎng)基或液體添加物。高壓蒸汽滅菌：裝入了培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器裝在鐵絲籃里，外面包上一層鋁箔以防止棉塞在高壓滅菌時(shí)吸濕，在121℃（1.06kg/cm2）下滅菌15min。注意：滅菌時(shí)間取決于溫度，而不是壓力。滅菌時(shí)間與滅菌體積有關(guān)培養(yǎng)基蒸汽滅菌所需的最短時(shí)間容器的體積(ml)121℃滅菌所需最少時(shí)間（min）20-501575-15020250-50025100030150035200040使用方法：①檢查儀器儀表（壓力表為0）②檢查滅菌鍋安全水位。若水位不足往外鍋加水至安全水位。③關(guān)閉上排氣閥，在內(nèi)鍋內(nèi)放入待滅菌物品，蓋上鍋蓋，打開(kāi)放氣閥，對(duì)角擰緊鍋蓋螺帽后關(guān)閉放氣閥。LS系列立式壓力蒸汽滅菌器

④接通電源打開(kāi)開(kāi)關(guān)，設(shè)置滅菌溫度和滅菌時(shí)間分別為121℃,20min。待壓力上升至0.05MPa時(shí)緩慢打開(kāi)上排氣閥，將冷空氣排盡為0時(shí)，關(guān)閉排氣閥。⑤繼續(xù)加熱待溫度上升至121℃、0.1MPa時(shí)間維持20min后關(guān)閉電源，打開(kāi)上排氣閥，待壓力表為0MPa后，打開(kāi)放氣閥，依次打開(kāi)鍋蓋，取出物品水平放置。在使用高壓滅菌鍋時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）高壓鍋內(nèi)冷氣必排盡；（2）降壓力過(guò)高或過(guò)低；（3）在保持壓力恒定，嚴(yán)守滅菌時(shí)間；（4）培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基不要過(guò)多，不超過(guò)培養(yǎng)容器體積的70%；（5）壓力表指針降到零后才可開(kāi)啟壓力鍋。2）過(guò)濾滅菌液的添加過(guò)濾滅菌后的固體培養(yǎng)基制備：先將培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，然后置于超凈工作臺(tái)上冷卻至40℃左右。瓊脂將要凝固之前，加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的各項(xiàng)不耐熱成分的溶液，混勻放置，待冷涼凝固后備用。注意：不能在培養(yǎng)基溫度較高時(shí)加入，防不耐熱物質(zhì)分解。3.培養(yǎng)基保存

對(duì)暫時(shí)不用的培養(yǎng)基最好置于10℃下保存，含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基在4-5℃低溫下保存則更理想。含IAA或GA3的培養(yǎng)基應(yīng)在1周內(nèi)完成，盡量避免光線的照射，其他普遍存放時(shí)間最多不要超過(guò)1個(gè)月。

貯存室要保持無(wú)菌干燥，以免造成培養(yǎng)基的二次污染。

4.制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基(1)制作斜面培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放!支長(zhǎng)0.~1米左右的木條,厚度為1厘米左右。將試管頭部枕在木條上,使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜,凝固后即成斜面培養(yǎng)基。4.制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基(2)制作平板培養(yǎng)基。將滅過(guò)菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,點(diǎn)燃酒精燈,右手托起形瓶瓶底,左手技下棉塞,將瓶口在酒精燈上稍加灼燒。。左手打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋,右手迅速將