基因工程的工具及操作程序

（優(yōu)選）基因工程的工具及操作程序當前第1頁\共有69頁\編于星期三\2點基因工程當前第2頁\共有69頁\編于星期三\2點基因工程當前第3頁\共有69頁\編于星期三\2點基因工程當前第4頁\共有69頁\編于星期三\2點補：原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結合位點，并與其結合。轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。當前第5頁\共有69頁\編于星期三\2點①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結構②有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結合位點。啟動子當前第6頁\共有69頁\編于星期三\2點補：真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內(nèi)含子

外顯子

能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子

不能夠編碼蛋白質的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：當前第7頁\共有69頁\編于星期三\2點原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼當前第8頁\共有69頁\編于星期三\2點什么叫基因工程？基因工程又叫基因拼接技術或DNA重組技術。該技術是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。（一）基因工程的概念當前第9頁\共有69頁\編于星期三\2點基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程實質結果基因拼接技術或DNA重組技術生物體外基因（DNA）分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導入→表達基因重組當前第10頁\共有69頁\編于星期三\2點基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因與運載體DNA拼接導入棉花細胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關鍵步驟是什么？當前第11頁\共有69頁\編于星期三\2點基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟：關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關鍵步驟二：抗蟲基因與運載體DNA連接關鍵步驟三：抗蟲基因導入受體(棉花)細胞當前第12頁\共有69頁\編于星期三\2點解決培育抗蟲棉的關鍵步驟需要哪些工具？關鍵步驟一的工具：關鍵步驟二的工具：關鍵步驟三的工具：基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶基因的針線——DNA連接酶基因的運載工具——運載體當前第13頁\共有69頁\編于星期三\2點1.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術刀”限制酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶。（原核細胞內(nèi)的限制修飾系統(tǒng)）特點：特異性。即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子。（二）DNA重組技術的基本工具當前第14頁\共有69頁\編于星期三\2點當前第15頁\共有69頁\編于星期三\2點大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制酶當前第16頁\共有69頁\編于星期三\2點限制酶當前第17頁\共有69頁\編于星期三\2點什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。當前第18頁\共有69頁\編于星期三\2點當前第19頁\共有69頁\編于星期三\2點要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。當前第20頁\共有69頁\編于星期三\2點2.DNA連接酶——“分子縫合針”

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。當前第21頁\共有69頁\編于星期三\2點當前第22頁\共有69頁\編于星期三\2點外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導入受體細胞(如棉花細胞)？導入過程需要運輸工具——運載體。運載體的作用有哪些？作用一：作為運載工具，將外源基因(抗蟲基因)轉移到受體細胞(棉花細胞)中去。作用二：利用運載體在受體細胞(棉花細胞)內(nèi)，對外源基因(抗蟲基因)進行大量復制。當前第23頁\共有69頁\編于星期三\2點作為運載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存。2）載體DNA必須有一個或多個限制酶切點，以便目的基因插入到載體上去。3）具有某些標記基因，便于進行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應的基因等。載體DNA必須是安全的,不會對受體細胞有害,或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去;當前第24頁\共有69頁\編于星期三\2點3.基因進入受體細胞的運載——”分子運輸車”常用的運載體主要有兩類：1）細菌細胞質的質粒2）噬菌體或某些動植物病毒當前第25頁\共有69頁\編于星期三\2點質粒：質粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中核區(qū)外的DNA分子?，F(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子。

質粒是基因工程最常用的運載體。絕大多數(shù)細菌質粒都是閉合環(huán)狀DNA分子。有的一個細菌中有一個，有的一個細菌中有多個。當前第26頁\共有69頁\編于星期三\2點大腸桿菌的質粒：

最常用的質粒是大腸桿菌的質粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素的標記基因。質粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性作用，但復制只能在宿主細胞內(nèi)成。當前第27頁\共有69頁\編于星期三\2點基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞（并篩選）4、目的基因的檢測與鑒定當前第28頁\共有69頁\編于星期三\2點當前第29頁\共有69頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質的結構基因請舉出三個以上的例子2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）鳥槍法（2）反轉錄法（3）化學合成法當前第30頁\共有69頁\編于星期三\2點(一)從基因文庫中獲取目的基因將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）1.基因文庫當前第31頁\共有69頁\編于星期三\2點基因組文庫與部分基因文庫的關系怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?當前第32頁\共有69頁\編于星期三\2點2.基因文庫的構建方法①鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與載體連接載入受體細胞產(chǎn)生特定性狀導入外源DNA擴增目的基因分離(直接分離法)(一)從基因文庫中獲取目的基因當前第33頁\共有69頁\編于星期三\2點②反轉錄法：

以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉錄酶核酸酶H2.基因文庫的構建方法DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)當前第34頁\共有69頁\編于星期三\2點③根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成2.基因文庫的構建方法當前第35頁\共有69頁\編于星期三\2點上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因專一性強操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因當前第36頁\共有69頁\編于星期三\2點(二)利用PCR技術擴增目的基因當前第37頁\共有69頁\編于星期三\2點①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術③條件：_______________________、_______________、___________(做啟動子)、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(二)利用PCR技術擴增目的基因當前第38頁\共有69頁\編于星期三\2點⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈當前第39頁\共有69頁\編于星期三\2點當前第40頁\共有69頁\編于星期三\2點1.用一定的_________切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。(二)基因表達載體的構建——核心3.將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同當前第41頁\共有69頁\編于星期三\2點質粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）——核心同一種(二)基因表達載體的構建4.過程:當前第42頁\共有69頁\編于星期三\2點5.基因表達載體的組成：復制原點+啟動子+目的基因+終止子+標記基因它們有什么作用？當前第43頁\共有69頁\編于星期三\2點(三)將目的基因導入受體細胞轉化——方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞法將含有目的基因的重組載體與相應的受體細胞放在一起培養(yǎng)，通過一定的方式進行誘導，進入受體細胞的過程。受體細胞的選擇？當前第44頁\共有69頁\編于星期三\2點1、將目的基因導入植物細胞的方法：農(nóng)桿菌轉化法（1）農(nóng)桿菌介紹（2）原理及適用范圍(三)將目的基因導入受體細胞當前第45頁\共有69頁\編于星期三\2點2、將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射法（2）程序：(三)將目的基因導入受體細胞當前第46頁\共有69頁\編于星期三\2點將目的基因導入動物細胞當前第47頁\共有69頁\編于星期三\2點(三)將目的基因導入受體細胞3、將目的基因導入微生物細胞（1）思考：為什么選用微生物作為受體細胞？（2）方法：當前第48頁\共有69頁\編于星期三\2點3.將目的基因導入微生物細胞

大腸桿菌細胞最常用的轉化方法是:首先用Ca2+處理細胞,以增大細菌細胞壁的通透性,使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細胞稱為感受態(tài)細胞.第二步是將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子,完成轉化過程.第三步目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。當前第49頁\共有69頁\編于星期三\2點1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。3）目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。當前第50頁\共有69頁\編于星期三\2點(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定——①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交（DNA--DNA）分子雜交（mRNA--cDNA）（注意與上不同之處）抗原--抗體雜交當前第51頁\共有69頁\編于星期三\2點DNA分子雜交示意圖采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。當前第52頁\共有69頁\編于星期三\2點基因探針：是一段帶有放射性同位素或熒光標記，含有目的基因的DNA單鏈。使探針與轉基因生物的基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中。當前第53頁\共有69頁\編于星期三\2點1.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術刀”一，基因工程的基本工具2.NDA連接酶——“分子縫合針”3.運載體——“分子運輸車”知識梳理：當前第54頁\共有69頁\編于星期三\2點二，基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞（并篩選）4、目的基因的檢測與鑒定當前第55頁\共有69頁\編于星期三\2點（一）目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質的結構基因請舉出三個以上的例子2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）鳥槍法（2）反轉錄法（3）化學合成法當前第56頁\共有69頁\編于星期三\2點上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因專一性強操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因當前第57頁\共有69頁\編于星期三\2點1.用一定的_________切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。(二)基因表達載體的構建——核心3.將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同當前第58頁\共有69頁\編于星期三\2點質粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）——核心同一種(二)基因表達載體的構建4.過程:當前第59頁\共有69頁\編于星期三\2點基因表達載體的組成：復制原點+啟動子+目的基因+終止子+標記基因它們有什么作用？當前第60頁\共有69頁\編于星期三\2點(三)將目的基因導入受體細胞轉化——方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞法將含有目的基因的重組載體與相應的受體細胞放在一起培養(yǎng)，通過一定的方式進行誘導，進入受體細胞的過程。受體細胞的選擇？篩選——利用選擇培養(yǎng)基進行篩選（標記基因）當前第61頁\共有69頁\編于星期三\2點(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定——①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交（DNA--DNA）分子雜交（RNA--cDNA）（注意與上不同之處）抗原--抗體雜交當前第62頁\共有69頁\編于星期三\2點基因工程的理論基礎：思考？所有生物的DNA都由相同的四種脫氧核苷酸組成所有的生物共用一套遺傳密碼